As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

Resumo

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Resumo

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introdução

A introdução de tecnologias superexpressão potenciado quer os estudos bioquímicos de baixo número de cópias enzimas Número e a produção industrial de proteínas farmacologicamente activas (por exemplo, insulina). Desde o advento das tecnologias, avanços significativos foram conseguidos para aumentar o rendimento e a qualidade de proteínas recombinantes. Além disso, ^1,2 procariotas e eucariotas ³ sistemas superexpressão foram desenvolvidos ao longo dos anos, oferecendo alternativas úteis para o "cavalo de trabalho" da biotecnologia proteína, ou seja, Escherichia coli. Em particular, a disponibilidade de plataformas alternativas para E. coli levou à produção de péptidos recombinantes ou proteínas de rolamento modificações pós-traducionais. No entanto, deve ser mencionado que a E. coli ainda representa o organismo de eleição para a produção de proteína recombinante. Isso se deve a vários fatores, entre os quais o mais relevante pode serconsiderado: i) a disponibilidade de um grande número de sistemas de sobre-expressão (vectores de expressão e estirpes) para E. coli ^1,2; ii) vezes a curto geração e de alto rendimento de biomassa, de E. coli em uma variedade de mídia rica e sintética; iii) a manipulação fácil, quer a bioquímica e genética ao nível deste microrganismo; iv) o isolamento das estirpes capazes de produção de proteínas tóxicas ^4; v) a construção de cepas que caracterizam indução homogênea a nível da população ^5,6. Além disso, demonstrou-se recentemente que os sistemas de expressão adequados para a produção em E. coli de proteínas modificadas pós-tradução podem ser concebidos e construídos ^2.

Actualmente, a sobre-expressão da proteína é utilizada, principalmente, para obter proteínas monoméricas ou homo-oligoméricas, cuja hypersynthesis pode ser realizado com um único gene clonado num plasmídeo adequado. No entanto, a atenção foi recentementepago para a construção de E. sistemas de proteína co-expressão de E. coli, desafiando a produção, in vivo, de complexos hetero-oligomérica ^2. Curiosamente, os primeiros experimentos de proteína co-expressão se dirigiu à assembléia inter-espécies de grandes e pequenas subunidades de carboxylase cianobactérias ribulose-1,5-bisfosfato / oxigenase ^7,8, ea associação de formas truncadas e de corpo inteiro de HIV-1 transcriptase reversa ^9. Estes estudos pioneiros demonstrado que a co-expressão da proteína representa uma poderosa alternativa ao tradicional na reconstituição in vitro. Além disso, a proteína co-expressão em E. coli foi utilizado para produzir diferentes proteínas que ostentam modificações pós-traducionais ^2, para se obter proteínas que contêm aminoácidos não naturais ^2, e para aumentar o rendimento de proteínas de membrana overexpressed ^2. Além disso, o potencial de co-expressão da proteína como uma ferramenta para conferir a E. coli competirnce na secreção de proteínas está sob investigação ativa ^2.

Duas estratégias principais de co-expressão da proteína em E. coli pode ser prosseguido: i) o uso de um único plasmídeo para receber os diferentes genes a ser sobre-expresso; ii) a utilização de vários plasmídeos em células individuais para co-expressar as proteínas alvo. No primeiro caso, os critérios para a escolha do plasmídeo não diferem dos de experiências individuais tradicionais sobre-expressão da proteína, embora determinados plasmídeos contendo em tandem os elementos promotor / operador foram construídos para co-expressão ^{de 10.} Esta primeira abordagem é, portanto, bastante simples. No entanto, deve mencionar-se que o uso de um único plasmídeo de co-expressar proteínas diferentes enfrenta dois grandes problemas: i) a massa molecular do vector aumenta com o número de genes que alberguem, limitando o número de proteínas co-expressas; ii) quando vários genes foram clonados sob o controlo de um único promotor, de polaridade pode decreasum e a expressão dos genes distais do promotor. O uso de plasmídeos duplos ou múltiplos no único E. células de E. coli tem de realizar o grau de compatibilidade dos vectores de escolha, por conseguinte, a imposição de restrições para as combinações de plasmídeos elegíveis. No entanto, esta segunda estratégia de co-expressão apresenta a vantagem de conter a massa molecular de vectores, e limita polaridade. Construiu-se, recentemente, um sistema de co-expressão de proteínas concebido para facilitar o vaivém de genes entre os plasmídeos de co-expressão de ^11. Em particular, nós construídos vectores da série pGOOD, as características relevantes dos quais são os seguintes: i) uma origem de replicação de p15A, para proporcionar a compatibilidade dos plasmídeos pGOOD com os vectores comerciais contendo a origem ColE1 (por exemplo, a série de pBAD ^12); ii) uma cassete de resistência à tetraciclina; iii) a presença de lac -derived elementos reguladores, ou seja, o promotor-operador (O ₁₎ casal eo lacI gene ^q. Usando um par pBAD-pGOOD disso, fomos capazes de overexpress o núcleo catalítico de E. coli ADN polimerase III, composto por três subunidades diferentes, ou seja, α (5'-3 'da polimerase), ε (3'-5' exonuclease) e θ (estabilizador ε) ^13. Em particular, foi demonstrado que a co-expressão do complexo αεθ era estritamente dependente da adição à E. coli meio de cultura de ambos IPTG e arabinose, provocando a sobre-expressão de pBAD pGOOD e, respectivamente (Figura 1A).

No presente relatório, que ilustram como proteína co-expressão pode eficientemente resolver dificuldades relacionadas com a baixa solubilidade de uma proteína subunidade complexo. Além disso, mostramos como em testes de complementação de proteína vivo pode ser realizada, e, finalmente, um relatório sobre a utilização de proteínas co-expressão a frequência de mutação sintonizar E. coleu. Para tal, utilizou-se casais pGOOD-pBAD adequados para ilustrar exemplos relevantes de cada estudo de caso.

Protocolo

1. Isolamento de E. coli co-transformantes

1. Prepare células eletro-competente do E. apropriado coli estirpe a ser transformada. Transferência para 1 ml de meio LB (triptona, extracto de levedura, NaCl a 10, 5 e 10 g / L, respectivamente) de uma única colónia da estirpe de escolha, e incubar a 37 ° C sob condições de agitação de 180 rpm. Dilui-se a pré-cultura de 1: 500 em 25 ml de meio LB fresco e incuba-se a cultura a 37 ° C.
2. Na fase de log (0,6 OD) centrifugar a suspensão de células em 5000 xg durante 20 min), e ressuspender o sedimento em 10%, v / v arrefecido em gelo estéril de glicerol-água em metade do volume de cultura original. Repita este passo 4 vezes, reduzir para metade a cada vez que o volume de ressuspensão. Finalmente, ressuspender o sedimento em glicerol / água e dividir a suspensão de células em alíquotas de 50 ul. Armazenar as alíquotas a -80 ° C até 6 meses.
3. Dissolve-se o plasmídeo pretendido em água estéril suplementado com 0,5 mM de EDTA. Thaw em ice uma alíquota de células eletro-competentes e misturar com uma quantidade apropriada (2,5-5 ng) de vector. Dispensar a mistura em uma solução de 0,1 cm de percurso óptico adequado para a electroporação, e aplicam-se 1,8 kV.
4. Transferir imediatamente as células electroporadas em 1 ml de meio SOC (meio LB suplementado com 0,2% w / v de glucose, 10 mM de _MgCl2, 2,5 mM de KCl), incubar durante 1 h sob agitação, e, finalmente, transferi-se alíquotas de 100 ul para placas de Petri contendo LB agar com o antibiótico apropriado. Incubar O / N a 37 ° C.
5. Purifica-se os transformantes por estrias colónias únicas em placas de Petri.
6. Prepare células eletro-competente dos transformantes primários e repita os passos 1.1 a 1.5 para transformar com outros plasmídeos.
7. Prepare stocks de glicerol dos co-transformantes. Transferir uma única colónia em LB suplementado com os antibióticos apropriados, incubar a 37 ° C sob agitação, e a fase de log (0,6 OD) centrifugar a suspensão de células a 5000 x g durante 20 min. Resuspend o sedimento em meio LB-antibióticos contendo 15% v / v de glicerol. Dispensar em alíquotas e armazenar a - 80 ° C.

2. A co-expressão de α e ε Subunidades de E. coli ADN polimerase III

1. Por meio de uma agulha esterilizada uma pequena quantidade do estoque de glicerol tensão adequada (por exemplo, TOP10 / pGOOD-ε243 e TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, veja a Figura 1) em uma placa de Petri contendo meio LB e antibióticos. Deixe secar células suspensão na placa de Petri, e raia as células gota. Incubar a 37 ° CO / N.
2. Transferência, utilizando um palito estéril, uma única colónia para 1 ml de meio LB-antibióticos. Incubar 8 horas a 37 ° C. Dilui-se a pré-cultura de 1: 500 em meio fresco e incuba-se a 30 ° C durante 15 h.
3. Adicionar IPTG, arabinose, ou arabinose e IPTG 1 mM cada. Incubar a 30 ° C durante 2,5 h. Recolher as células, e armazenar os peletes a -20 ° C.
4. Descongelar as pelotas em gelo e ressuspender em tampão de lise (50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2,5 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), pH 8). Gentilmente homogeneizar a suspensão células com um oleiro vidro frio.
5. Sonicar a 15 W durante 15 segundos, seguido por 15 segundos de intervalo de arrefecimento (4 ciclos).
6. Centrifuga-se os extractos de proteína total a 10.000 xg durante 20 min, a 4 ° C para recuperar a fracção solúvel.
7. Analisar por alíquotas de cada extracto de proteína solúvel em SDS-PAGE (12,5% de acrilamida). Para este objectivo, transferir 20 ul de cada extracto de proteína solúvel para tubos Eppendorf contendo 60 ul de _H2O e 20 ul de tampão de carga (250 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) e ferver durante 5 min. Carga de 18 ul de cada amostra e realizar a electroforese a 140 V durante cerca de 1,5 h.

3. Co-expressão de α Subunidade de Deinococradiodurans cus ADN Polimerase III e ε Subunidade de E. coli ADN polimerase III

1. Prepara-se uma pré-cultura de E. coli estirpe TOP10 / Dr pBAD-α / pGOOD-ε243 em 1 ml de meio LB-ampicilina-tetraciclina e incubar 8 horas a 37 ° C. Diluir 1: 1000 em meio fresco e incubam O / N a 37 ° C.
2. Dilui-se 1: 100 em 200 ml de meio fresco, incubar a 37 ° C durante 3 h, em seguida, induzir durante 3 horas com arabinose e IPTG, 1 mM de cada um. Colher as células, e armazenar o sedimento a -20 ° C.
3. Ressuspender o pellet em 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogeneizar e perturbar as células conforme descrito em 2.4 e 2.5.
4. Imediatamente centrifugar as células lisado a 10.000 xg durante 20 min. Desprezar o pelete. Filtra-se o sobrenadante com um funil de Buchner equipado com 3 camadas de papel de filtro. Aplicar vácuo suave. Para evitar a formação excessiva de espuma, manter o vácuo no frasco Erlenmeyer de gelo durante a filtração.
5. Determinar a concentração de proteína de acordo com Bradford ^14.

4. Cromatografia de Filtração em Gel

1. Equilibrar um 16x70 encamisado-água (200) de coluna de filtração em gel com 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8. Carga na coluna o extracto de proteína solúvel. Para melhor resolução, use um loop de amostra de 1 ml. Realize a cromatografia em 0.6 ml / min. Manter a temperatura da coluna a 4 ° C durante toda.
2. Recolha 0,9 ml frações e analisá-los por SDS-PAGE. Transferir 20 uL de cada fracção relevante para tubos Eppendorf contendo 60 ul de _H2O e 20 ul de tampão de carga (250 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) de SDS, 50% ( v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) e fervura durante 5 min. Carga de 18 ul de cada amostra e realizar a electroforese a 140 V durante cerca de 1,5 h.
3. Determinar a exonuclease 3'-5 e a actividade de polimerase de ADN de cada fracção em 96 nósll microplacas. Ensaiar a actividade de exonuclease 5'-timidina utilizando monofosfato de éster de p-nitrofenilo (p-NP PGT) como substrato ^15. Estimar a actividade da polimerase de ADN, utilizando o PPX (pirofosfatase, purina nucleosídeo fosforilase, xantina oxidase) acoplado a enzima e ensaio de ¹⁶ 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazólio (INT) como o aceitador de electrões ^16.

5. Mutação análise de populações Co-expressam o Wild-tipo ε Subunidade de E. coli DNA polimerase III e mutagênicos εD12A Variant

1. Transferir uma única colônia de E. coli TOP10 contendo o pBAD-ε e os pGOOD1-εD12A ¹¹ vectores para 1 ml de meio LB-antibióticos. Incubar O / N a 37 ° C.
2. Dilui-se a pré-cultura de 1: 250 em três balões contendo meio fresco (10 ml), adicionar os indutores apropriados (arabinose, IPTG, ou arabinose e IPTG, 1 mM de cada um) e incubar a 37 ° Cdurante 8 h. Prepara-se culturas paralelas não induzidas.
3. Recolhe alíquotas de 1 ml, depois dilui-se 1: 500 em novos frascos contendo meio fresco (10 ml) suplementado ou não com os indutores apropriados. Incubar O / N a 37 ° C.
4. Repita os passos 5.2 e 5.3 e recolhem alíquotas de 1 ml.
5. Determinar o número de gerações ocorreu em cada cultura. Transferir em placas de LB, 100 ul de diluições em série apropriadas de inoculo e cultura. Incubar O / N a 37 ° C. Contar as colónias nas placas de LB, e calcular o logaritmo do número de células presentes no inoculo (log _I) e na cultura no final do crescimento (log _C). Para determinar o número de gerações, usar a fórmula: (log _C - log _I) /0.301.
6. Centrifugar a 5.000 xg durante 20 min e ressuspender as células em 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 50 mM. Para permeabilizar as células, adicionar 2-3 gotas de clorofórmio e de vórtice durante 20 seg.
7. Determinar a β-actividade de glicosidase cada aliquota numa microplaca de 96 poços, utilizando-se p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (PNPGluc) como substrato. Adicionar a cada poço 100 ul de células permeabilizadas e 100 ul de substrato (16 mg / ml em solução de _H2O). Tome cuidado para evitar bolhas de ar nos poços. Ler a absorvância a 420 nm, utilizando um leitor de microplacas e o filtro apropriado.

Resultados

A subunidade de E. ε coli DNA polimerase III é composto por 243 aminoácidos e possui baixa solubilidade em ^17,18, a menos que os resíduos 187-243 são eliminados ^17. Contudo, mostrámos previamente ¹¹ que o co-expressão de α de comprimento completo, ε, e subunidades θ produz DNA polimerase III solúvel do núcleo catalítico (Figura 1). Em particular, usando o sistema de pBAD-pGOOD co-expressão, demonstramos que: i) a sobre-expressão de subuni...

Discussão

As proteínas podem ser intrinsecamente desordenados, caracteriza regiões cuja estrutura terciária não está restrita a um número limitado de conformações ^25. Estas proteínas são geralmente desordenados propensos a agregação de ^25, e o seu isolamento e caracterização pode representar uma tarefa difícil. A subunidade de E. ε DNA polimerase III coli apresenta dois domínios distintos ^26,27, a saber: i) o domínio N-ter, tendo o 'exonuclease 3'-5, e c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix