蛋白质的共表达了多方面的好处<em&gt;大肠杆菌</em

摘要

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

摘要

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

引言

表达技术的引入提高了低拷贝数酶或者生化研究和工业生产的药理学活性的蛋白质（ 如胰岛素）的。因为这些技术的出现，显著的进步已经实现，以增加重组蛋白的产量和质量。此外，原核^1,2和真核³过表达系统被开发，多年来，将提供到蛋白质生物技术， 即，大肠杆菌的"工作马"有用的替代品。替代的平台，以大肠杆菌 ，特别是可获得大肠杆菌导致生产的重组肽或蛋白轴承翻译后修饰的。然而，应该指出的是，E。大肠杆菌仍然代表所选择的生物体为重组蛋白的生产。这是由于多种因素，其中最相关的可认为:I）的不少表达系统（表达载体和应变的可用性）的E.大肠杆菌 ^1,2; ⅱ）短的产生时间，和高生物质产量，E的大肠杆菌中的各种丰富的和合成媒体; iii）所述浅显操纵或者在生物化学，并在该微生物的基因水平; ⅳ）能产生毒性蛋白⁴的菌株的分离; V）株具有均匀的感应在群体水平上^5,6建设。另外，最近显示适合于生产在大肠杆菌中的表达系统翻译后修饰的蛋白质的大肠杆菌可以设计和构造^2。

目前，蛋白质表达主要用来获得单体或同型寡聚蛋白质，其hypersynthesis可以与单个基因克隆到合适的质粒来进行。然而，关注的是最近支付给大肠杆菌的构建大肠杆菌蛋白的共表达系统，具有挑战性的生产， 在体内的杂寡聚复合物^2。有趣的是，蛋白质共同表达的早期实验解决了蓝藻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧^7,8的大，小亚基的种间组装，和HIV-1的截断和全长形式的关联逆转录^9。这些开创性的研究表明，蛋白质的共表达代表了强大的替代传统的体外重组。此外，蛋白的共表达在大肠杆菌中的大肠杆菌是用于生产不同的蛋白质轴承的翻译后修饰^2，得到含非天然氨基酸的蛋白质^2，并增加过表达的膜蛋白²的产率。而且，蛋白的共表达的作为工具的电位以赋予大肠杆菌大肠杆菌竞争NCE蛋白质分泌正在积极调查^2。

蛋白的共表达在大肠杆菌中的两种主要的策略大肠杆菌可以追求是:i）使用单个质粒来承载不同的基因的过表达; ⅱ）在单细胞中使用多个质粒共同表达靶蛋白。在第一种情况下，该标准的质粒的选择不与那些传统的单一蛋白质表达实验不同，虽然含有串联启动子/操纵元件特定的质粒用于共表达¹⁰构成。因此，这第一种方法是相当简单的。然而，应当提到的是，使用一个单一的质粒来共表达不同蛋白质面临两个主要的困难:i）的矢量随承载基因的数量，限制共表达蛋白的数量的分子质量; ⅱ）当多个基因的单个启动子的控制下克隆，极性可以增减E从启动子远端的基因的表达。单E.采用双重或多重质粒大肠杆菌细胞具有完成所选择的载体的相容性，因此，施加约束以质粒的合格组合。然而，该第二共表达策略设有含载体的分子质量的优点，并限制极性。我们最近建造设计，方便的共表达质粒¹¹之间的基因的穿梭蛋白共表达系统。特别是，我们构建了PGOOD矢量系列，相关特征，其中是:i）复制的一个P15A原点，以提供PGOOD质粒与含有市售载体的ColE1原点（ 例如，所述的pBAD系列^12）的相容性; ⅱ）四环素抗性盒; III）LAC存在派生调控元件， 即启动操作员（O _1）夫妇和的lacI ^Q基因。使用适当的pBAD-PGOOD夫妇，我们能够以过表达大肠杆菌的催化核心大肠杆菌 DNA聚合酶III，三种不同的亚单位组成， 即，α（5'-3'聚合酶），ε（3'-5'外切核酸酶）和θ（稳定^ε）13。特别是，我们表明，共表达αεθ复杂的是严格依赖于除大肠杆菌两者的IPTG和阿拉伯糖的大肠杆菌培养液，从PGOOD和的pBAD，分别为（ 图1A）触发过表达。

在本报告中，我们说明了如何蛋白共同表达可以有效地解决与蛋白复合物亚基的溶解性差的困难。此外，我们显示了如何在体内蛋白互补试验可以进行的，我们终于在大肠杆菌中使用的蛋白质共表达来调节突变频率报告关口我。为了这个目标，我们使用适合来说明每个案例研究相关的例子PGOOD-的pBAD夫妇。

研究方案

1.隔离的E.大肠杆菌共转化

1. 准备适当的大肠杆菌的电-感受态细胞大肠杆菌菌株进行改造。转移到1ml LB培养基（胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠10，第5和10克/升，分别地）选择的菌株的单菌落，并在37℃下孵育180 rpm振摇条件下进行。稀释预培养1:500中的新鲜LB培养基25毫升孵育的培养在37℃。
2. 在对数相（0.6 OD）离心所述细胞悬浮液在5000×g离心20分钟），并悬浮颗粒中的10％，体积/体积的冰冷无菌甘油 - 水在一半原培养体积。重复此步骤4次，每次再悬浮体积减半。最后，重新悬浮在甘油/水的颗粒和除以细胞悬浮于50μl等分试样。存储等分在-80℃下长达6个月。
3. 溶解补充有0.5mM EDTA的在无菌水中的所需质粒。解冻的ICê电感受态细胞的等分试样并混合以载体的合适量（2.5-5纳克）。分配所述混合物成适合于电穿孔0.1 1cm比色杯中，并应用​​1.8千伏。
4. 紧接在电穿孔的细胞转移到1毫升SOC培养基（LB培养基补充有0.2％w / v的葡萄糖，10mM的MgCl ₂的，2.5毫米氯化钾），孵育1小时下振荡，最后转移100μl的等分试样到培养皿含有LB琼脂用适当的抗生素。孵育O / N在37℃。
5. 通过在培养皿裸奔单菌落净化转化。
6. 准备主转化电感受态细胞，并重复步骤1.1至1.5进一步质粒进行改造。
7. 制备的共转化体的甘油原种。转移在LB单菌落补充有合适的抗生素，孵育在37℃下振荡，并且在对数期（OD 0.6）离心所述细胞悬浮液在5000×g离心20分钟。 řesuspend在LB-抗生素培养基含有15％体积/体积甘油沉淀。在分装分装并储存在 - 80℃。

2.共表达大肠杆菌的α和ε亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III

1. 用无菌环传送少量的相应应变甘油（ 例如，TOP10 / PGOOD-ε243和TOP10 / PGOOD-ε243-θ/pBADα1160，参见图1）到含有LB培养基和抗生素的培养皿。让细胞悬浮液干燥到培养皿，并且条纹细胞液滴。在37°CO / N。
2. 转让，使用无菌牙签，单菌落到1ml的LB-抗生素培养基中。孵育8小时，在37℃。稀释预培养1:500在新鲜的培养基中孵育在30℃下15小时。
3. 添加IPTG，阿拉伯糖，或阿拉伯糖和IPTG，每1毫米。孵育在30℃下2.5小时。收集细胞，并存储该粒料在-20℃。
4. 解冻粒料在冰上，重悬在裂解缓冲液（50mM的Tris-HCl，50 mM氯化钠，1mM EDTA中，2.5毫摩尔二硫苏糖醇，1mM苯甲基磺酰氟（PMSF），pH 8）中。轻轻的均匀的细胞悬液与冷玻璃窑匠。
5. 声处理，在15瓦下15秒，接着15秒冷却时间间隔（4个循环）。
6. 离心的总蛋白提取物在10,000×g离心20分钟，在4℃以回收可溶组分。
7. 通过SDS-PAGE（12.5％丙烯酰胺）的每个可溶性蛋白质提取物的等分试样进行分析。为此目的，传输20微升每种可溶性蛋白提取物含有60微升的H ₂ O和20微升加样缓冲液（250mM的Tris-盐酸的pH Eppendorf管6.8，10mM的β巯基乙醇，10％（重量/体积） SDS，50％（体积/体积）甘油，0.25％（重量/体积）溴酚蓝），并煮沸5分钟。负载18微升各样品并进行电泳，在140 V为​​约1.5小时。

3.共表达Deinococ的α亚基对焦球菌DNA聚合酶III和εE.亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III

1. 制备E的预培养大肠杆菌菌株TOP10 /的pBAD-α 博士 / PGOOD-ε243在1ml LB-氨苄青霉素-四环素的培养基中孵育8小时，在37℃。稀释1:1000的新鲜培养基和培养O / N在37℃。
2. 稀释1:100的入200ml新鲜的培养基，孵育在37℃下进行3小时，然后诱导3小时与阿拉伯糖和IPTG 1 mM的每种。收获细胞，并将沉淀储存于-20℃。
3. 重悬沉淀在50mM的Tris-HCl pH为8，150 mM氯化钠，1mM EDTA中，1毫PMSF。均质并如2.4和2.5中所述破碎细胞。
4. 立即离心细胞裂解物以10,000×g离心20分钟。弃沉淀。过滤用布氏漏斗装有3层纸过滤上清液。适用于温和的真空。为了避免过多的泡沫，保持真空锥形瓶冰过滤过程中。
5. 根据布拉德福德¹⁴确定蛋白浓度。

4.凝胶过滤层析

1. 平衡水夹套16x70（200）用50mM的Tris-HCl，150mM的氯化钠，1mM EDTA中，pH值8.加载至色谱柱上的可溶性蛋白提取物的凝胶过滤柱。为了获得最佳的分辨率，使用1毫升样品环。 0.6毫升/分钟下进行层析。保持柱温在4℃贯穿。
2. 收集0.9毫升馏分并通过SDS-PAGE分析它们。转移20微升的每个相关部分，以含有60微升的H ₂ O和20微升加样缓冲液（250mM的Tris-盐酸pH值为6.8，10mM的β巯基乙醇，10％（重量/体积）SDS，50％的Eppendorf管中（体积/体积）甘油，0.25％（重量/体积）溴酚蓝），并煮沸5分钟。负载18微升各样品并进行电泳，在140 V为​​约1.5小时。
3. 确定的3'-5'核酸外切酶和每个级分在96我们的DNA聚合酶活性LL微孔板。使用胸苷-5'-单磷酸对硝基苯酯（ 对 NP-TMP）作为基板¹⁵测定的核酸外切酶的活性。估计使用PPX（焦磷酸酶，嘌呤核苷磷酸化酶，黄嘌呤氧化酶）酶偶联测定法¹⁶和DNA聚合酶活性的2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物（INT）的作为电子受体^16。

人群共同表达E.的野生型ε亚基5.突变分析大肠杆菌 DNA聚合酶III和诱变εD12A变

1. 转移大肠杆菌的单个菌落大肠杆菌 TOP10含有的pBAD-ε和^{PGOOD1-εD12A11}矢量到1ml的LB-抗生素培养基中。孵育O / N在37℃。
2. 稀释预培养1:250在3瓶中含有新鲜培养基（10毫升）中，添加相应的诱导剂（阿拉伯糖，IPTG，或阿拉伯糖和IPTG 1 mM的每种）孵育在37℃下8小时。制备平行非诱导培养物。
3. 收集1毫升的等分试样，然后稀释1:在含新鲜培养基（10毫升）中的新培养瓶中500补充或不使用适当的诱导剂。孵育O / N在37℃。
4. 重复步骤5.2和5.3，并收集等分1毫升。
5. 确定发生在各培养世代的数目。转移在LB板，100微升的接种和培养合适的连续稀释。孵育O / N在37℃。算在LB平板上的菌落，并计算细胞中存在的接种物（日志_I）和在培养在生长（日志_C）的端部的数目的对数。要确定代的数量，使用的公式:（日志_ç -登录_{I）/0.301。}
6. 离心机在5000×g离心20分钟，重悬细胞于1ml的50mM的Tris-HCl pH 7.6的50 mM氯化钠。通透细胞，持续20秒添加2-3滴氯仿并涡旋。
7. 确定β-在一个96孔微量每个等分试样的葡糖苷酶活性，使用对 -硝基苯基β-D-吡喃葡糖苷（PNPGluc）作为底物。添加到每孔100μl透化细胞，并加入100μl底物（16毫克/毫升的储备溶液中的H ₂ O）。请注意，以避免气泡孔中。读取吸光度在420nm处，用酶标仪及相应的过滤器。

结果

E.的ε亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III由243个氨基酸，并设有溶解性差^17,18，除非残留187-243删除^17。然而，我们以前曾表明¹¹的共表达的全长α，ε和θ亚基产生可溶的DNA聚合酶III催化核心（ 图1）。特别是，使用的pBAD-PGOOD共表达系统，我们证明:ⅰ）α和ε亚基的过表达能够独立地通过阿拉伯糖和IPTG，分别为（ 图1A）进 ​​行控制; II）全长ε?...

讨论

蛋白质可以是内在无序，设有区域的三级结构不局限于构²⁵的数量有限。这些无序的蛋白质通常容易发生聚集^25，以及它们的分离和表征可能代表一个困难的任务。 E.的ε亚基大肠杆菌 DNA聚合酶III具有两个不同的结构域^26,27，即:i）第N-TER域，轴承的3'-5'外切酶活性，并且在主管结合θ亚基; ⅱ）在C-之三结构域，负责结合到α（聚合酶）亚基。 ε的C之三结?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix