JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Abstract

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Introduction

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2.

Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.

As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל בעלי החיים טופלו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות הנחיות. ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש באוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם אישרה שימוש בבעלי חיים.

1. קבלת רנ"א ודנ"א ממועשרת astrocytic אוכלוסייה באמצעות Cell הופעל פלורסנט מיון (FACS) של האסטרוציטים מרקמות המוח כולו

  1. בעלי חיים שקט ורגוע עם CO 2 דקות 1 ולאחר מכן במהירות לערוף. לנתח הקורטקס כמתואר באל אלבוקרקי et, 26.; אין צורך להסיר את קרומי המוח.
    הערה: חולדות מהונדסות מבטא eGFP תחת S100β (סמן astrocyte) אמרגן נוצרו על ידי Itakura et al 27 ומנוצלות למיון FACS של האסטרוציטים..
  2. הכן homogenate המוח כולו באמצעות ערכת ניתוק פפאין בתנאים שאינם סטרילי על פי הפרוטוקול של היצרן. חום להפעיל פפאין על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות. הערה:פתרון פפאין מסופק על ידי יצרן ומכיל L-ציסטאין וEDTA (ראה טבלה של חומרים).
    1. לחתוך או DREMEL חור בחלק העליון של צינור חרוטי 50 מיליליטר כדי לאפשר צינורות ביצוע 95% O 2: 5% CO 2 להיות מוזנים לתוך צינור חרוטי סגור (איור 1 א). הנח הקורטקס גזור בצלחת תרבות 10mm המכיל תקשורת דיסוציאציה (ממ בתוספת גלוקוז 20mm ופניצילין / סטרפטומיצין (500 U / ml) וequilibrated לO 95% 2: 5% CO 2) ולהשתמש בסכין גילוח נקי לברר ברקמה לתוך 1 x 1 מ"מ 2 חתיכות.
  3. רקמת העברה באמצעות 10 מיליליטר pipetman הידני לצינור חרוטי 50 מיליליטר מכיל פתרון פפאין. לאפשר לרקמות להתיישב לתחתית פיפטה העברה לפני הפריקה כדי למזער את הכמות של תקשורת ניתוק בוצעה על. שמור פתרון פפאין equilibrated עד 95% O 2: 5% CO 2 באמצעות חילוף גזי משטח למשך הדגירה. האם לא soluti פפאין בועהעל. דגירה רקמה למשך 20 דקות ב -37 ° C אמבט מים.
  4. הדגירה הבאה בפתרון פפאין, רקמת triturate 10 פעמים עם פיפטה 10 מיליליטר העברה במהירות איטית. השעיה תא מעונן צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT.
    1. לאזן פתרון DNase / אלבומין מעכב (המסופק על ידי יצרן) באמצעות חילוף גזי משטח מחדש להשעות תאי טבליות ב 3 מיליליטר של פתרון / מעכב אלבומין DNase. הכן שיפוע צפיפות רציפה מסחרי בהתאם להוראות יצרן.
  5. ספין שיפוע צפיפות רציף XG ב 1000 במשך 6 דקות. בודד תאים ניתק מהחלק התחתון של צינור על ידי מציצת גלולה תחתונה בעזרת פיפטה.
  6. להשעות מחדש תאים ניתק ב2-3 מיליליטר של DPBS עם 0.02% אלבומין בסרום שור ו1 מ"ג / מיליליטר DNase או HEPES העדיף שנאגרו תקשורת והתרבות. עובר דרך 40 מיקרומטר סינון לפני FACS (איור 2 א). שמור את התאים על קרח עד מיון.
    1. בצע FACS 28.
    2. תאים גלולה ב 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: יכולים להיות מנוצלים האסטרוציטים pelleted מייד או נשמרו ב-80 ° C עד מיצוי DNA.
  7. לחלץ RNA ו- DNA בשיטת בידוד מועדף 29 30. להעריך RNA וריכוז ה- DNA ואיכות באמצעות ספקטרופוטומטר וbioanalyzer 31.
    הערה: לנצל רק RNA באיכות גבוהה וDNA בשלבים הבאים, 260/280 = 2.0-2.2 ו1.8-1.9, בהתאמה. ניתוח bioanalyzer הוא חיוני כדי להעריך לשפלת RNA או פיצול ה- DNA. RNA או DNA יכול להיות מנוצל באופן מיידי או מאוחסן ב-80 ° C או -20 ° C, בהתאמה ללימודים שלאחר מכן.

2. הערכת מצב DNA מתילציה של גן באמצעות מתילציה רגישה רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח (MS-HRMA)

  1. הזן את רצף גן של עניין לתוכנת מיפוי מתילציה המקוון העדיפה לזהות כל איי CPG בגןעניין 32.
    1. פריימרים עיצוב נגד bisulfite המירו רצף ה- DNA 33 ולהגביר באמצעות DNA פולימרז המועדף על פי הפרוטוקול של היצרן. ודא גודל מוצר מוגבר על ידי פועל 1% ג'ל DNA agarose ב 100 V 45 דקות. פריימרים חנות בריכוז מניות של 20 מיקרומטר ב-20 ° C.
  2. ביסולפיט להמיר 500-1,000 ng של DNA של כל דגימת DNA והמפוגל סטנדרטים החל 0-100% מאותו המין של בעלי החיים 34. דגימות Elute לספק ריכוז של 20 ng / μl. ודא ריכוז של ה- DNA המרה bisulfite באמצעות ספקטרופוטומטר 31.
  3. 20 תגובות μl התקנה להגברת MS-HRM באמצעות DNA פולימרז מועדף ופריימרים בריכוז 5 מיקרומטר לפי טבלת 1 ו -2. הפעילו את כל הדגימות, לרבות תקני ה- DNA ומפוגלים FACS, בשלושה עותקים.
  4. בהתאם לתוכנת ניתוח, שנקבע לפני ואחרי להתחיל ולהפסיק פרמטריםסביב המעברים של עקום להמיס. התחלה שנקבע מראש להמיס ופרמטרי תחנה מראש להמיס כל כך ההבדל בין השניים הוא 0.2-0.5 מעלות צלזיוס. הגדר תחילת פוסט-להמיס ופוסט-להמיס להפסיק באופן דומה. לחלץ נתונים הבדל טמפרטורת שיא עבור כל דגימה.
  5. שימוש בתקני אחוזים מפוגלים (y-ערך) והבדלים ביניהם המקבילים ממוצע טמפרטורת שיא (x-ערך) ליצור משוואת רגרסיה ליניארית (איור 3 א-B, שולחן 3-4). השתמש במשוואת רגרסיה ליניארית זה להעריך מצב מתילציה של דגימות ידועות 35.

3. הערכת פעילות יזם מפוגל-Hyper באמצעות השימוש בAssay בלוציפראז

  1. לזהות איי CPG של גן המטרה (שלב 2.1). PCR להגביר אזורים של עניין 36 וכפיל במעלה הזרם של גן הכתב בלוציפראז luc2 Firefly לייצר פלסמידים CPG-אי-luc2 37.
  2. Linearize 30 מיקרוגרם של פלסמיד CPG-אי-luc2 באמצעות הגבלהעיכול אנזים 38. ודאו אתרים להגבלה לעכל ולהימנע מקיצוצים כפולים באמצעות תוכנה חותך מועדף 38. חום להשבית אנזימים בטמפרטורה מתאימה ומשך הבא עיכול על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסד מינימאלי של DNA מתרחש במהלך שלב linearization.
  3. פלסמידים Methylate לינארית באמצעות O methylase CPG (M.Sssl) / N על 30 מעלות צלזיוס או להשאיר פרוטוקול היצרן הבא שלא טופל למעט ההתאמות הבאות.
  4. בצע 50 תגובות μl.
  5. השתמש 5 יחידות של methylase CPG לmethylate 700 ננוגרם של פלסמיד לינארית.
  6. הפעל תגובות O / N ל13-19 שעות.
  7. בעקבות תגובת methylase CPG, לבצע ניקוי DNA באמצעות סטנדרטי, מסחרי קרום סיליקה ג'ל זמין לנקות ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסדים משמעותיים של ה- DNA להתרחש בעקבות תגובת methylase CPG, 30-60% הפסד.
  8. ודא מתילציה של פלסמידים באמצעות הגבלת HPA השני לעכל.
  9. קח 1 מיקרוגרם של ה- DNA מפוגל או שאינו מפוגל והגבלה לעכל עם HPA השני עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. השתמש 5-10 יחידות של HPA השני עבור כל ה- DNA מיקרוגרם. בעקבות עיכול HPA השני, לבצע ניקוי DNA באמצעות ערכה לנקות מועדפת, קרום סיליקה ג'ל זמין מסחרי. להפעיל את שני פלסמידים מפוגלים ואינם מפוגלים CPG על 1% ג'ל DNA agarose במאגר טה או TBE ב 100 V 45 דקות להדמיה (איור 4).
  10. פלסמידים נושא שני מפוגלים ו- מפוגלים שאינו לעיכול כפול עם אנזימי הגבלה מתאימים לשחרר באורך מלא לוק 2 (וקטור) ואי CPG (להוסיף) שברי 38. בצע O הכפול העיכול / N בטמפרטורה מתאימה ואנזימי חום להשבית הבא עיכול על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסד מינימאלי של ריכוז ה- DNA מתרחש במהלך הגבלה כפולה לעכל.
  11. הפעל פלסמידים כפולים מתעכלים על 1% ג'ל agarose DNA ב 100 V עבור שעה 1 כדי לאפשר הפרדה oוקטור f והכנס (איור 4C). זהירות. לובש מגן מגן פנים UV, למקם ג'ל DNA באור שחור שולחן לדמיין להקות. בהתבסס על גודל, הוספה מפוגל ואינו מפוגל בלו ווקטור שאינו מפוגל באמצעות להב כירורגים נקי.
  12. DNA תמצית ג'ל באמצעות פנול רווי, pH 6.6. בקצרה, שוקל ג'ל DNA המכיל וקטור או להוסיף. שימוש בפנול 100 μl ל0.1 גרם של ג'ל DNA. Homogenize ג'ל DNA בפנול באמצעות homogenizer dounce הזכוכית.
  13. להוסיף כלורופורם (באמצעות 1/5 של פנול נפח) ולנער דגימות במשך 20 שניות. דגירה דגימות ב RT במשך 2-3 דקות. צנטריפוגה במשך 15 דקות במהירות מקסימלית (16.1 x 1,000 XG) על 4 מעלות צלזיוס.
  14. הסר תמיסה מימית ולהוסיף 0.1X נפח של נתרן אצטט 3 M ו2.5x נפח של אתנול. דגירה דגימות עבור שעה 1 ב -80 ° C. לאחר דגירה, להסיר אתנול מחדש להשעות DNA ב -30 μl של חיץ מועדף. אובדן משמעותי של ה- DNA מתרחש בידוד של מוסיף ווקטורים הבאים, הנה 30-50%ss.
  15. מפוגל-אי מחדש לקשור מוסיף מפוגל ואינו מפוגלים לוקטור באמצעות האנזים T4 DNA 38. להשתמש ביחס של 1: 4 של וקטור להכניס לתגובות קשירה. תגובת התקנה בהתאם להוראות יצרן. השתמש בהיקף כולל של 50 μl לתגובות דגירה O / N ב -20 ° C או על קרח עם מכסה מעל דלי קרח.
  16. בעקבות קשירה, לבצע ניקוי DNA באמצעות ערכה לנקות מועדפת, קרום סיליקה ג'ל זמין מסחרי. אובדן משמעותי של ה- DNA להתרחש בעקבות תגובת קשירה, אובדן 30-50% משוער של ה- DNA. ודא מחדש קשירה ידי הפעלה על 1% ג'ל DNA agarose ב 100 V 45 דקות ולהעריך ריכוז של פלסמידים-ligated מחדש (איור 4D).
  17. Transfect פלסמידים מפוגלים או שאינו מפוגלים לתאי D54 באמצעות מגיב transfection מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן. תאי זרע D54 לצלחת 12 גם ב0.14 x 10 6 תאים / טוב.
  18. , Wi תאי transfect הבא 24 שעותריכוזים שווים ה של שני (1) פלסמיד-methyated אינו CPG-luc2 + Renilla או וקטור לוציפראז שליטה אחר או (2) פלסמיד מפוגל CPG-luc2 + Renilla או וקטור לוציפראז שליטה אחר.
  19. לאפשר לתאי transfect למשך 24 שעות לפני ביצוע assay בלוציפראז הכפול. בצע assay לפי הוראות יצרן. לבצע קריאות באמצעות luminometer. קראו היטב כל בשלושה עותקים.
  20. חישוב יחס בין פעילות לוציפראז גחלילית לRenilla או פעילות לוציפראז שליטה אחרת. לנרמל Firefly מפוגל: פעילות לוציפראז שליטה לFirefly-מפוגל עישון: פעילות לוציפראז שליטה על ידי חלוקת פעילות לוציפראז מפוגל על ידי פעילות בלוציפראז אינה מפוגל

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אוכלוסייה מועשרת של האסטרוציטים נרכשה באמצעות מיון FACS של בעלי חיים מהונדסים eGFP-S100β 27. בשל ירידה באיכות של תאים ומולקולות מולקולריות מבודדות מבעלי חיים מבוגרים יותר לאחר הלידה היום 50 (P50), בעלי חיים בגילים P0-P40 הם אופטימליים לניסויים כאלה. רקמת קליפת המוח שימשה לנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have no disclosures.

Acknowledgements

This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
Methyl PrimerApplied Biosystemsonlinesoftware to localize CpG Islands
EZ DNA methylation KitZymo ResearchD5001
Rat Premixed Calibration StandardEpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Gel Extraction QIagen28704Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymesNew England BioLabs
NEB cutterNew England BioLabsonlineverify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Luc2 vector, pGL4.10PromegaE6651
renilla vector, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometerTurner Designs
Lipofectamine LTX and Plus ReagentLife TechnologiesA12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpectrophtometerThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0Life Technologies4397808
AB SDS software v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Getting Started Guide Life Technologiesonline
AB 7900HT Fast Real-Time SystemLife Technologies

References

  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

103DNAMS HRMAassayFACSKir4 1KCNJ10

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved