Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

Résumé

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Résumé

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduction

L'introduction des technologies de surexpression soit stimulé les études biochimiques du faible nombre de copies enzymes et la production industrielle de protéines pharmacologiquement actives (par exemple, l'insuline). Depuis l'avènement de ces technologies, des progrès significatifs ont été réalisés pour augmenter le rendement et la qualité des protéines recombinantes. En outre, ^1,2 procaryotes et eucaryotes ³ ​​systèmes de surexpression ont été développés au cours des années, offrant des alternatives utiles à la "cheval de travail" de la biotechnologie de la protéine, ce est à dire, Escherichia coli. En particulier, la disponibilité des plates-formes alternatives à E. coli conduit à la production de peptides ou de protéines portant des modifications post-traductionnelles de recombinaison. Toutefois, il convient de mentionner que E. coli représente encore l'organisme de choix pour la production de protéines recombinantes. Cela est dû à plusieurs facteurs, parmi lesquels peuvent être les plus pertinentsconsidéré: i) la disponibilité d'un certain nombre de systèmes de surexpression (vecteurs d'expression et souches) pour E. coli ^1,2; ii) fois le court de production, et des rendements élevés de la biomasse, de E. coli dans une variété de médias riche et synthétique; iii) la manipulation facile, soit à la substance biochimique et génétique au niveau de ce micro-organisme; iv) l'isolement de souches capables de produire des protéines toxiques ^4; v) la construction de souches présentant induction homogène au niveau de la population ^5,6. En outre, il a été récemment montré que des systèmes d'expression appropriés pour la production dans E. coli de protéines modifications post-traductionnelles peut être conçu et construit ^deux.

À l'heure actuelle, surexpression de la protéine est principalement utilisé pour obtenir des protéines monomères ou homo-oligomères, dont hypersynthése peut être réalisée avec un seul gène cloné dans un plasmide approprié. Toutefois, l'attention a récemment étéversée à la construction de E. systèmes protéines co-expression coli, contestant la production, in vivo, de complexes hétéro-oligomères ^2. Fait intéressant, les premières expériences de protéines co-expression adressé à l'Assemblée inter-espèces de grands et de petits sous-unités de carboxylase cyanobactéries ribulose-1,5-bisphosphate / oxygénase ^7,8, et l'association des formes tronquées et pleine longueur du VIH-1 transcriptase inverse ^neuf. Ces études pionnières ont démontré que la protéine co-expression représente une alternative puissante et traditionnelles dans la reconstitution in vitro. En outre, la protéine co-expression dans E. coli a été utilisée pour produire différentes protéines portant des modifications post-traductionnelles ^2, pour obtenir des protéines contenant des acides aminés non naturels ^2, et d'augmenter le rendement des protéines membranaires surexprimés ^2. En outre, le potentiel de la protéine co-expression en tant qu'outil de conférer à E. coli concurrencence dans la sécrétion de protéines est sous enquête active ^2.

Deux principales stratégies de protéines co-expression dans E. coli peut être poursuivi: i) l'utilisation d'un seul plasmide d'accueillir les différents gènes pour être surexprimé; ii) l'utilisation de plusieurs plasmides dans des cellules individuelles pour co-exprimer les protéines cibles. Dans le premier cas, les critères pour le choix du plasmide ne diffèrent pas de ceux des expériences traditionnelles protéines de surexpression simples, bien que particulier des plasmides contenant des éléments promoteur / opérateur en tandem ont été construits pour la co-expression ^10. Cette première approche est donc très simple. Toutefois, il convient de mentionner que l'utilisation d'un seul plasmide de co-exprimer des protéines différentes se heurte à deux difficultés majeures: i) la masse moléculaire du vecteur augmente avec le nombre de gènes hébergés, ce qui limite le nombre de protéines co-exprimées; ii) lorsque plusieurs gènes sont clones sous le contrôle d'un promoteur unique, la polarité peut dimienvoyer l'expression des gènes à partir du promoteur distal. L'utilisation de plasmides double ou multiple unique dans E. cellules coli doit accomplir la compatibilité des vecteurs de choix, donc imposer des contraintes aux combinaisons admissibles de plasmides. Toutefois, cette deuxième stratégie de co-expression comporte l'avantage de contenir la masse moléculaire de vecteurs, et limite la polarité. Nous avons récemment construit un système de co-expression de protéines conçu pour faciliter le mouvement alternatif de gènes entre les plasmides co-expression ^11. En particulier, nous avons construit la série de vecteurs de pgood, les éléments pertinents qui sont: i) une origine de p15A de réplication, pour assurer la compatibilité des plasmides pgood avec les vecteurs commerciaux contenant l'origine ColE1 (par exemple, la série pBAD ^12); ii) une cassette de résistance à la tetracycline; iii) la présence du lac -derived éléments de régulation, ce est à dire, le promoteur-opérateur (O ₁₎ En couple et la LACI ^{q gène.} Utiliser un couple pBAD-pgood appropriée, nous avons pu surexpriment le noyau catalytique de E. coli DNA polymerase III, composé de trois sous-unités différentes, ce est-α (la polymerase, ε (3'-5'-3 '5)' exonucléase) et θ (ε stabilisant) ^13. En particulier, nous avons démontré que la co-expression du complexe de αεθ était strictement dépendante de l'ajout de la E. coli milieu de culture à la fois de l'IPTG et arabinose, le déclenchement et la surexpression de pgood pBAD, respectivement (figure 1A).

Dans le présent rapport, nous illustrons comment des protéines co-expression peut résoudre efficacement les difficultés liées à la faible solubilité d'une protéine sous-unité complexe. En outre, nous montrons comment dans des tests de complémentation de protéines in vivo peut être effectuée, et nous rapportons enfin sur l'utilisation de protéines co-expression de régler la fréquence de mutation dans E. coli. Dans ce but, nous avons utilisé les couples pgood-PBAD appropriés pour illustrer des exemples pertinents de chaque étude de cas.

Protocole

1. Isolement de E. coli co-transformants

1. Préparer des cellules électro-compétentes du E. appropriée coli souche à transformer. Transfert à 1 ml de milieu LB (tryptone, extrait de levure, NaCl à 10, 5 et 10 g / l, respectivement) d'une seule colonie de la souche de choix, et incuber à 37 ° C dans des conditions de secousse, 180 tours par minute. Diluer la pré-culture 1: 500 dans 25 ml de milieu LB frais et on incube la culture à 37 ° C.
2. Au journal phase (0,6 OD) centrifuger la suspension de cellules à 5000 g pendant 20 minutes), et remettre en suspension le culot dans 10%, v / v glacée eau-glycérol stérile dans la moitié du volume de la culture d'origine. Répétez cette étape 4 fois, de réduire de moitié chaque fois le volume de la remise en suspension. Enfin, remettre le culot dans du glycérol / eau et diviser la suspension des cellules dans 50 aliquotes. Stocker les aliquots à -80 ° C jusqu'à 6 mois.
3. Dissoudre le plasmide désiré dans l'eau stérile supplémenté avec 0,5 mM d'EDTA. Thaw sur ice une aliquote de cellules électro-compétentes et mélanger avec une quantité appropriée (2,5-5 ng) du vecteur. Verser le mélange dans une cuvette de 0,1 cm convient pour l'électroporation, et appliquer 1,8 kV.
4. Transférer immédiatement les cellules électroporées dans 1 ml de milieu SOC (milieu LB complété avec 0,2% p / v de glucose, 10 mM de _MgCl2, 2,5 mM de KCl), incuber pendant 1 h sous agitation, et enfin le transfert des aliquotes de 100 ul à des boîtes de Pétri contenant agar LB avec l'antibiotique approprié. Incuber O / N à 37 ° C.
5. Purifier les transformants en stries des colonies isolées sur des boîtes de Pétri.
6. Préparer des cellules électro-compétentes des transformants primaires et répétez les étapes 1.1 à 1.5 pour transformer avec d'autres plasmides.
7. Préparer des stocks de glycerol des co-transformants. Transfert d'une seule colonie dans LB supplémenté avec les antibiotiques appropriés, incuber à 37 ° C sous agitation, et au journal phase (0,6 OD) centrifuger la suspension de cellules à 5000 g pendant 20 min. Resuspend le culot dans du milieu LB contenant les antibiotiques-support 15% v / v glycérol. Répartir en aliquotes et stocker à - 80 ° C.

2. Co-expression des sous-unités α et ε de E. coli DNA polymerase III

1. Transfert avec une boucle stérile une petite quantité du stock de glycérol de souche appropriée (par exemple, TOP10 / pgood-ε243 et TOP10 / pgood-ε243-θ / pBADα1160, voir la figure 1) dans une boîte de Pétri contenant le milieu LB et des antibiotiques. Laissez le suspension de cellules sec sur la boîte de Pétri, et série les cellules gouttelettes. Incuber à 37 ° CO / N.
2. Transfert, en utilisant un cure-dents stérile, une colonie unique de 1 ml de milieu LB-antibiotiques. Incuber 8 h à 37 ° C. Diluer la pré-culture 1: 500 dans du milieu frais et on incube à 30 ° C pendant 15 heures.
3. Ajouter IPTG, l'arabinose, ou l'arabinose et IPTG, 1 mM chacun. Incuber à 30 ° C pendant 2,5 heures. Recueillir les cellules, et de stocker les granulés à -20 ° C.
4. Décongeler les pastilles sur de la glace et remettre en suspension dans du tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 2,5 mM de dithiothréitol, du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM (PMSF), pH 8). Homogénéiser doucement la suspension de cellules avec un potier de verre à froid.
5. Soniquer à 15 W pendant 15 secondes, suivie de 15 sec temps de refroidissement (4 cycles).
6. Centrifuger les extraits de protéines totales à 10 000 xg pendant 20 min, à 4 ° C pour récupérer la fraction soluble.
7. Analyse par SDS-PAGE (12,5% d'acrylamide) des fractions aliquotes de chaque extrait protéique soluble. Dans ce but, transférer 20 pi de chaque extrait protéique soluble dans des tubes Eppendorf contenant 60 ul de _H2O et 20 ul de tampon de chargement (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% (p / v) SDS, 50% (v / v) de glycerol, 0,25% (p / v) de bleu de bromophénol) et faire bouillir pendant 5 min. Charge 18 pi de chaque échantillon et effectuer la électrophorèse à 140 V pendant environ 1,5 h.

3. Co-expression de α sous-unité de Deinococradiodurans cus ADN polymérase III et ε sous-unité de E. coli DNA polymerase III

1. Préparer un pré-culture de l'E. coli souche TOP10 / Dr pBAD-α / pgood-ε243 dans 1 ml de milieu LB-ampicilline tétracycline et incuber 8 h à 37 ° C. Diluer 1: 1000 dans un milieu frais et incuber O / N à 37 ° C.
2. Diluer 1: 100 dans 200 ml de milieu frais, incuber à 37 ° C pendant 3 heures, puis induire pendant 3 heures avec l'arabinose et IPTG, 1 mM de chacun. Récolter les cellules, et de stocker le culot à -20 ° C.
3. Reprendre le culot dans 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogénéiser et perturber les cellules comme décrit dans 2.4 et 2.5.
4. Centrifuger immédiatement les cellules lysat à 10 000 g pendant 20 min. Jeter le culot. Filtrer le surnageant avec un entonnoir Büchner équipé avec trois couches de papier filtre. Appliquer une dépression douce. Pour éviter un excès de mousse, garder le vide erlenmeyer sur la glace lors de la filtration.
5. Déterminer la concentration en protéine selon Bradford ^14.

4. Filtration sur gel Une Chromatographie

1. Equilibrer un 16x70 chemise d'eau (200) colonne de filtration sur gel avec 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, pH 8. charge sur la colonne de l'extrait protéique soluble. Pour une résolution optimale, utiliser une boucle échantillon de 1 ml. Effectuer la chromatographie à 0,6 ml / min. Maintenir la température de la colonne à 4 ° C tout au long.
2. Récupérer 0,9 ml des fractions et de les analyser par SDS-PAGE. Transférer 20 pl de chaque fraction en rapport avec des tubes Eppendorf contenant 60 ul de _H2O et 20 ul de tampon de chargement (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% (p / v) de SDS, 50% ( v / v) de glycérol, 0,25% (p / v) bleu bromophénol) et faire bouillir pendant 5 min. Charge 18 pi de chaque échantillon et effectuer la électrophorèse à 140 V pendant environ 1,5 h.
3. Déterminer l'exonucléase 3'-5 et de l'activité d'ADN polymérase de chaque fraction dans 96 nousll microplaques. Doser l'activité d'exonucléase en utilisant la thymidine 5'-monophosphate ester de p-nitrophényle (p NP-TMP) comme substrat ^15. Estimer une activité de polymerase d'ADN en utilisant le PPX (Pyrophosphatase, la purine nucléoside phosphorylase, la xanthine oxydase) enzyme couplé à essai ¹⁶ et de 2- (4-iodo-phényl) -3- (4-nitrophényl) de chlorure -5-phényl-2H-tétrazolium (INT) comme accepteur ¹⁶ d'électrons.

5. Mutation analyse des populations co-exprimant le type sauvage ε sous-unité de E. coli ADN polymérase III et l'mutagènes εD12A Variant

1. Transférer une seule colonie de E. coli TOP10 contenant le pBAD-ε et les pGOOD1-εD12A ¹¹ vecteurs à 1 ml de milieu LB-antibiotiques. Incuber O / N à 37 ° C.
2. Diluer la pré-culture 1: 250 dans des flacons contenant du milieu frais 3 (10 ml), ajouter les inducteurs appropriés (arabinose, de l'IPTG, et de l'arabinose ou de l'IPTG 1 mM chacun) et incuber à 37 ° Cpendant 8 heures. Préparation de cultures parallèles non induit.
3. Recueillir des aliquotes de 1 ml, puis diluer 1: 500 dans de nouveaux flacons contenant du milieu frais (10 ml) supplémenté ou non avec les inducteurs appropriés. Incuber O / N à 37 ° C.
4. Répétez les étapes 5.2 et 5.3 et de recueillir des aliquotes de 1 ml.
5. Déterminer le nombre de générations est produit dans chaque culture. Transfert sur des plaques LB, 100 pi de dilutions en série appropriées d'inoculum et de la culture. Incuber O / N à 37 ° C. Compter les colonies sur des plaques LB, et calculer le logarithme du nombre de cellules présentes dans l'inoculum (log _I) et dans la culture à la fin de la croissance (log _C). Pour déterminer le nombre de générations, utiliser la formule: (log _C - log _I) /0.301.
6. Centrifuger à 5000 xg pendant 20 min et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM de NaCl. Pour perméabiliser les cellules, ajouter 2 à 3 gouttes de chloroforme et vortex pendant 20 s.
7. Déterminer la β-glucosidase de chaque aliquote dans une microplaque à 96 puits, en utilisant du p-nitrophényl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc) comme substrat. Ajouter à chaque puits 100 pi de cellules perméabilisées et 100 pi de substrat (16 mg / ml solution mère dans H ₂ O). Prenez soin d'éviter les bulles d'air dans les puits. Lire l'absorbance à 420 nm, en utilisant un lecteur de microplaques et le filtre approprié.

Résultats

La sous-unité ε de E. coli l'ADN polymérase III se compose de 243 acides aminés et dispose d'une faible solubilité ^17,18, à moins que les résidus 187 à 243 sont supprimés ^17. Cependant, nous avons précédemment montré ¹¹ que la co-expression de α-métrages, ε, et sous-unités θ donne soluble ADN polymérase III noyau catalytique (figure 1). En particulier, en utilisant le système pBAD-pgood co-expression, nous avons démontré que: i) la s...

Discussion

Les protéines peuvent être intrinsèquement désordonnée, avec des régions dont la structure tertiaire ne est pas restreinte à un nombre limité de conformations ^25. Ces protéines désordonnées sont généralement sujettes à l'agrégation ^25, et de leur isolement et la caractérisation pourraient représenter une tâche difficile. La sous-unité ε de E. coli DNA polymerase III possède deux domaines distincts ^26,27, à savoir: i) le domaine N-ter, portant la 'ac...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix