תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

Summary

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Abstract

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduction

כניסתן של טכנולוגיות ביטוי יתר שיפרה גם מחקרים ביוכימיים של אנזימי מספר נמוך עותק והייצור התעשייתי של חלבונים פרמקולוגית פעילים (למשל, אינסולין). מאז כניסתו של טכנולוגיות אלה, התקדמות משמעותית הושגה להגדיל את התפוקה ואיכות של חלבונים רקומביננטי. בנוסף, מערכות ביטוי יתר פרוקריוטים ^1,2 ואוקריוטים ³ פותחו לאורך השנים, המציעות חלופות שימושיות ל" סוס העבודה "של ביוטכנולוגיה חלבון, כלומר, Escherichia coli. בפרט, את הזמינות של פלטפורמות חלופיות לE. coli הוביל לייצור של פפטידים או חלבונים הנושאים לאחר translational שינויי רקומביננטי. עם זאת, יש לציין כי ה coli עדיין מייצג את האורגניזם של בחירה לייצור חלבון רקומביננטי. זאת בשל מספר גורמים, ביניהם הרלוונטיים ביותר יכול להיותנחשבת: i) את הזמינות של מספר לא מבוטל של מערכות ביטוי יתר (וקטורי ביטוי וזנים) לE. coli ^1,2; ii) פעמים הדור הקצר, ותשואות ביומסה גבוהות, של א ' coli במגוון רחב של מדיה עשירה וסינתטי; iii) המניפולציה הקלילה או ביוכימיים וברמה הגנטית של מיקרואורגניזם זה; iv) הבידוד של זנים מסוגלים הייצור של חלבונים רעילים ^4; v) הבנייה של זנים הכוללים אינדוקציה הומוגנית ברמת האוכלוסייה ^5,6. בנוסף, הוא היה לאחרונה הראה כי מערכות הביטוי מתאימות לייצור בE. coli של חלבונים שונה-translationally פוסט ניתן המציא ונבנה ^2.

נכון לעכשיו, ביטוי יתר של חלבון משמש בעיקר כדי להשיג חלבוני monomeric או הומו-oligomeric, hypersynthesis שניתן לבצע עם גן יחיד המשובט לתוך פלסמיד מתאים. עם זאת, תשומת לב הייתה לאחרונהששולם לבנייה של א ' מערכות coli שיתוף ביטוי חלבון, מאתגרים את הייצור, in vivo, מתחמי הטרו-oligomeric ^2. מעניין, ניסויים מוקדמים של שיתוף ביטוי חלבון התייחסו להרכבה בין-המינים של תת-יחידות קטנות וגדולות של carboxylase ribulose-1,5-bisphosphate cyanobacterial / oxygenase ^7,8, ואת הקשר של צורות קטועות ובאורך מלא של HIV-1 להפוך transcriptase ^9. מחקריו החלוציים אלה הראו, כי שיתוף ביטוי חלבון מהווה אלטרנטיבה חזקה למסורתית בכינון מחדש חוץ גופית. בנוסף, חלבון שיתוף ביטוי בE. coli שימש לייצור חלבונים שונים הנושאים לאחר translational שינויים ^2, כדי להשיג חלבונים המכילים חומצות אמינו לא טבעיות ^2, ולהגדיל את התשואה של חלבונים בממברנה ביטוי יתר ^2. יתר על כן, את הפוטנציאל של שיתוף ביטוי חלבון ככלי להענקה לE. coli להתחרותפליטות בהפרשת חלבון נמצאת תחת חקירה פעילה ^2.

שתי אסטרטגיות עיקריות של שיתוף ביטוי חלבון בE. יכול להיות רדוף coli: i) השימוש בפלסמיד בודד לארח גנים השונים לביטוי יתר; ii) את השימוש בפלסמידים מרובים בתאים בודדים לשתף לבטא חלבוני היעד. במקרה הראשון, הקריטריונים לבחירה של פלסמיד לא שונים מאלה של ניסויי ביטוי יתר של חלבון בודדים מסורתיים, אם כי פלסמידים מסוימים המכילים אלמנטים של פרומוטר / מפעיל בד בבד נבנו לשיתוף ביטוי ^10. הגישה הראשונה היא לכן די פשוט. עם זאת, יש לציין כי השימוש בפלסמיד בודד לשתף לבטא חלבונים שונים בפני שני קשיים עיקריים: א) המסה המולקולרית של עליות וקטור עם מספר גנים אירחו, הגבלת מספר החלבונים הביעו שיתוף; ii) כאשר מספר רב של גנים הם משובטים תחת שליטתו של יזם יחיד, קוטביות יכולה decreasדואר הביטוי של הגנים דיסטלי מהאמרגן. השימוש בפלסמידים כפולים או מרובים בE. אחת תאי coli יש להשיג את התאימות של הווקטורים של בחירה, ולכן הטלת מגבלות לצירופים הזכאים של פלסמידים. עם זאת, אסטרטגית שיתוף הביטוי שנייה זה כולל את היתרון של המכיל את המסה המולקולרית של וקטורים, ומגבילה את הקוטביות. לאחרונה בנו מערכת שיתוף ביטוי חלבון שנועדה להקל על הטלטלות של גנים בין פלסמידים שיתוף הביטוי ^11. בפרט, אנו נבנו סדרת וקטורי pGOOD, התכונות הרלוונטיות שבהן: א) מקור p15A של שכפול, כדי לספק תאימות של פלסמידים pGOOD עם הווקטורים המסחריים המכילים את מקור ColE1 (למשל, סדרת pBAD ^12); ii) קלטת טטרציקלין-התנגדות; iii) את נוכחותו של אק -derived אלמנטי רגולציה, כלומר, יזם-המפעיל (O ₁₎ בני זוג והאצים ^q גן. באמצעות זוג pBAD-pGOOD מתאים, היינו יכול ביטוי יתר של הליבה הקטליטית של E. פולימראז coli DNA III, מורכב משלוש תת-יחידות שונות, כלומר, α ('פולימראז, ε (3'-5 5'-3)' exonuclease) וθ (ε ייצוב) ^13. בפרט, הראינו כי שיתוף הביטוי של מתחם αεθ היה תלוי אך ורק על התוספת לE. בינוני coli תרבות של שני IPTG וarabinose, ביטוי יתר מפעילה מpGOOD וpBAD, בהתאמה (איור 1 א).

בדו"ח הנוכחי, אנו מדגימים כיצד שיתוף ביטוי חלבון ביעילות יכול לפתור קשיים צמודים לעניי המסיסות של מקטע מורכב חלבון. בנוסף, אנו מראים כיצד בבדיקות שלמת חלבון vivo יכול להתבצע, ובסופו אנו מדווחים על השימוש בשיתוף ביטוי חלבון לתדירות מוטציה המנגינה בE. coli. למטרה זו, השתמשנו זוגות pGOOD-pBAD מתאימים כדי להמחיש דוגמאות רלוונטיות של כל מקרה מבחן.

Protocol

1. בידוד של א ' coli Co-transformants

1. הכן תאי אלקטרו-המוסמך של E. המתאים זן coli להשתנות. העברה ל1 מיליליטר של מדיום LB (Tryptone, תמצית שמרים, NaCl בגיל 10, 5, ו -10 g / L, בהתאמה) מושבה אחת של הזן של בחירה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בתנאים רועדים של 180 סל"ד. לדלל את הקדם-תרבות 1: 500 ב- 25 מיליליטר של מדיום LB הטרי ודגירת התרבות על 37 מעלות צלזיוס.
2. ביומן-שלב (0.6 OD) צנטריפוגה ההשעיה התאים בXG 5000 עבור 20 דקות), וresuspend גלולה ב 10%, v גליצרול-מים סטריליים קר כקרח / v במחצית התרבות המקורי הנפח. חזור על שלב זה 4 פעמים, וחצה בכל פעם resuspension הנפח. לבסוף, resuspend את הכדור בגליצרול / מים ומחלקים את ההשעיה התאים ב -50 aliquots μl. אחסן aliquots ב C עד -80 ° עד 6 חודשים.
3. ממיסים את הפלסמיד הרצוי במים סטריליים בתוספת 0.5 mM EDTA. הפשרה בicדואר aliquot של תאי אלקטרו-מוסמך ולערבב עם כמות מתאימה (2.5-5 ng) של וקטור. לוותר התערובת לתוך קובט 0.1 סנטימטר מתאים לelectroporation, ולהחיל 1.8 kV.
4. מייד להעביר את תאי electroporated לתוך 1 מיליליטר של מדיום SOC (מדיום LB בתוספת 0.2% w / v גלוקוז, 10 מ"מ MgCl _2, 2.5 מ"מ KCl), דגירה עבור שעה 1 ברעד, ובסופו להעביר 100 aliquots μl לצלחות פטרי המכיל אגר LB עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
5. לטהר את transformants ידי פסי מושבות אחת על צלחות פטרי.
6. הכן תאי אלקטרו-המוסמך של transformants הראשוני וחזור על שלבים 1.1-1.5 להפוך עם פלסמידים נוספים.
7. הכן מניות גליצרול של שיתוף transformants. העבר את מושבה אחת בLB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה, לדגור על 37 מעלות צלזיוס מתחת רועד, וביומן-שלב (0.6 OD) צנטריפוגות ההשעיה התאים בXG 5000 עבור 20 דקות. Resuspend גלולה בLB-אנטיביוטיקה בינונית מכילה 15% גליצרול V / V. לוותר בaliquots ולאחסן ב-- 80 ° C.

2. שיתוף ביטוי של תת-יחידות α וε של א ' coli DNA פולימראז III

1. העבר עם לולאת סטרילי כמות קטנה של מניות הזן המתאים גליצרול (לדוגמא, TOP10 / pGOOD-ε243 וTOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, ראה איור 1) לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני LB ואנטיביוטיקה. בואו יבש השעיה תאים על גבי צלחת פטרי, ופס תאי טיפה. לדגור על 37 מעלות CO / N.
2. העברה, באמצעות קיסם סטרילי, מושבה אחת עד 1 מיליליטר של מדיום LB-אנטיביוטיקה. דגירה 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל את הקדם-תרבות 1: 500 במדיום חדש ולדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות.
3. הוספת IPTG, arabinose, או arabinose וIPTG, 1 מ"מ כל אחד. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2.5 שעות. לאסוף את התאים, ולאחסן את כדורים ב -20 ° C.
4. כדורי הפשרה על קרח וגלול במאגר תמוגה (50 מ"מ טריס-HCl, 50 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, dithiothreitol 2.5 מ"מ, 1 מ"מ פלואוריד phenylmethylsulfonyl (PMSF), pH 8). בעדינות homogenize ההשעיה תאי הקדר זכוכית קרה עם.
5. Sonicate ב 15 W במשך 15 שניות, ואחריו 15 שניות מרווח קירור (4 מחזורים).
6. צנטריפוגה כוללת תמציות חלבון ב10,000 XG במשך 20 דקות, בשעה 4 ° C כדי לשחזר את החלק המסיס.
7. לנתח ידי SDS-PAGE (acrylamide 12.5%) aliquots של כל תמצית חלבון מסיסה. למטרה זו, להעביר 20 μl של כל תמצית חלבון מסיסה לצינורות Eppendorf המכילים 60 μl של H ₂ O ו -20 μl של חיץ טעינה (250 טריס-HCl pH 6.8 מ"מ, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, 10% (w / v) גליצרול SDS, 50% (V / V), 0.25% (w / v) bromophenol הכחול) ולהרתיח במשך 5 דקות. עומס 18 μl של כל דגימה ולבצע אלקטרופורזה ב 140 V לכ -1.5 שעות.

3. שיתוף ביטוי של מקטע α של Deinococradiodurans cus DNA פולימראז III וε מקטע של א ' coli DNA פולימראז III

1. הכן מראש תרבות של א ' TOP10 זן coli / pBAD-α ד"ר / pGOOD-ε243 ב 1 מיליליטר של מדיום LB-אמפיצילין-טטרציקלין והדגירה 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל 1: 1,000 במדיום חדש ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
2. לדלל 1: 100 לכ -200 מיליליטר של מדיום חדש, לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות, ולאחר מכן להשרות במשך 3 שעות עם arabinose וIPTG, 1 מ"מ כל אחד. קציר התאים, ולאחסן את גלולה ב -20 ° C.
3. Resuspend את הכדור ב 50 מ"מ טריס pH-HCl 8, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 1 מ"מ PMSF. Homogenize ולשבש את התאים כמתואר ב2.4 ו -2.5.
4. מייד בצנטריפוגה התאים lysate על 10,000 XG במשך 20 דקות. זורק את הכדור. סנן את supernatant עם משפך ביכנר מצויד ב3 שכבות של נייר סינון. החל ואקום עדין. כדי למנוע הקצפת יתר, לשמור על ארלנמייר הוואקום על קרח במהלך סינון.
5. קביעת ריכוז חלבון על פי ¹⁴ ברדפורד.

4. ג'ל סינון כרומטוגרפיה

1. לאזן 16x70 בז'קטים מים (200) טור סינון ג'ל עם 50 מ"מ טריס-HCl, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. טען על טור תמצית החלבון המסיס. לרזולוציה אופטימלית, להשתמש מדגם לולאת 1 מיליליטר. לבצע כרומטוגרפיה על 0.6 מיליליטר / דקה. לשמור על טמפרטורת טור ב 4 מעלות צלזיוס לאורך כל דרך.
2. לאסוף 0.9 מיליליטר שברים ולנתח אותם על ידי SDS-PAGE. העברת 20 μl של כל חלק רלוונטי לצינורות Eppendorf המכילים 60 μl של H ₂ O ו -20 μl של חיץ טעינה (250 טריס-HCl pH 6.8 מ"מ, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v גליצרול / v), 0.25% (w / v) bromophenol הכחול) ולהרתיח במשך 5 דקות. עומס 18 μl של כל דגימה ולבצע אלקטרופורזה ב 140 V לכ -1.5 שעות.
3. לקבוע את exonuclease 3'-5 'ופעילות DNA פולימרז של כל חלק ב96-ll microplates. Assay פעילות exonuclease באמצעות אסתר thymidine 5'-monophosphate p-nitrophenyl (עמ 'NP-TMP) כמצע ^15. להעריך את פעילות ה- DNA פולימראז באמצעות PPX (Pyrophosphatase, phosphorylase nucleoside Purine, מונואמין Xanthine) מצמידים אנזים assay ¹⁶ ו2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) כלוריד -5-פניל-2H-tetrazolium (INT) כמקבל אלקטרונים ^16.

5. ניתוח מוטציה של אוכלוסיות Co-המבטאת את מקטע ε Wild-הסוג של א ' coli DNA פולימראז III וmutagenic εD12A Variant

1. העבר את מושבה אחת של E. coli TOP10 מכיל pBAD-ε ווקטורי pGOOD1-εD12A ¹¹ עד 1 מיליליטר של מדיום LB-אנטיביוטיקה. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
2. לדלל את הקדם-תרבות 1: 250 ב 3 צלוחיות המכילות בינוני טרי (10 מיליליטר), להוסיף inducers המתאים (arabinose, IPTG, או arabinose וIPTG, 1 מ"מ כל אחד) ולדגור על 37 מעלות צלזיוסבמשך 8 שעות. הכן בתרבויות מושרה שאינן מקבילות.
3. לאסוף aliquots של 1 מיליליטר, ואז לדלל 1: 500 בצלוחיות חדשות המכילות בינוני טרי (10 מיליליטר) בתוספת או לא עם inducers המתאים. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
4. חזור על שלבים 5.2 ו -5.3 ולאסוף aliquots של 1 מיליליטר.
5. לקבוע את מספר הדורות התרחש בכל תרבות. העבר על צלחות LB, של דילולים סדרתי המתאימים של הבידוד ותרבות 100 μl. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס. ספירת המושבות על צלחות LB, ולחשב את היומן של מספר תאים הנמצאים בבידוד (יומן _I) ובתרבות בסוף הצמיחה (יומן _C). כדי לקבוע את מספר הדורות, השתמש בנוסחה: (יומן _C - להיכנס _I) /0.301.
6. צנטריפוגה בXG 5000 עבור 20 דקות וresuspend התאים 1 מיליליטר של 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 50 מ"מ NaCl. לpermeabilize התאים, להוסיף 2-3 טיפות של כלורופורם ומערבולת למשך 20 שניות.
7. לקבוע את β-פעילות glucosidase של כל aliquot בmicroplate 96-היטב, באמצעות -nitrophenyl-β-D-glucopyranoside p (PNPGluc) כמצע. הוסף לכל טוב של תאי permeabilized 100 μl ושל מצע 100 μl (16 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות בH ₂ O). תשמור על עצמך כדי למנוע בועות אוויר בבארות. קראו את הספיגה ב 420 ננומטר, באמצעות קורא microplate והמסנן המתאים.

תוצאות

מקטע ε של א ' coli DNA פולימראז III מורכב של 243 חומצות אמינו ותכונות מסיסות עניה ^17,18, אלא אם כן השאריות 187-243 נמחקות ^17. עם זאת, יש לנו הראינו בעבר ¹¹ ששיתוף הביטוי של α באורך מלא, ε, ותת-יחידות θ מניב DNA פולימרז המסיס III ליבת קטליטי (איור 1). בפרט, באמ...

Discussion

חלבונים יכולים להיות במהות סדר, הכוללים אזורים שיישוני מבנה אינו מוגבלת למספר מצומצם של תצורות ^25. חלבוני הפרעות אלה הם בדרך כלל נוטים לצבירה ^25, והבידוד והאפיון שלהם עשוי לייצג משימה קשה. מקטע ε של א ' פולימראז coli DNA III כולל שני תחומים שונים ^26,27,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix