АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Аннотация

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Введение

Введение избыточной экспрессии технологий увеличили либо биохимических исследований низкокопийных количество ферментов и промышленного производства фармакологически активных белков (например, инсулина). С появлением этих технологий, значительные успехи были достигнуты повысить выход и качество рекомбинантных белков. Кроме того, прокариотические 1,2 и эукариот 3 избыточная экспрессия системы были разработаны на протяжении многих лет, предлагая полезные альтернативы "рабочая лошадка" белка биотехнологии, т.е. кишечной палочки. В частности, наличие альтернативных платформ Е. палочка привела к продукции рекомбинантных пептидов или белков, несущих посттрансляционных модификаций. Тем не менее, следует отметить, что E. палочка-прежнему представляет собой организм выбора для получения рекомбинантного белка. Это связано с несколькими факторами, среди которых наиболее актуальными могут бытьсчитается: я) наличие целого ряда избыточной экспрессии систем (векторов экспрессии и деформаций) для E. палочка 1,2; II) раз короткий поколения, и высокие урожаи биомассы, в Е. палочка в различных богатой и синтетической информации; III) манипулирование поверхностным либо на биохимические и на генетическом уровне этого микроорганизма; IV) выделение штаммов, способных производства токсичных белков 4; v) строительство штаммов, показывающих однородной индукции на уровне населения 5,6. Кроме того, недавно было показано, что системы экспрессии, пригодные для производства Е. палочка из посттрансляционно модифицированных белков могут быть разработаны и изготовлены 2.

В настоящее время белок избыточная экспрессия в основном используется для получения мономерных или гомо-олигомерный белок, чье hypersynthesis могут быть выполнены с помощью одного гена, клонированного в соответствующем плазмиды. Тем не менее, внимание было недавноуделено построению Е. палочки белковых систем совместной экспрессии, сложные производства, в естественных условиях, гетероструктур-олигомерные комплексы 2. Интересно, что первые эксперименты белковой коэкспрессии обратился к межвидовое сборку больших и малых субъединиц цианобактерий рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу / оксигеназа 7,8 и Ассоциация укороченных и полнометражных форм ВИЧ-1 обратной транскриптазы 9. Эти пионерские исследования показали, что белок ко-экспрессия представляет собой мощный альтернативой традиционным в пробирке восстановления. Кроме того, белок совместная экспрессия в Е. палочки использовали для получения различных белков, несущих посттрансляционных модификаций 2, чтобы получить белки, содержащие неприродные аминокислоты 2, и увеличить выход избыточной экспрессии мембранных белков 2. Кроме того, потенциал белка коэкспрессии в качестве инструмента для придания Е. палочка конкурироватьсть в секреции белка находится в стадии активной расследования 2.

Две основные стратегии белка сотрудничества экспрессии в E. палочка может осуществляться: я) использование одного плазмиды на проведение различных генов сверхэкспрессируется; б) использование нескольких плазмид в единичных клетках, чтобы совместно выразить целевые белки. В первом случае критерии выбора плазмиды не отличаются от тех, традиционных отдельных экспериментов белок избыточной экспрессии, хотя отдельные плазмиды, содержащие тандем элементы промотора / оператора были построены для совместной экспрессии 10. Это первый подход, следовательно, довольно просто. Тем не менее, следует отметить, что использование одного плазмиды совместно выражают различные белки сталкивается с двумя основными трудностями: я) молекулярная масса векторных увеличивается с увеличением количества размещенных генов, ограничивающих количество совместных выразил белков; б) при множественные гены клонируют под контролем единственного промотора, полярность может decreasе экспрессию генов дистальных от промотора. Использование двойных или множественных плазмид в одной Е. палочки клетки должна выполнить совместимость векторов выбора, поэтому введение ограничений на это право комбинаций плазмид. Тем не менее, этот второй стратегии совместная экспрессия есть преимущество, содержащий молекулярную массу векторов, и ограничивает полярность. Мы недавно построили систему совместной экспрессии белка, направленных на облегчение челночного генов между плазмид Коэкспрессия 11. В частности, мы построили серию pGOOD векторы, соответствующие чертами которого являются: я) p15A начала репликации, чтобы обеспечить совместимость pGOOD плазмид с коммерческими векторов, содержащих ColE1 происхождение (например, серии pBAD 12); II) кассета тетрациклина сопротивление; III) наличие Lac -derived регуляторные элементы, т.е. Промоутер-оператора (O 1) пару и Лачи ген д. С помощью соответствующего pBAD-pGOOD пара, мы смогли сверхэкспрессировать каталитическую ядро Е. полимеразной палочка ДНК III, состоящий из трех разных субъединиц, т.е. α ('полимеразы ε (3'-5 5'-3) "экзонуклеазную) и θ (стабилизирующий ε) 13. В частности, мы показали, что совместная экспрессия с αεθ комплекса строго зависит от дополнение к Е. палочка культуральную среду как IPTG и арабинозы, вызывая избыточная экспрессия от pGOOD и pBAD, соответственно (рис 1А).

В настоящем докладе, мы показывают, как белок, совместная экспрессия может эффективно решать проблемы, связанные с плохой растворимости белкового комплекса субъединицы. Кроме того, мы покажем, как в естественных условиях белковых тестов комплементационных могут быть выполнены, и мы, наконец, доклад об использовании белка коэкспрессии частоте мутаций настроиться на Е. седлоя. С этой целью мы использовали pGOOD-pBAD пары подходящих для иллюстрации соответствующие примеры каждого конкретного случая.

протокол

1. Выделение Е. палочка Co-трансформантов

  1. Подготовка электро-компетентные клетки E. соответствующей Штамм должны быть преобразованы. Переход к 1 мл LB среды (триптона, дрожжевого экстракта, NaCl в 10, 5 и 10 г / л, соответственно) одной колонии штамма выбора, и инкубируют при 37 ° C при встряхивании условиях 180 оборотов в минуту. Развести предварительной культуры 1: 500 в 25 мл свежей LB среде и инкубируют культуры при 37 ° С.
  2. В лог-фазы (0,6 OD) центрифуги суспензию клеток при 5000 х г в течение 20 мин), и ресуспендируют осадок в 10%, об / об ледяной стерильной глицерина и воды в половине первоначального объема культуры. Повторите этот шаг 4 раза, вдвое каждый раз, когда объем ресуспендирования. И, наконец, ресуспендируют осадок в глицерине / воде и разделить суспензии клеток в 50 мкл аликвоты. Храните аликвоты при -80 ° С до 6 месяцев.
  3. Растворите нужную плазмиду в стерильной воде с добавлением 0,5 мМ ЭДТА. Оттепель на ICе аликвоту электро-компетентных клеток и смешать с соответствующим количеством (2,5-5 нг) вектора. Разлить смесь в 0,1 см кювету, подходящей для электропорации, и применять 1,8 кВ.
  4. Немедленно передать электропорации клетки в 1 мл SOC среды (LB среде, дополненной 0,2% м / о глюкозы, 10 мМ MgCl 2, 2,5 мМ KCl), инкубируют в течение 1 ч при встряхивании, и, наконец, перевести 100 мкл аликвоты в чашки Петри, содержащие LB-агар с соответствующим антибиотиком. Инкубируйте O / N при 37 ° С.
  5. Очищают трансформантов полос отдельных колоний на чашках Петри.
  6. Подготовка электро-компетентных клеток первичных трансформантов и повторите шаги 1,1 до 1,5 для преобразования с дальнейшими плазмид.
  7. Подготовка глицерина запасы со-трансформантов. Передача одну колонию в LB с добавлением соответствующих антибиотиков, инкубировать при 37 ° С при встряхивании, и в лог-фазы (OD) 0,6 центрифуге суспензии клеток при 5000 х г в течение 20 мин. Resuspend осадок в LB-среду, содержащую антибиотики 15% об / об глицерин. Не включать в аликвоты и хранят при температуре - 80 ° С.

2. Совместная экспрессия α и ε-субъединиц Е. ДНК полимеразой III

  1. Трансфер стерильной петлей небольшое количество соответствующего штамма глицерина акций (например, TOP10 / pGOOD-ε243 и TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, рис 1) в чашку Петри, содержащую LB среды и антибиотики. Пусть суспензии клеток высыхать на чашке Петри, и серию клетки капли. Инкубируют при 37 ° CO / N.
  2. Переводом, с помощью стерильной зубочистки, одну колонию на 1 мл LB-антибиотиков среды. Инкубируйте 8 ч при 37 ° С. Развести предварительной культуры 1: 500 в свежей среде и инкубируют при 30 ° С в течение 15 ч.
  3. Добавить IPTG, арабинозу, или арабинозу и IPTG, 1 мМ каждого. Инкубируют при 30 ° С в течение 2,5 ч. Сбор клеток и хранить гранулы при температуре -20 ° С.
  4. Оттаивания гранулы на льду и ресуспендируют в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2,5 мМ дитиотреитола, 1 мМ фторофенилметилсульфонил (ФМСФ), рН 8). Аккуратно гомогенизации суспензии клеток с холодным стекла гончара.
  5. Ультразвук на 15 Вт для 15 сек, с последующим 15 сек интервалом охлаждения (4 цикла).
  6. Центрифуга общего белка экстракты при 10000 х г в течение 20 мин, при 4 ° С для восстановления растворимой фракции.
  7. Анализ с помощью ДСН-ПААГ (12,5% акриламида) аликвот каждого растворимого экстракта белка. С этой целью передачи 20 мкл каждого растворимого экстракта белка в пробирки Эппендорфа, содержащие 60 мкл H 2 O и 20 мкл загрузочного буфера (250 мМ Трис-HCl рН 6,8, 10 мМ β-меркаптоэтанола, 10% (вес / объем) SDS, 50% (об / об) глицерина, 0,25% (вес / объем) бромфенола синего) и кипятят в течение 5 мин. Нагрузка 18 мкл каждого образца и выполнения электрофореза при 140 V в течение приблизительно 1,5 ч.

3. Совместная экспрессия α-субъединицы DeinococCUS radiodurans ДНК-полимеразы III и ε-субъединицы Е. ДНК полимеразой III

  1. Подготовка предварительной культуры Е. штамм TOP10 / pBAD-α DR / pGOOD-ε243 в 1 мл LB-ампициллин-среде тетрациклина и инкубировать 8 ч при 37 ° С. Развести 1: 1000 в свежей среде и инкубируют O / N при 37 ° С.
  2. Развести 1: 100 в 200 мл свежей среды, инкубировать при 37 ° С в течение 3 ч, затем индуцируют в течение 3 ч с арабинозы и IPTG, 1 мМ каждого. Сбора клеток и хранить осадок при -20 ° С.
  3. Ресуспендируют осадок в 50 мМ Трис-HCl рН 8, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF. Перемешать и разрушения клеток, как описано в 2.4 и 2.5.
  4. Сразу центрифуге лизат клеток при 10000 мкг в течение 20 мин. Откажитесь от гранул. Фильтр супернатант с воронке Бюхнера, снабженной 3 слоев бумажного фильтра. Слегка вакуум. Чтобы избежать чрезмерного вспенивания, держите вакуумный колбу Эрленмейера на льду во время фильтрации.
  5. Определить концентрацию белка в соответствии с Bradford 14.

4. гель-фильтрации

  1. Равновесие с водяной рубашкой 16x70 (200) гель-фильтрационную колонку с 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8. Нагрузка на колонку растворимый белковый экстракт. Для оптимального разрешения использовать петли для образца 1 мл. Выполните хроматографии на 0,6 мл / мин. Поддерживать температуру колонки при 4 ° С в течение.
  2. Собирают 0,9 мл-вые фракции и анализировать их с помощью SDS-PAGE. Передача 20 мкл каждого соответствующего фракции в пробирки Эппендорфа, содержащие 60 мкл H 2 O и 20 мкл загрузочного буфера (250 мМ Трис-HCl рН 6,8, 10 мМ β-меркаптоэтанола, 10% (вес / объем) SDS, 50% ( объем / объем) глицерина, 0,25% (вес / объем) бромфенола синего) и кипятят в течение 5 мин. Нагрузка 18 мкл каждого образца и выполнения электрофореза при 140 V в течение приблизительно 1,5 ч.
  3. Определение 3'-5 'экзонуклеазы и ДНК-полимеразную активность каждой фракции в 96-WELL планшетов. Анализ на экзонуклеазной активности с использованием тимидина 5'-монофосфат п-нитрофенил сложный эфир (р NP-TMP) в качестве субстрата 15. Расчетный ДНК-полимеразной активности с помощью ППК (пирофосфатазы, фосфорилазы пуринового нуклеозида, ксантиноксидазы) фермента в сочетании-анализа 16 и 2- (4-иодфенил) -3- (4-нитрофенил) хлорида -5-фенил-2H-тетразолия (INT) как акцептор электронов 16.

5. Мутация анализа популяций коэкспрессирующей дикого типа ε-субъединицы Е. ДНК полимеразой III и мутагенного εD12A Вариант

  1. Трансфер единственная колония E. палочка TOP10 содержащий pBAD-ε и pGOOD1-εD12A 11 векторов на 1 мл LB-антибиотиков среды. Инкубируйте O / N при 37 ° С.
  2. Развести предварительной культуры 1: 250 в 3 колбы, содержащие свежую среду (10 мл), добавить соответствующие индукторы (арабинозы, IPTG или арабиноза и IPTG, 1 мМ каждый) и инкубируют при 37 ° Св течение 8 ч. Подготовка в параллельных не-индуцированной культур.
  3. Сбор аликвоты 1 мл, а затем разбавленной 1: 500 в новые флаконы, содержащие свежую среду (10 мл) с добавлением или нет с соответствующими индукторами. Инкубируйте O / N при 37 ° С.
  4. Повторите шаги 5,2 и 5,3 и собирать аликвоты 1 мл.
  5. Определить число поколений произошла в каждой культуре. Передача на LB пластины, 100 мкл соответствующих серийных разведений инокулята и культуры. Инкубируйте O / N при 37 ° С. Количество колоний на пластинах LB, и вычислить журнал числа клеток, присутствующих в инокулята (войти I), так и в культуре в конце роста (лог C). Для определения количества поколений, определяется по формуле: (войти C - войти I) /0.301.
  6. Центрифуга при 5000 х г в течение 20 мин и клетки вновь суспендируют в 1 мл 50 мМ Трис-HCl рН 7,6, 50 мМ NaCl. Для клетки проницаемыми, добавить 2-3 капель хлороформа и вихря в течение 20 сек.
  7. Определить β-глюкозидазы из каждой аликвоты в микропланшет в 96-луночный, с использованием п-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид (PNPGluc) в качестве субстрата. Добавить в каждую лунку по 100 мкл проницаемыми клеток и 100 мкл субстрата (16 мг / мл маточного раствора в H 2 O). Будьте осторожны, чтобы избежать воздушных пузырей в лунках. Измерить абсорбцию при 420 нм с использованием микропланшет-ридера и соответствующий фильтр.

Результаты

The ε subunit of E. coli DNA polymerase III consists of 243 amino acids and features poor solubility17,18, unless the residues 187-243 are deleted17. However, we have previously shown11 that the co-expression of full-length α, ε, and θ subunits yields soluble DNA polymerase III catalytic core (Figure 1). In particular, using the pBAD-pGOOD co-expression system, we demonstrated that: i) the overexpression of α and ε subunits can be in...

Обсуждение

Proteins can be intrinsically disordered, featuring regions whose tertiary structure is not restricted to a limited number of conformations25. These disordered proteins are usually prone to aggregation25, and their isolation and characterization might represent a difficult task. The ε subunit of E. coli DNA polymerase III features two distinct domains26,27, namely: i) the N-ter domain, bearing the 3’-5’ exonuclease activity, and competent in binding the θ su...

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

The permission by Springer and Elsevier to reprint figures is greatly acknowledged.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
AgarSigma-AldrichA1296
AmpicillinSigma-AldrichA9518
ChloroformSigma-Aldrich288306
EDTASigma-AldrichEDS
GlycerolSigma-AldrichG5516
INTSigma-AldrichI8377
IPTGSigma-AldrichI5502
KClSigma-AldrichP9541
L-ArabinoseSigma-AldrichA3256
MgCl2Sigma-AldrichM2670
NaClSigma-Aldrich31434
PMSFSigma-AldrichP7626
PNP-glucSigma-AldrichN7006
pNP-TMPSigma-AldrichT0251
TetracyclinSigma-Aldrich87128
Trizma base Sigma-AldrichT1503
TryptoneSigma-Aldrich95039
Yeast extractFluka70161
Acrylamide solution 30%BioRad161-0158For gel electrophoresis
Ammonium persolphateBioRad161-0700For gel electrophoresis
GlycineBioRad161-0718For gel electrophoresis
SDSBioRad161-0302For gel electrophoresis
TEMEDBioRad161-0800For gel electrophoresis
TrisBioRad161-0719For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cmBioRad1652089For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415REppendorf
Centrifuge Allegra 21RBeckman
Chromatography apparatus GradiFracPharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporationBioRad
Microplate Reader 550Biorad
MiniProtean 3 cellBioRad
Power SupplyBioRad
Sonicator 3000Misonix

Ссылки

  1. Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
  2. Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
  3. Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
  4. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  5. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
  6. Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
  7. Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
  8. Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
  9. Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
  10. Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
  11. Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
  12. Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  13. McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
  16. Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
  17. DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
  18. Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
  19. Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
  20. Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
  21. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  22. Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
  23. Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
  24. Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
  25. Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, (2008).
  26. Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
  27. Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
  28. Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
  29. Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
  30. Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
  31. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  32. Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E., McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Protein Co expressionEscherichia ColiDNA Polymerase IIIDNA Polymerase ActivityProtein ComplexSubunit AssociationMutation FrequencyArabinoseIPTGIn Vivo Expression

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены