عالية الدقة قياس الزنك النظائر تطبق على الماوس هيئات

Summary

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Abstract

نقدم إجراء لقياس بدقة عالية نسب الزنك النظائر في أجهزة الماوس. يتكون الزنك من 5 نظائر مستقرة ⁽⁶⁴ الزنك، الزنك ^{66، 67} الزنك، الزنك ⁶⁸ و ⁷⁰ الزنك) والتي مجزأة بشكل طبيعي بين أجهزة الماوس. وتبين لنا أولا كيفية حل الأجهزة المختلفة من أجل تحرير ذرات الزنك. يتحقق هذه الخطوة من خلال مزيج من HNO ₃ و H ₂ O _2. نحن بعد ذلك تنقية ذرات الزنك من جميع العناصر الأخرى، ولا سيما من التدخلات إسوي الضغط (على سبيل المثال، ني)، من خلال أنيون تبادل اللوني في تمييع دورية هارفارد / HNO ₃ متوسطة. يتم تنفيذ هذه الخطوات الأولى والثانية في مختبر نظيفة استخدام المواد الكيميائية عالية النقاء. وأخيرا، يتم قياس نسب النظائر باستخدام متعدد جامع إضافة بالحث-البلازما كتلة-مطياف، في دقة منخفضة. يتم حقن العينات باستخدام غرفة الرش وتجزئة النظائر الناجمة عن-مطياف الكتلة هو correcتيد بمقارنة نسبة العينات إلى نسبة معيار (تقنية أقواس القياسية). ينتج هذا الإجراء نموذجي كامل نسبة النظائر مع 50 جزء في المليون (2 SD) التكاثر.

Introduction

قياس درجة عالية من الدقة وكان (أفضل من 100 جزء في المليون / وحدة الكتلة الذرية) الزنك تكوين نظائر مستقرة ممكنا إلا لنحو 15 عاما وذلك بفضل تطور متعددة جامع البلازما المصدر كتلة-الطيف ومنذ ذلك الحين تم تطبيق معظمها في الأرض وعلوم الكواكب. تطبيقات على المجال الطبي هي رواية ولها إمكانات قوية والمؤشرات الحيوية للأمراض التي تعديل التمثيل الغذائي من الزنك (على سبيل المثال، مرض الزهايمر). تقدم هذه الورقة طريقة لقياس بدقة عالية نسب النظائر المستقرة الطبيعية من الزنك في مختلف أجهزة الماوس. والشيء نفسه ينطبق على عينات من الإنسان. يتكون أسلوب حل الأجهزة، وتنقية المواد الكيميائية الزنك من بقية الذرات، ومن ثم تحليل نسبة النظائر على-مطياف الكتلة.

جودة القياسات النظائر الزنك تعتمد على نوعية تنقية المواد الكيميائية (نقاء الزنك، وانخفاض شركات فارغةعرب كورب لكمية من الزنك الموجود في العينة، والغلة العالية الكيميائي للإجراءات)، وعلى السيطرة على التحيز فعال. هناك حاجة إلى نقاء عالية من الزنك جزء النهائي لإزالة كل التدخلات إسوي الضغط والتدخل غير إسوي الضغط الذي خلق تأثير المصفوفة. النويدات إسوي الضغط تخلق التدخلات المباشرة (على سبيل المثال، ⁶⁴ ني). التدخلات غير إسوي الضغط تولد ما يسمى "المصفوفة" تأثير وتغير الدقة التحليلية القياسات عن طريق تغيير حالة التأين مقارنة مع مستوى الزنك النقي الذي يتم مقارنة العينات إلى ^1. A منخفض فارغة (<10 نانوغرام) يشير إلى أنه لا يوجد أي تلوث عينات من قبل الزنك الخارجية التي من شأنها أن التحيز تكوين النظائر قياسها. كما النظائر الزنك يمكن مجزأة خلال التبادل الأيوني اللوني ^2، وجمع كل ذرات الزنك يضمن أن لا تجزئة النظائر يحدث، وهو ما يعني أنه ينبغي أن يكون الإجراء الكيميائية العائد الكامل. أخيرا، ويتم تصحيح تجزئة النظائر دور فعال خلال قياس مطياف الكتلة عبر برنامج "بين أقواس القياسية" الأسلوب.

ولذلك، فإن الصعوبات الرئيسية للحصول على قياسات دقيقة والسيطرة على التلوث الخارجي (أي منخفضة فارغة)، مما ينتج عنه تنقية الكيميائية العائد الكامل الذي هو نظيفة من أي ذرات أو جزيئات أخرى، وتصحيح تجزئة النظائر فعال على-مطياف الكتلة. في هذه الورقة فإننا سوف تصف بروتوكول التحليلي لدينا لفصل الزنك من أجهزة الماوس وكذلك القياسات مطياف الكتلة.

ويتم استخراج باستخدام كمية منخفضة من الأحماض المخففة (دورية هارفارد / HNO ₃ وسائل الاعلام) على أعمدة صغيرة (0.5 ميكرولتر و 0.1 ميكرولتر) من راتنج أنيون الصرف. أنه يحتوي على العائد الكامل والقياسات لها استنساخ الخارجي أفضل من 50 صفحة في الدقيقة على نسبة الزنك ⁶⁶ الزنك / ^64. ميزة أخرى من المنهجياتالتطوير التنظيمي هو أنه سريع جدا. ولذلك هو الأسلوب تتكيف بشكل جيد للغاية لالعلوم الطبية، في أي واحد يحتاج إلى تحليل عدد كبير من العينات مقارنة مع العلوم الجيولوجية، حيث تم تطوير هذه الأساليب التحليلية.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة باريس ديدرو: ملاحظة.

1. إعداد المواد

1. يغلي الفرعي تقطير 1 L من الأحماض (HNO _3، دورية هارفارد) من أجل تنقيتها من الشوائب.
2. تنظيف الأكواب ومحول طرف في الساخن (~ 100 ° C) تتركز HNO ₃ حمام حمض لمدة يومين على الأقل.
3. غسل نصائح ماصة في البرد 3 N HNO ₃ حمام لعدة أيام وشطف بشكل فردي ثلاث مرات مع دي المتأينة المياه.

إعداد 2. عينة

1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين وزيلازين. تقييم التخدير من خلال طريقة قرصة أخمص قدميه.
2. جمع الدم عن طريق ثقب في القلب في حضور الهيبارين في 1.5 مل أنابيب.
3. فصل البلازما من خلايا الدم عن طريق الطرد المركزي (10 دقيقة، 1500 x ج) ونقل البلازما إلى البولي بروبلين جقارورة ryogenic باستخدام نصائح البولي بروبلين.
4. إزالة الدم المتبقية من الأجهزة عن طريق قطع الوريد الكبدي وحقن DPBS من خلال القلب. تقييم فاة الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
5. حصاد الأجهزة العقيمة مع أدوات الفولاذ المقاوم للصدأ، تحريرهم من الدهون المحيطة بها إن وجدت، والمفاجئة تجميدها في البولي بروبلين قارورة المبردة.

3. الكيميائية تنقية

1. لأول مرة، ويحل العينات في مزيج من ~ 1 مل من مركز (30٪) H ₂ O ₂ و ~ 1 مل من المركز (~ 15 M) HNO _3. هل كل هذه الخطوات داخل غطاء الدخان.
   1. وضع الجهاز كله من الفائدة إلى 15 مل تفلون الكأس. ثم، إضافة H ₂ O ₂ / HNO ₃ إلى ⁵ كوب. الحفاظ على الكأس مفتوحة لبضع دقائق وذلك لتجنب البقع الناجمة عن رد فعل أكسدة المواد العضوية والإفراج عن CO _2.
   2. أخيرا، وضع الكأس على طبق ساخن في أبوالتحرير 100 درجة مئوية لمدة بضع ساعات أو حتى حل واضح تماما.
2. فتح الكأس وتجفيف الحل على طبق ساخن في حوالي 100 ° C.
3. مرة واحدة العينة الجافة، إضافة 1 مل من 1.5 N دورية هارفارد للعينات. إغلاق الكأس والسماح لها حل على طبق ساخن عند 100 درجة مئوية لمدة بضع ساعات.
4. وفي الوقت نفسه إعداد الأعمدة ميكرولتر 500.
   1. إضافة 500 ميكرولتر من الراتنج شبكة AG1X8 200-400 إلى العمود ووضعها على الرف العمود مع كوب القمامة تحتها. غسل الراتنج بالتناوب: 5 مل من 18.2 MΩ ⋅ سم ماء، 5 مل من 0،5 N HNO _3، 5 مل من الماء و 5 مل من 0،5 N HNO ₃ ثم 5 مل من الماء. حالة الراتنج مع 5 مل من 1،5 N دورية هارفارد.
5. إزالة أكواب من صفيحة ساخنة ووضعها في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة، ومن ثم السماح للالأكواب باردة وصولا الى RT.
6. مرة واحدة يتم تبريد كوب ويتم غسلها والراتنج، وفتح الكأس. وضع محول طرف لرانه الحقنة، إضافة طرف ماصة. ماصة 1 مل من العينة وتحميله على الراتنج (ببطء شديد حتى لا تستنهض الهمم الراتنج).
7. مرة واحدة يمر كل السائل من خلال العمود، إضافة 5 مل من 1،5 N دورية هارفارد.
8. مرة واحدة في 5 مل من 1،5 N دورية هارفارد تمر عبر العمود، استبدال كوب القمامة مع نظيفة 15 مل دورق.
9. إضافة 5 مل من 0،5 N HNO ₃ 2.5 مل في كل مرة. في هذه المرحلة هو مزال على الزنك من الراتنج.
10. مرة واحدة 5 مل من HNO ₃ يمر خلال العمود، وإزالة الكأس ووضعها على طبق ساخن عند 100 درجة مئوية حتى المجففة.
11. إزالة عمود من صاحب عمود؛ القمامة الراتنج (استخدام الراتنج جديد لكل عينة).
12. مرة واحدة العينة جافة، كرر بروتوكول مع نفس الحجم من الأحماض على عمود أصغر (100 ميكرولتر) ومن ثم وضعه على طبق ساخن حتى يجف. العينة هي الآن جاهزة للمطياف الكتلة.

4. مطياف الكتلة القياس

1. تحليل كومبو النظائر الزنكsition على عدة إلى جانب جامع بالحث البلازما مطياف الكتلة (MC-ICP-MS).
   1. استخدام المعلمات آلة تلخيصها في الجدول 1.
2. وضع أكواب فاراداي لجمع في الكتلة (م / ض) من ⁶² النيكل، النحاس ^{63، 64} الزنك، النحاس ^{65، 66} الزنك، الزنك ⁶⁷ و ⁶⁸ الزنك.
3. تحضير محلول يحتوي على 500 جزء في البليون الزنك في 0.1 M HNO ₃ لتحليل النظائر.
4. تحليل حل 500 جزء في البليون من الزنك باستخدام غرفة رذاذ جنبا إلى جنب مع 100 ميكرولتر / دقيقة تفلون البخاخات. لكل عينة، قياس 30 بالاشعة (1 كتلة من 30 دورات) في الوقت الذي دمج كل التفحص 8.389 ثانية.
5. تصحيح الخلفية من خلال طرح الصفر شدة وعلى الذروة من حل فارغة (0.1 M HNO ₃ حل تستخدم لإعادة بحل-العينات).
6. الرقابة والصحيح الممكن ⁶⁴ ني تدخل إسوي الضغط عن طريق قياس شدة ني الذروة ^62.نفترض أن ⁶⁴ ني / ⁶² نسبة ني أمر طبيعي (0.2548)، صحيح هذه القيمة من التحيز كتلة فعال، ومن ثم إزالة ني ⁶⁴ عن كتلة 64 على النحو التالي:
   ⁶⁴ الزنك _{الحقيقي} = ⁶⁴ الزنك _قياس - ⁶⁴ ني = ⁶⁴ الزنك _قياس - ⁽⁶⁴ ني / ⁶² ني) _{الطبيعي} × ⁶² ني _{قياسها.}
7. تصحيح التحيز الشامل فعال من قبل بين أقواس كل من العينات مع 500 جزء في البليون حل معيار من المعايير JMC ليون الزنك (أو معيار متاح أخرى مثل IRMM-3702). أداء بين أقواس القياسية بقسمة نسبة الزنك ⁶⁶ الزنك / ⁶⁴ من العينة متوسط ​​نسبة الزنك ⁶⁶ الزنك / ⁶⁴ من معيارين تقاس قبل وبعد العينة ناقص 1 ومضروبا 1000 (انظر المعادلة 1). الدقة الخارجية نموذجية على مستوى JMC ليون الزنك هو 0.05 permil / اتحاد المغرب العربي (2 الانحراف المعياري، 2 SD).

النتائج

في 1.5 N دورية هارفارد، والأنواع الرئيسية الزنك (ZnBr3-) أشكال المجمعات قوية جدا مع أنيون راتنج التبادل، في حين أن معظم عناصر أخرى لا تتفاعل مع الراتنج. ثم يتم استرداد الزنك عن طريق تغيير على المديين المتوسط ​​وHNO ₃ المخفف، وتغيير أنواع جديدة من الزنك لزد ²⁺ الت?...

Discussion

يتم تقييم استنساخ القياسات من خلال التحليلات تكرارها من نفس العينات التي نفذت خلال جلسات تحليلية مختلفة. على سبيل المثال ^6، ونحن قد تتكرر نفس الصخور الأرضية 7 مرات وحصلنا على النتائج المدرجة في الجدول 2.

كما هو متوق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
Teflon beakers	Savillex	200-015-12
In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon