단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

요약

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

초록

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

서문

과발현 기술의 도입은 낮은 카피 수 효소의 생화학 적 연구와 약리학 적 활성 단백질 (예를 들면, 인슐린)의 산업 생산를 부스팅. 이러한 기술의 출현 때문에 상당한 진보는 재조합 단백질의 수율 및 품질을 증가시키기 위해 달성되어왔다. 또한, 원핵 및 진핵 ^{3 1,2-} 과발현 시스템은 단백질 공학, 즉, 대장균 "일꾼"유용한 대안을 제공 년에 걸쳐 개발되었다. E. 대안 플랫폼 특히, 가용성 대장균 재조합 펩타이드 또는 번역 후 변형을 함유하는 단백질의 제조되었다. 그러나, 언급되어야 E. 대장균은 여전히 재조합 단백질 생산을위한 선택의 유기체를 나타냅니다. 이 가장 관련성이있을 수있는 여러 요소 중에서,에 기인고려 : ⅰ) 과발현 시스템 (발현 벡터 및 균주 확실히 다수의 가능 여부)을위한 E. 대장균 ^1,2; E. II의) 짧은 생성 시간 및 높은 수율의 바이오 매스, 풍부하고 합성 다양한 미디어에서 대장균; ⅲ) 생화학에서이 미생물의 유전자 수준에서 어느 손쉬운 조작; ⅳ) ⁴ 독성 단백질의 생산이 가능한 균주의 분리; V) 인구 레벨 ^5,6에 균일 유도를 갖춘 균주의 건설. 또한, 최근에 E. 그 생산에 적합한 발현 시스템을 도시 한 번역 후 변형은 단백질의 ^{대장균이 고안을} 구성 할 수있다.

현재, 단백질의 과발현은 주로 그의 hypersynthesis 적절한 플라스미드에 클로닝 한 유전자와 함께 수행 될 수 단량체 또는 호모 올리고머 단백질을 얻기 위해 사용된다. 그러나 관심은 최근에 있었다E. 건설에게 지급 콜라이 단백질의 공동 발현 시스템, 헤테로 올리고머 성 복합체 ^(2)의 생체 내, 생산 도전. 흥미롭게도, 단백질의 공동 표현의 초기 실험은 시아 노 박테리아 리불 로스 -1,5- 비스 포스페이트 카르 복실 / 시게나 제 ^7,8의 크고 작은 소단위의 간 종 조립 및 HIV-1의 절단 및 전체 길이 형태의 관계를 해결 효소 ^{구 역.} 이러한 선구적인 연구는 단백질의 공동 발현이 체외 재구성 전통에 대한 강력한 대안을 나타낸다는 것을 보여 주었다. E.에서 또한, 단백질의 공동 발현 대장균은 천연 ^{아미노산이 함유} 단백질을 얻기 위해, 번역 후 ^{변형이 담지} 다른 단백질을 생산하고, 과발현 된 막 단백질 ^(2)의 수율을 증가시키기 위해 사용되었다. 또한, 단백질과 같은 공구의 공동 발현의 전위를 부여하는 E. 대장균 경쟁단백질 분비 후부 활성 조사 ² 중입니다.

E. 단백질의 공동 표현의 두 가지 주요 전략 대장균 추구 할 수 있습니다 다른 유전자를 호스팅 할 하나의 플라스미드의 사용이 과발현되는 I); ⅱ) 단일 셀에서 여러 플라스미드를 사용하는 목적 단백질의 공동 발현한다. 탠덤 프로모터 / 운영자 특정 원소를 함유하는 플라스미드가 공동 - 식 ^(10)에 대해 구축되었다하더라도 첫 번째 경우, 플라스미드의 선택을위한 기준은, 전통적인 단일 단백질 과발현 실험의 것과 다르지 않다. 첫 번째 방법은 따라서 매우 간단합니다. 그러나, 다른 단백질을 공동 발현하는 하나의 플라스미드를 사용하는이 두 가지 문제에 직면 언급한다 : ⅰ) 공동 발현 된 단백질의 수를 제한 호스팅 유전자 수가 벡터 증가의 분자량; ⅱ) 다수의 단일 유전자 프로모터의 제어하에 복제 될 때, 극성을 수 decreas원위 프로모터 유전자 발현 전자. E. 이중에서 단일 또는 다수의 플라스미드를 사용 대장균 세포 따라서 플라스미드의 자격이 조합에 제약을 부과, 선택의 벡터의 호환성을 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 두 번째 공동 발현 전략은 벡터의 분자량을 포함하는 장점을 특징으로하고, 극성을 제한한다. 우리는 최근 공동 발현 플라스미드 ⁽¹¹⁾ 유전자의 셔틀 링을 용이하게하기위한 단백질의 공동 발현 시스템을 구축 하였다. 특히, 우리 PGOOD 벡터 시리즈 지어진 중요한 특징은 어느이다 : ⅰ) 복제 p15A 오리진, 상업적 벡터 (예, pBAD 시리즈 ¹²⁾ ColE1 기원을 함유 함께 PGOOD 플라스미드의 호환성을 제공하는 단계; ⅱ) 테트라 사이클린 내성 카세트; ⅲ) 락의 존재는 규제 요소, 즉, 프로모터 연산자 (O ₁₎ 부부와의 lacI을 - 유래 ^{Q 유전자.} 적절한 pBAD-PGOOD 커플을 사용하여, 우리는 E.의 촉매 코어를 과발현 할 수 있었다 세 개의 다른 소단위으로 구성 대장균 DNA 폴리머 라제 III, 즉, α (5'-3 '중합 효소), ε (3'-5'엑소 뉴 클레아 제) 및 (안정화 ε) ¹³ θ. 특히, αεθ 복합체의 공동 발현 E.에 더하여에 엄격히 의존 시연 IPTG와 아라비 모두 대장균 배양액 PGOOD 및 pBAD 각각 (도 1a)에서 트리거링 과발현.

본 보고서에서, 우리는 단백질의 공동 발현이 효율적으로 단백질 복잡한 서브 유닛의 가난한 용해도에 연결된 어려움을 해결할 수있는 방법을 보여줍니다. 또한, 어떻게 생체 단백질 보완 테스트에서 행할 수 보여, 우리는 마침내 E. 튜닝 주파수 변이 단백질로 공동 발현의 사용에 대한 보고서 안부내가. 이를 위해, 우리는 각각의 사례 연구의 관련 사례를 설명하기에 적합 PGOOD-pBAD 커플을 사용했다.

프로토콜

E. 1. 분리 대장균 공동 형질 전환

1. 해당 E.의 전기 유능한 세포를 준비 대장균 균주를 변환 할 수 있습니다. LB 배지 1 ㎖ (트립 톤, 효모 추출물, (10)에서의 NaCl, 5, 10g / 각각 L,) 선택의 변형의 단일 식민지, 그리고로 전송 180 rpm으로 진탕 조건에서 37 ° C에서 배양한다. 사전 문화 (1) 희석 : 500 신선한 LB 배지 m​​l의 25에서 37 ° C에서 문화를 품다.
2. 로그 상 (0.6 OD)에서 20 분 동안 5,000 XG)에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 원래 문화 볼륨의 절반에 10 %, v / V를 얼음처럼 차가운 멸균 글리세롤 물에 펠렛을 재현 탁. 마다 부유 양을 절반으로,이 단계를 4 회 반복한다. 마지막으로, 글리세롤 / 물에 펠렛을 재현 탁하고 50 ㎕의 분취 액에 세포 현탁액을 나눈다. 6개월에 -80 ° C 최대의 분량을 저장합니다.
3. 0.5 mM의 EDTA 보충 멸균에서 원하는 플라스미드를 녹여. IC에 해동전자 전기 - 반응성 세포의 분취 량과 벡터의 적절한 양 (2.5-5 NG)와 혼합한다. 전기에 적합한 0.1 cm 큐벳에 혼합물을 분배하고, 1.8 kV의 적용.
4. 즉시 SOC 배지 1 ㎖로 일렉트로 세포를 트랜스퍼 (LB 배지 w 0.2 % / V 포도당 된 10 mM의 MgCl _2, 2.5 mM의 KCl을 보충), 진탕하에 1 시간 동안 배양하고, 마지막으로 함유하는 페트리 접시에 100 μL 씩 전송 적절한 항생제 LB 한천. 37 ° C에서 O / N을 품어.
5. 페트리 접시에 하나의 식민지를 질주하여 형질 전환 체를 정화.
6. 기본 형질 전환 체의 전기 유능한 세포를 준비하고 반복 더 플라스미드로 변환하는 1.1-1.5 단계를 반복합니다.
7. 공동 형질 전환 체의 글리세롤 주식을 준비합니다. 적절한 항생제로 보충 LB에서 하나의 식민지로 이동 진탕 37 ° C에서 배양하고, 로그 상 (0.6 OD) 원심 분리기 20 분 5,000 XG에 세포 현탁액에서. R중간 15 % v / V를 글리세롤을 포함하는 LB-항생제의 펠렛을 esuspend. 분량 씩 분배와에 저장 - 80 ° C.

E.의 α와 ε 소단위 2. 공동 식 대장균 DNA 중합 효소 III

1. 멸균 된 루프 적절한 변형 글리세롤 스톡 소량 전송 LB 배지 및 항생제를 함유하는 페트리 접시에 (예 TOP10 / PGOOD-ε243 및 TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160를,도 1 참조). 세포가 방울 세포 현탁액 페트리 접시 위에 건조하고, 행진하자. 37 ° CO / N에 품어.
2. 멸균 된 이쑤시개, LB-항생제 매체의 1 ml의 단일 콜로니를 사용하여 전송. 37 ° C에서 8 시간을 품어. 신선한 매체 (500)를 15 시간 동안 30 ° C에서 부화 : 사전 문화 (1) 희석.
3. IPTG, 아라비 노스, 또는 아라비 노스와 IPTG, 1 mM의 각을 추가합니다. 2.5 시간 동안 30 ° C에서 품어. 세포를 수집하고, -20 ° C에서 알약을 저장합니다.
4. 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, 50 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 2.5 mM의 디티 오 트레이 톨, 1​​mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), pH가 8)에 재현 탁하고 얼음에 녹여 펠릿. 조심스럽게 차가운 유리 포터와 세포 현탁액을 균질화.
5. 15 초 냉각 간격 (4 사이클) 다음 15 초 15 W,에서 초음파 처리.
6. 가용성 획분을 회수하는 4 ° C에서 20 분 동안 10,000 XG에서 전체 단백질 추출물을 원심 분리기.
7. SDS-PAGE (아크릴 아미드 12.5 %) 각각의 가용성 단백질 추출물의 분액에 의해 분석한다. 이를 위해, H ₂ O 60 ㎕의 로딩 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 20 μl를 함유하는 에펜 도르프 튜브에 각각 가용성 단백질 추출물 20 μL를 전송 6.8, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % (w / v)의 SDS, 50 % (v / v) 글리세롤, 0.25 % 청색 (w / v)의 브로 모 페놀)과 5 분 동안 끓인다. 로드 각 샘플의 18 μl의 약 1.5 시간 동안 140 V의 전기를 수행합니다.

Deinococ의 α 서브 유닛 3. 공동 식기분이야 radiodurans DNA 중합 효소 III와 ε E. 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III

1. E.의 사전 문화를 준비 대장균의 TOP10 / 박사를 pBAD-α / LB-암피실린 - 테트라 사이클린 배지 1 ㎖에 PGOOD-ε243 37 ° C에서 8 시간을 품어. 새로운 배지에서 1,000 37 ° C에서 O / N을 품어 : 1 희석.
2. 1 희석 : 신선한 매체의 100 (200)에 ㎖를, 다음 아라비 노스와 IPTG, 1 mM의 각각 3 시간 동안 유도, 3 시간 동안 37 ° C에서 품어. 세포를 수확하고, -20 ° C에서 펠렛을 저장합니다.
3. 50mM 트리스 - 염산 pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 1mM의 PMSF에 펠렛을 재현 탁. 균질화 2.4 및 2.5에 기술 된 바와 같이 세포를 방해.
4. 즉시 세포를 20 분 동안 10,000 XG에 원심 해물. 펠렛을 폐기하십시오. 종이 필터의 3 층을 구비 한 흡인 여과기와 상청액을 필터. 부드러운 진공을 적용합니다. 과도한 거품을 방지하기 위해 여과 동안 얼음에 진공 삼각 플라스크를 유지합니다.
5. 브래드 포드 ^(14)에 따라 단백질 농도를 결정합니다.

4. 젤 여과 크로마토 그래피

1. 50 mM 트리스 - 염산, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, pH를 컬럼으로 8로드 가용성 단백질 추출물과 물 재킷 16x70 (200) 겔 여과 열 평형. 최적 해상도를 들어, 1 ml의 시료 루프를 사용합니다. / 분 0.6 ml의에서 크로마토 그래피를 수행합니다. 에 걸쳐 4 ° C에서 열 온도를 유지합니다.
2. 0.9 ml의 분수를 수집하고 SDS-PAGE에 의해을 분석 할 수 있습니다. 전송 H ₂ O 60 μL 및 로딩 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % (/ V) SDS w, 50 %의 20 μl를 함유하는 에펜 도르프 튜브에 관련된 각 분획의 20 μL ( v / v)의 글리세롤, 0.25 % (파란색 w / v)의 브로 모 페놀) 및 5 분 동안 끓인다. 로드 각 샘플의 18 μl의 약 1.5 시간 동안 140 V의 전기를 수행합니다.
3. 3'-5 '엑소 뉴 클레아 제 및 각 분획의 DNA 중합 효소의 활성을 96 우리하여 결정LL 마이크로. 기판 ^(15)로 티미 딘 5'- 모노 인산 (P) 니트로 에스테르 (p-TMP의 NP)을 이용하여 엑소 뉴 클레아 제 활성을 분석. PPX (Pyrophosphatase, 퓨린 뉴 클레오 사이드 포스 포 릴라 제, 크 산틴 옥시 다제), 효소 결합 분석 ^16을 사용하여 DNA 폴리머 라 아제 활성을 예측 2- (4- 요오도 페닐) -3- (4- 니트로 페닐) -5- 페닐 -2H-테트라 졸륨 클로라이드 (INT) 전자 수용체 ^16.

인구 E.의 야생 형 ε 서브 유닛을 공동 발현 5. 돌연변이 분석 대장균 DNA 중합 효소 III 및 변이원성 εD12A 변형

1. E.의 단일 식민지로 이동 pBAD-ε과 LB-항생제 배지 1 ㎖에 pGOOD1-εD12A ¹¹ 벡터를 포함하는 대장균 TOP10. 37 ° C에서 O / N을 품어.
2. (아라비 노스, IPTG, 또는 아라비 노스 및 IPTG, 1 mM의 각각)을 적당한 유도제를 추가 한 새로운 배지 (10 ㎖)을 함유하는 플라스크에 250 3 37 ° C에서 배양한다 : 예비 배양 한 희석8 시간 동안. 병렬이 아닌 유도 문화에서 준비합니다.
3. 1 ml의 일정량을 수집 한 후 1 희석 : 신선한 매체 (10 ㎖)를 포함하는 새로운 플라스크에 500을 적절한 유도 보충 여부. 37 ° C에서 O / N을 품어.
4. 반복은 1 ml의 5.2 및 5.3 및 수집 분량 씩 단계를 반복합니다.
5. 세대의 수는 각 문화에서 발생 확인합니다. LB 플레이트, 접종 및 문화의 적절한 희석액 100 ㎕에 전송합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어. LB 플레이트상에서 콜로니를 카운트하고, 성장 _{(C 로그)의} 단부에 존재 균액 _{(I 로그)와} 배양 세포 수의 로그를 계산한다. 세대의 수를 확인하려면 수식을 사용하십시오 _{(C 로그} - _I 로그인) /0.301을.
6. 20 분 동안 5,000 XG 원심 분리기 및 50 mM 트리스 - 염산 pH를 7.6, 50 mM의 NaCl을 1 ml의 세포를 재현 탁. 세포를 Permeabilize 하시려면하려면 20 초 동안 클로로포름과 소용돌이 ~ 3 방울을 추가합니다.
7. β- 결정기판으로서 P 개의 -nitrophenyl-β-D 글루 코피 라노 사이드 (PNPGluc)를 사용하여 96- 웰 마이크로 플레이트의 각 분취 량 글루코시다 제 활성. 각 웰에 투과 가능 세포를 100 ㎕)과 기판 (100 ㎕ (16 ㎎ / H ₂ O ㎖의 원액)를 추가합니다. 우물에 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오. 마이크로 플레이트 리더 및 적절한 필터를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 읽는다.

결과

E.의 ε 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III는 243 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 잔류 187-243 ^(17)을 삭제하지 않는 한, 용성 ^{(17, 18)을} 갖추고 있습니다. 그러나, 우리는 이전에 전체 길이 α, ε, 및 θ 서브 유니트의 공동 발현이 수용성 DNA 폴리머 라제를 촉매 III 코어 (도 1)을 수득 ¹¹ 것을 보여 주었다. ⅰ) α와 ε 소단위의 과발현은 독립적 아라비 노...

토론

단백질은 그 차 구조 배좌 ^(25)의 제한된 수의 제한되지 않은 영역을 갖춘, 무질서 본질적 일 수있다. 이들 무질서 화 된 단백질은 통상 ²⁵ 응집 경향이며, 그들의 분리 및 특성 규명은 어려운 작업을 나타낼 수도있다. E.의 ε 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III는 두 가지 영역, 즉 ^{(26, 27)를} 특징 : I) N-터 도메인, θ 서브 유닛을 바인딩에 3'-5 '엑소 뉴 클레아 제 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix