فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Summary

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Abstract

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduction

إدخال تكنولوجيات overexpression عزز إما الدراسات البيوكيميائية لل-نسخة منخفضة الانزيمات عدد والإنتاج الصناعي من البروتينات الصيدلانية الفعالة (مثل الأنسولين). منذ ظهور هذه التقنيات، وقد تم تحقيق تقدم كبير لزيادة الغلة ونوعية البروتينات المؤتلف. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير بدائية النواة ^1،2 و حقيقية النواة ³ أنظمة overexpression على مر السنين، وتقديم بدائل مفيدة ل"حصان العمل" للتكنولوجيا الحيوية من البروتين، أي كولاي. على وجه الخصوص، وتوافر منصات بديلة لE. أدى القولونية إلى إنتاج الببتيدات المؤتلف أو البروتينات التي تحمل التعديلات بعد متعدية. ومع ذلك، فإنه يجب ذكره أن E. القولونية لا يزال يمثل كائن الاختيار لإنتاج البروتين المؤتلف. ويرجع ذلك إلى عدة عوامل، من بينها الأكثر صلة يمكن أن تكونتعتبر: أ) توافر عدد كبير من أنظمة overexpression (ناقلات التعبير وسلالات) لE. القولونية ^1،2. ب) مرات الجيل القصير، وغلة الكتلة الحيوية العالية، من E. القولونية في مجموعة متنوعة من الوسائط الغنية والاصطناعية. ج) للتلاعب سطحي إما في الكيمياء الحيوية وعلى المستوى الجيني لهذه الكائنات الحية الدقيقة. د) عزل سلالات قادرة على إنتاج البروتينات السامة ^4؛ ت) بناء سلالات تتميز تحريض متجانسة على مستوى السكان ^5،6. وبالإضافة إلى ذلك، تبين في الآونة الأخيرة أن الأنظمة التعبير مناسبة للإنتاج في E. القولونية من البروتينات بعد translationally تعديل يمكن وضعها والتي شيدت ^2.

في الوقت الحاضر، ويستخدم البروتين overexpression أساسا للحصول على البروتينات أحادى أو وطي بلازميدة قليلة القسيمات، الذي لا يمكن أن يؤديها مع جين واحد مستنسخ إلى البلازميد المناسب hypersynthesis. ومع ذلك، كان الاهتمام في الآونة الأخيرةالمدفوعة لبناء E. أنظمة البروتين شاركت في التعبير القولونية، مما يشكل تحديا للإنتاج، في الجسم الحي، من مجمعات للمغاير بلازميدة قليلة القسيمات ^2. ومن المثير للاهتمام، والتجارب في وقت مبكر من البروتين شاركت في التعبير كلمة أمام الجمعية بين الأنواع من مفارز كبيرة وصغيرة من كربوكسيلاز السيانوبكتيريا ريبولوز-1،5-bisphosphate / أوكسيجيناز ^7،8، ورابطة أشكال اقتطاع وطول كامل من HIV-1 الناسخ ⁹ عكس. وأظهرت هذه الدراسات الرائدة التي البروتين شاركت في التعبير يمثل بديلا قويا لالتقليدية في إعادة المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، والبروتين شارك في التعبير في E. وقد استخدم القولونية لإنتاج البروتينات المختلفة التي تحمل التعديلات بعد متعدية ^2، للحصول على البروتينات التي تحتوي على الأحماض الأمينية غير طبيعية ^2، وزيادة العائد من بروتينات الغشاء overexpressed ^2. وعلاوة على ذلك، فإن احتمال من البروتين شاركت في التعبير كأداة لتمنح لE. القولونية المنافسةالامتحانات التنافسية الوطنية في إفراز البروتين هو قيد التحقيق النشط ^2.

اثنين من الاستراتيجيات الرئيسية للبروتين شارك في التعبير في E. القولونية يمكن اتباعها: ط) استخدام البلازميد واحد لاستضافة جينات مختلفة إلى أن overexpressed. ب) استخدام البلازميدات متعددة في الخلايا واحد للمشاركة في التعبير عن البروتينات المستهدفة. في الحالة الأولى، ومعايير لاختيار البلازميد لا تختلف عن تلك التي واحدة من التجارب البروتين overexpression التقليدية، على الرغم من البلازميدات معينة تحتوي على العناصر جنبا إلى جنب المروج / المشغل شيدت للمشاركة في التعبير ^10. ولذا فإن هذا النهج الأول هو بسيط جدا. ومع ذلك، فإنه تجدر الإشارة إلى أن استخدام البلازميد واحد للمشاركة في التعبير عن مختلف البروتينات يواجه صعوبات كبيرة اثنين: أ) الكتلة الجزيئية للزيادات ناقلات مع عدد من الجينات استضافت، مما يحد من عدد من البروتينات وأعرب المشترك؛ ب) عندما يتم استنساخ جينات متعددة تحت سيطرة أحد المروجين واحد، يمكن قطبية decreasالبريد التعبير عن الجينات البعيدة من المروج. استخدام البلازميدات مزدوجة أو متعددة في واحد E. خلايا القولونية ديها لتحقيق التوافق بين ناقلات الاختيار، وبالتالي فرض القيود على تركيبات المؤهلة من البلازميدات. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية شاركت في التعبير الثانية يتميز بميزة التي تحتوي على الكتلة الجزيئية للناقلات، ويحد قطبية. نحن شيدت مؤخرا نظام المشاركة في التعبير البروتين مصممة لتسهيل مكوكية من الجينات بين البلازميدات شاركت في التعبير ^11. على وجه الخصوص، ونحن شيدت سلسلة نواقل pGOOD، الميزات ذات الصلة والتي هي: أ) أصل p15A النسخ المتماثل، لتوفير التوافق من البلازميدات pGOOD مع ناقلات التجارية التي تحتوي على أصل ColE1 (على سبيل المثال، سلسلة pBAD ^12)؛ ب) الكاسيت التتراسيكلين المقاومة. ج) وجود لاك -derived العناصر التنظيمية، أي المروج-المشغل (O ₁₎ الزوجين واسي ^س الجين. باستخدام زوجين pBAD-pGOOD المناسب، كنا قادرين على بإفراط عن جوهر الحفاز E. القولونية DNA بوليميريز الثالث، تتكون من ثلاثة مفارز مختلفة، أي α (في 'البلمرة، ε (و3'-5 5'-3) "نوكلياز خارجية) وθ (استقرار ε) ^13. على وجه الخصوص، أثبتنا أن شارك في التعبير عن مجمع αεθ كان يعتمد بشكل صارم على بالإضافة إلى E. القولونية مستنبت كل من IPTG وأرابينوز، مما اثار overexpression من pGOOD وpBAD، على التوالي (الشكل 1A).

في هذا التقرير، فإننا توضيح كيفية البروتين شاركت في التعبير يمكن أن تحل بكفاءة صعوبات مرتبطة الذوبان الفقراء من حدة فرعية البروتين المعقدة. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيف في بروتين الجسم الحي الاختبارات تكامل لا يمكن أن يؤديها، ونحن تقريرا أخيرا على استخدام البروتين شاركت في التعبير للتردد طفرة في تناغم E. مضيق بين قمتينأنا. لتحقيق هذا الهدف، وكنا الأزواج pGOOD-pBAD مناسبة لتوضيح الأمثلة ذات الصلة في كل دراسة حالة.

Protocol

1. عزل E. القولونية المشارك transformants

1. إعداد الخلايا الكهربائية المختصة في E. المناسب سلالة القولونية إلى أن تتحول. نقل إلى 1 مل من LB المتوسطة (تريبتون، مستخلصات الخميرة، كلوريد الصوديوم بنسبة 10، 5، و 10 غرام / لتر على التوالي) مستعمرة واحدة من سلالة من الاختيار، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف تهتز من 180 دورة في الدقيقة. تمييع ما قبل الثقافة 1: 500 في 25 مل من الطازجة المتوسطة LB واحتضان الثقافة في 37 ° C.
2. في المرحلة السجل (0.6 OD) أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلايا في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة)، و resuspend بيليه في 10٪، والخامس / الخامس للمياه معقمة الجلسرين الجليد الباردة في نصف حجم ثقافة الأصلي. كرر هذه الخطوة 4 مرات، في كل مرة خفض حجم إعادة تعليق. وأخيرا، resuspend الكرية في الجلسرين / المياه وتقسيم تعليق الخلايا في 50 مكل. تخزين aliquots في -80 ° C تصل إلى 6 أشهر.
3. حل البلازميد المطلوب في الماء المعقم تستكمل مع 0.5 ملي EDTA. ذوبان الجليد على جيمالبريد قسامة من الخلايا الكهربائية المختصة وتخلط مع كمية مناسبة (2.5-5 نانوغرام) من النواقل. الاستغناء الخليط في 0.1 سم كفيت مناسبة ل electroporation، وتطبيق 1.8 كيلو فولت.
4. على الفور نقل الخلايا electroporated في 1 مل من SOC المتوسطة (LB المتوسطة تستكمل مع 0.2٪ ث / ت الجلوكوز، 10 ملي MgCl _2، 2.5 ملي بوكل)، واحتضان لمدة 1 ساعة تحت الهز، وأخيرا نقل 100 مكل إلى أطباق بتري تحتوي على LB أجار مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
5. تنقية transformants بواسطة تسليط الضوء على المستعمرات واحد على أطباق بتري.
6. إعداد الخلايا الكهربائية المختصة في transformants الابتدائية وكرر الخطوات من 1،1-1،5 لتحويل مع مزيد من البلازميدات.
7. إعداد مخزون الجلسرين من شارك في transformants. نقل مستعمرة واحدة في LB تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت الهز، والمعرضة للمرحلة السجل (0.6 OD) أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلايا في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة. Resuspend بيليه في LB-المضادات الحيوية التي تحتوي على المتوسطة 15٪ ت / ت الجلسرين. الاستغناء في مأخوذة وتخزينها في - 80 ° C.

2. المشارك التعبير عن α ε والوحدات الصغرى من E. القولونية البلمرة DNA III

1. نقل مع حلقة عقيمة كمية صغيرة من الأسهم الجلسرين سلالة المناسب (على سبيل المثال، TOP10 / pGOOD-ε243 وTOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160، انظر الشكل 1) في طبق بتري تحتوي على LB المتوسطة والمضادات الحيوية. السماح للخلايا جافة تعليق على طبق بيتري، ومسحة الخلايا الحبرية. احتضان عند 37 درجة CO / N.
2. نقل، وذلك باستخدام مسواك العقيمة، مستعمرة واحدة في 1 مل من LB-المضادات الحيوية المتوسطة. احتضان 8 ساعة عند 37 ° C. تمييع ما قبل الثقافة 1: 500 في متوسطة جديدة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 15 ساعة.
3. إضافة IPTG، أرابينوز، أو أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. جمع الخلايا، وتخزين الكريات في -20 ° C.
4. الكريات ذوبان الجليد على الجليد و resuspend في تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 2.5 ملي dithiothreitol، 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، ودرجة الحموضة 8). التجانس بلطف تعليق الخلايا مع بوتر الزجاج البارد.
5. يصوتن في 15 W لمدة 15 ثانية، تليها 15 ثانية فاصل التبريد (4 دورات).
6. أجهزة الطرد المركزي إجمالي مقتطفات البروتين في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة، في 4 درجات مئوية لاسترداد جزء القابلة للذوبان.
7. تحليل بواسطة SDS-PAGE (12.5٪ الأكريلاميد) aliquots من كل استخراج البروتين القابلة للذوبان. لتحقيق هذا الهدف، ونقل 20 ميكرولتر من كل مستخلص بروتين قابل للذوبان لأنابيب إيبندورف تحتوي على 60 ميكرولتر من H ₂ O و 20 ميكرولتر من العازلة تحميل (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10 ملي β المركابتويثانول، و 10٪ (ث / ت) SDS، 50٪ (ت / ت) الجلسرين، 0.25٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول) ويغلي لمدة 5 دقائق. تحميل 18 ميكرولتر من كل عينة وتنفيذ أعمال الكهربائي في 140 V لحوالي 1.5 ساعة.

3. المشارك التعبير عن α الوحدة الفرعية من Deinococradiodurans سلطات الجمارك البلمرة DNA الثالث وε الوحدة الفرعية من E. القولونية البلمرة DNA III

1. إعداد ما قبل ثقافة E. القولونية سلالة TOP10 / pBAD-α الدكتور / pGOOD-ε243 في 1 مل من المتوسط ​​LB-الأمبيسلين-التتراسيكلين واحتضان 8 ساعة عند 37 درجة مئوية. تمييع 1: 1،000 في متوسطة جديدة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
2. تمييع 1: 100 إلى 200 مل من المتوسط ​​الطازجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، ثم حمل لمدة 3 ساعة مع أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما. حصاد الخلايا، وتخزين بيليه في -20 ° C.
3. Resuspend وبيليه في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 ملم PMSF. التجانس وتعطيل الخلايا كما هو موضح في 2.4 و 2.5.
4. أجهزة الطرد المركزي فورا الخلايا المحللة في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة. تجاهل بيليه. تصفية طاف مع قمع بوشنر مجهزة 3 طبقات من ورق الترشيح. تطبيق فراغ لطيف. لتجنب رغوة المفرطة، والحفاظ على فراغ قارورة مخروطي على الجليد أثناء الترشيح.
5. تحديد تركيز البروتين وفقا لبرادفورد ^14.

4. جل الترشيح اللوني

1. تتوازن ل16x70-تغلف المياه (200) عمود الترشيح هلام مع 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8. تحميل على العمود استخراج البروتين القابلة للذوبان. لحل الأمثل، واستخدام 1 مل عينة حلقة. أداء اللوني عند 0.6 مل / دقيقة. الحفاظ على درجة الحرارة عمود في 4 درجات مئوية طوال الوقت.
2. جمع 0.9 مل الكسور وتحليلها بواسطة SDS-PAGE. نقل 20 ميكرولتر من كل جزء صلة أنابيب إيبندورف تحتوي على 60 ميكرولتر من H ₂ O و 20 ميكرولتر من العازلة تحميل (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10 ملي β المركابتويثانول، و 10٪ (ث / ت) SDS، 50٪ ( ت / ت) الجلسرين، 0.25٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول) ويغلي لمدة 5 دقائق. تحميل 18 ميكرولتر من كل عينة وتنفيذ أعمال الكهربائي في 140 V لحوالي 1.5 ساعة.
3. تحديد "نوكلياز خارجية 3'-5 والنشاط البلمرة DNA من كل جزء في 96-نحنليرة لبنانية microplates. فحص النشاط نوكلياز خارجية باستخدام ثيميدين 5'-أحادي البارانتروفنيل استر (ص NP-TMP) كما الركيزة ^15. تقدير النشاط البلمرة DNA باستخدام PPX (بيروفسفاتاز، البيورين فوسفوريلاز، الزنثين أوكسيديز)، إلى جانب انزيم فحص ¹⁶ و 2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) كلوريد -5-فينيل-2H-نتروبلو (INT) كما متقبل الإلكترون ^16.

5. تحليل الطفرة من السكان المشارك معربا عن البرية من نوع ε الوحدة الفرعية من E. القولونية البلمرة DNA الثالث والطفري εD12A البديل

1. نقل مستعمرة واحدة من E. القولونية TOP10 تحتوي على pBAD-ε وpGOOD1-εD12A ¹¹ ناقلات إلى 1 مل من LB-المضادات الحيوية المتوسطة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
2. تمييع ما قبل الثقافة 1: 250 في 3 قوارير تحتوي على المتوسط ​​الطازجة (10 مل)، إضافة محرضات مناسبة (أرابينوز، IPTG، أو أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما) واحتضان عند 37 ° Cلمدة 8 ساعة. إعداد موازية في الثقافات غير المتعمد.
3. جمع aliquots من 1 مل، ثم تمييع 1: 500 في قوارير جديدة تحتوي متوسطة جديدة (10 مل) تستكمل أم لا مع محرضات مناسبة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
4. كرر الخطوات من 5.2 و 5.3 وجمع aliquots من 1 مل.
5. تحديد وقوع عدد من الأجيال في كل ثقافة. نقل على لوحات LB، 100 ميكرولتر من التخفيفات المسلسل المناسبة من اللقاح والثقافة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية. عد المستعمرات على لوحات LB، وحساب سجل من عدد الخلايا الموجودة في اللقاح (سجل _I) وفي الثقافة في نهاية النمو (تسجيل _C). لتحديد عدد من الأجيال، استخدم الصيغة: (تسجيل _C - تسجيل _I) /0.301.
6. الطرد المركزي في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend الخلايا في 1 مل من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 50 مم كلوريد الصوديوم. لpermeabilize الخلايا، إضافة 2-3 قطرات من الكلوروفورم ودوامة لمدة 20 ثانية.
7. تحديد β-النشاط جلوكوزيد كل قسامة في صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا، وذلك باستخدام ص -nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc)، والركيزة. إضافة إلى كل بئر 100 ميكرولتر من الخلايا permeabilized و 100 ميكرولتر من الركيزة (16 ملغ / مل حل الأوراق المالية في H ₂ O). الحرص على تجنب فقاعات الهواء في الآبار. قراءة الامتصاصية في 420 نانومتر، وذلك باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية والمرشح المناسب.

النتائج

الوحيدات ε من E. يتكون القولونية DNA بوليميريز الثالث من 243 الأحماض الأمينية ويحتوي الفقراء الذوبان ^17،18، ما لم يتم حذف مخلفات 187-243 ^17. ومع ذلك، لقد أظهرنا سابقا ¹¹ أن شارك في التعبير عن α كامل طول، ε، ومفارز θ غلة البلمرة DNA للذوبان III الأساسية ال?...

Discussion

يمكن أن تكون البروتينات المختلين جوهريا، ويضم المناطق التي لا تقتصر على عدد محدود من التشكل ²⁵ الهيكل العالي. هذه البروتينات المختلين وعادة ما تكون عرضة لتجميع ^25، وعزلتهم وتوصيف قد تمثل مهمة صعبة. الوحيدات ε من E. القولونية DNA بوليميريز III ملامح اثنين م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix