Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l&#39;expression et l&#39;activité transcriptionnelle des astrocytes<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Résumé

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Résumé

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Introduction

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression ¹. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters ^1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity ².

Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) ^4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory ⁶. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults ^7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation ¹⁰. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression ¹¹. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression ^4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.

As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS ^12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord ¹⁵. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV ^12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury ^20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

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Protocole

Tous les animaux ont été traités en conformité avec les Instituts nationaux de la santé des lignes directrices. Le soin et l'utilisation Comité animale de l'Université de l'Alabama à Birmingham a approuvé l'utilisation des animaux.

1. Obtenir l'ARN et l'ADN à partir d'une population enrichie en utilisant astrocytique cellulaire activé par fluorescence (FACS) des astrocytes Whole Brain Tissue

1. Animaux Sedate _avec le CO 2 pendant 1 min, puis décapiter rapidement. Disséquer cortex comme décrit dans Albuquerque et al, ^26.; il est pas nécessaire de retirer les méninges.
   Remarque: les rats transgéniques exprimant eGFP sous la S100β (un marqueur des astrocytes) promoteur ont été générés par Itakura et al ^{27 et} utilisés pour FACS tri des astrocytes..
2. Préparer homogénat de cerveau entier en utilisant un kit de dissociation de la papaïne dans des conditions non stériles selon le protocole du fabricant. Heat-activer la papaïne à 37 ° C au bain-marie pendant 10 min. Note:Solution de papaïne est fourni par le fabricant et qui contient la L-cystéine et de l'EDTA (voir le tableau des matériaux).
   1. Couper ou dremel un trou dans la partie supérieure d'un tube conique de 50 ml pour permettre à un tube de transport 95% O _2: 5% de CO ₂ pour être introduit dans un tube conique fermée (figure 1A). Placez cortex disséqués en 10mm boîte de culture contenant un milieu de dissociation (MEM complété avec 20 mM de glucose et de la pénicilline / streptomycine (500 U / ml) et équilibrée à 95% O _2: 5% de CO ₂₎ et d'utiliser une lame de rasoir propre pour hacher tissu dans 1 x 1 mm ^{2 pièces.}
3. Tissus de transfert en utilisant 10 ml de Pipteman manuel à 50 ml tube conique de solution contenant de la papaïne. Permettre au tissu de se déposer au fond de pipette de transfert avant de décharger de minimiser la quantité de support de dissociation reportés. Conserver la solution de papaïne équilibrée à 95% d'O _2: 5% de CO ₂ par l'intermédiaire d'un échange de gaz de la surface de la durée de l'incubation. Ne bulle papaïne solutisur. Incuber les tissus pendant 20 min dans 37 ° C bain d'eau.
4. Après incubation dans une solution de papaïne, la trituration tissu 10 fois avec une pipette 10 ml de transfert à vitesse lente. Centrifugeuse suspension cellulaire nuageux à 1000 g pendant 5 min à température ambiante.
   1. Equilibrer solution d'inhibiteur de DNase / albumine (fourni par le fabricant) par l'intermédiaire d'un échange de gaz de surface et remettre en suspension les cellules rassemblées en un culot dans 3 ml de solution d'inhibiteur / albumine de DNase. Préparer gradient de densité commerciale discontinue suivant les instructions du fabricant.
5. Spin gradient de densité discontinu à 1000 g pendant 6 min. Isoler les cellules dissociées du fond du tube en suçant culot fond à l'aide d'une pipette.
6. Re-suspendre cellules dissociées dans 3.2 ml de DPBS avec 0,02% d'albumine de sérum bovin et 1 mg / ml de DNase ou mises en mémoire tampon HEPES préférés milieux de culture. Passez à travers 40 um filtre avant FACS (figure 2A). Gardez cellules sur la glace jusqu'à ce que le tri.
   1. Effectuer FACS ^28.
   2. Cellules de culot dans 1,5 ml tubes de centrifugation à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C.
      Remarque: Les astrocytes peuvent être utilisées sous forme de culot immédiatement ou conservés à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ADN.
7. Extrait ARN et l'ADN en utilisant la méthode d'isolement préféré ^{29 30.} Évaluer l'ARN et de l'ADN et la concentration qualité via spectrophotomètre et bioanalyseur ^31.
   Remarque: Utilisez uniquement l'ARN de haute qualité et de l'ADN dans des étapes ultérieures, 260/280 = 2,0-2,2 et 1,8-1,9, respectivement. Bioanalyzer analyse est essentielle pour évaluer la dégradation des ARN ou fragmentation de l'ADN. ARN ou d'ADN peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à -80 ° C ou -20 ° C, respectivement pour des études ultérieures.

2. Évaluer méthylation de l'ADN Statut d'un gène à l'aide sensible à la méthylation haute résolution Melt analyse (MS-AGRH)

1. Entrez séquence de gène d'intérêt dans le logiciel de cartographie de méthylation en ligne préféré pour identifier les îlots CpG dans le gèned'intérêt ^32.
   1. Conception des amorces contre converties au bisulfite de l'ADN ³³ séquence et amplifient l'aide d'ADN polymerase préférée selon le protocole du fabricant. Vérifier la taille du produit amplifié par l'exécution d'un gel d'ADN agarose à 1% à 100 V pendant 45 min. Amorces de magasins à concentration stock de 20 pm à -20 ° C.
2. Bisulfite convertir 500-1000 ng d'ADN de chaque échantillon et de l'ADN méthylé normes allant de 0-100% de ces mêmes espèces animales ^34. Éluées des échantillons pour fournir une concentration de 20 ng / ul. Vérifiez la concentration de l'ADN converti au bisulfite via spectrophotomètre ^31.
3. Configuration 20 réactions pi pour l'amplification MS-GRH utilisant polymérase et des amorces d'ADN préférée à une concentration de 5 uM selon le Tableau 1 et 2. Exécuter tous les échantillons, y compris l'ADN et méthylés normes FACS, en trois exemplaires.
4. Selon le logiciel d'analyse, définissez pré- et post démarrer et arrêter les paramètresautour des transitions de la courbe de fusion. Régler le début de pré-fusion et paramètres d'arrêt pré-fusion de sorte que la différence entre les deux est de 0,2 à 0,5 ° C. Set Start post-fusion et post-fusion arrêter similaire. Extraire des données de différence de température de pointe pour chaque échantillon.
5. Utilisation de normes pour cent méthylés (valeur Y) et de leurs différences de température moyenne de crête correspondantes (x-valeur) générer une équation de régression linéaire (figure 3A-B, tableau 4.3). Utiliser cette équation de régression linéaire pour estimer l'état de méthylation des ³⁵ échantillons inconnus.

3. Evaluation Hyper-méthylé activité promotrice par utilisation de Luciferase Assay

1. Identifier les îlots CpG de gène cible (étape 2.1). Amplifier par PCR des régions d'intérêt ^{36 et} clone en amont du Firefly gène rapporteur luciférase pour produire de luc2 plasmides CpG-île-luc2 ^37.
2. Linéariser 30 ug de plasmide CpG-île-luc2 via restriction³⁸ digestion enzymatique. Vérifiez les sites de digestion de restriction et éviter les coupures doubles en utilisant le logiciel de coupe préféré ^38. Inactiver les enzymes à la chaleur à la température et la durée appropriée après digestion selon le protocole du fabricant. Une perte minimale de l'ADN se produit au cours de l'étape de linéarisation.
3. Méthylations plasmides linéarisés en utilisant CpG méthylase (M.Sssl) O / N à 30 ° C non traitée ou laisser le protocole du fabricant de suite, sauf pour les ajustements suivants.
4. Effectuer des réactions de 50 pi.
5. Utilisez 5 unités de CpG méthylase de méthyler 700 ng de plasmide linéarisé.
6. Exécutez réactions O / N pour 13-19 h.
7. Après CpG réaction de méthylase, effectuer le nettoyage à l'aide d'ADN standard, disponibles dans le commerce membrane de gel de silice nettoyer kit selon le protocole du fabricant. Des pertes importantes de l'ADN se produisent suite à CpG réaction de méthylase, 30-60% de perte.
8. Vérifiez la méthylation de plasmides via une restriction Hpa II Digest.
9. Prendre 1 ug d'ADN méthylé ou non méthylé et digestion de restriction avec Hpa II pendant 1 heure à 37 ° C. Utilisez 5-10 unités de Hpa II pour chaque pg d'ADN. Après la digestion Hpa II, effectuer le nettoyage de l'ADN en utilisant une membrane disponible dans le commerce de gel de silice nettoyer kit préféré,. Exécuter deux plasmides méthylés et non méthylés CpG sur un gel d'agarose de l'ADN de 1% dans du tampon TAE ou TBE à 100 V pendant 45 min pour la visualisation (figure 4B).
10. Plasmides Sujet fois méthylés et non méthylés à double digestion avec des enzymes de restriction appropriées pour libérer toute la longueur luc 2 (vecteur) et l'île de CpG (insert) ³⁸ fragments. Effectuez double digestion O / N à la température appropriée et enzymes de chaleur inactiver après digestion selon le protocole du fabricant. Une perte minimale de la concentration de l'ADN se produit pendant deux digestion de restriction.
11. Exécutez plasmides double digestion sur gel ADN agarose à 1% à 100 V pendant 1 heure pour permettre la séparation of vecteur et insérez (figure 4C). Attention. Le port de protection UV écran facial, placer le gel de l'ADN sur une lumière noire de table à visualiser les bandes. Basé sur la taille, l'accise insert méthylé et non méthylé et non méthylé vecteur en utilisant une lame chirurgicale propre.
12. ADN extrait sur gel en utilisant du phénol saturé, pH 6,6. Brièvement, peser gel d'ADN contenant le vecteur ou insert. Utilisez 100 pi de phénol par 0,1 gramme de gel d'ADN. Homogénéiser gel de l'ADN dans le phénol utilisant dounce de verre homogénéisateur.
13. Ajouter chloroforme (en utilisant 1/5 du volume de phénol) et agiter les échantillons pendant 20 sec. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 2-3 min. Centrifugeuse pendant 15 min à la vitesse max (16,1 x 1000 XG) à 4 ° C.
14. Retirer solution aqueuse et ajouter le volume de 0,1X de 3 M d'acétate de sodium et le volume d'éthanol 2.5X. Incuber les échantillons pendant 1 heure à -80 ° C. Après l'incubation, éliminer l'éthanol et remettre en suspension l'ADN dans 30 ul de tampon préféré. Perte significative de l'ADN se produit l'isolement suivant des inserts et des vecteurs, 30-50% loss.
15. Re-ligaturer inserts méthylés et non méthylés à vecteur non-méthylé en utilisant l'ADN ligase T4 ^38. Utiliser un rapport de 1: 4 de vecteur à insérer pour des réactions de ligature. Réaction de configuration selon les instructions du fabricant. Utiliser un volume total de 50 pi pour les réactions et incuber O / N à -20 ° C ou sur de la glace avec couvercle sur le seau à glace.
16. Après la ligature, effectuez l'ADN en utilisant une membrane nettoyage disponible dans le commerce de gel de silice nettoyer kit préféré,. Perte significative de l'ADN se produisent après la réaction de ligature, environ une perte de l'ADN de 30-50%. Vérifier re-ligature en exécutant sur ​​gel à 1% d'agarose de l'ADN à 100 V pendant 45 min et à évaluer la concentration de plasmides re-ligaturé (figure 4D).
17. Transfecter des plasmides méthylés ou non méthylés dans des cellules D54 en utilisant un réactif de transfection du commerce, selon le protocole du fabricant. Cellules D54 de semences sur la plaque de 12 puits à 0,14 x 10 ⁶ cellules / puits.
18. Après 24 h, les cellules transfecter wides concentrations égales e de soit (1) plasmide non methyated CpG luc2 + Renilla ou un autre vecteur de contrôle de la luciférase ou (2) méthylé plasmide CpG luc2 + Renilla ou un autre vecteur de contrôle de la luciférase.
19. Laisser les cellules pour la transfection pendant 24 heures avant d'effectuer des dosages de la luciférase double. Effectuer dosage selon les instructions du fabricant. Effectuer des relevés au moyen d'un luminomètre. Lire chaque puits en triple.
20. Calculer le rapport de l'activité de la luciférase de luciole de Renilla ou une autre activité de la luciférase de contrôle. Normaliser Firefly méthylé: activité de la luciférase de commande Firefly non méthylé: activité de la luciférase de contrôle en divisant l'activité de la luciférase méthylé par l'activité de la luciférase non-méthylé

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Résultats

Une population enrichie de astrocytes a été acquis par l'intermédiaire de tri FACS de eGFP-S100β animaux transgéniques ^27. En raison de la diminution de la qualité cellules et des molécules moléculaires isolées chez les animaux âgés de plus de 50 jours après la naissance (p50), les animaux âgés de P0-P40 sont optimales pour de telles expériences. Tissu cortical a été utilisé pour ces expériences. Cortex de deux à six animaux ont été mis en commun. FACS a été effectuée à l'ins...

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Discussion

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge i...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
Methyl Primer	Applied Biosystems	online	software to localize CpG Islands
EZ DNA methylation Kit	Zymo Research	D5001
Rat Premixed Calibration Standard	EpiGenDx	80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl)	Zymo Research	E2010
QIAquick Gel Extraction	QIagen	28704	Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymes	New England BioLabs
NEB cutter	New England BioLabs	online	verify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
Luc2 vector, pGL4.10	Promega	E6651
renilla vector, pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 Luminometer	Turner Designs
Lipofectamine LTX and Plus Reagent	Life Technologies	A12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9	Fisher Scientific	BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer	ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix	Life Technologies	4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0	Life Technologies	4397808
AB SDS software v2.3	Life Technologies	online
AB High Resolution Melting Getting Started Guide	Life Technologies	online
AB 7900HT Fast Real-Time System	Life Technologies