High Precision Zink Isotopenmessungen an Maus-Orgeln Angewandte

Zusammenfassung

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Verfahren mit hoher Präzision Zink Isotopenverhältnisse in der Maus Organe messen. Zink wird von 5 stabile Isotope ⁽⁶⁴ Zn, ⁶⁶ Zn, ⁶⁷ Zn, ⁶⁸ Zn und ⁷⁰ Zn), die natürlicherweise zwischen Mausorgane fraktioniert werden zusammengesetzt. Wir zeigen zunächst, wie die verschiedenen Organe, um die Zn-Atome frei zu lösen; Dieser Schritt wird durch eine Mischung von HNO ₃ und H ₂ O ₂ umgesetzt. Reinigen wir dann die Zinkatome von allen anderen Elementen, insbesondere von isobare Interferenzen (beispielsweise Ni), durch Anionenaustausch-Chromatographie in einer verdünnten HBr / HNO _{3 -Medium.} Diese ersten beiden Schritte in einem Reinlabor mit hochreinen Chemikalien durchgeführt. Schließlich werden die Isotopenverhältnisse durch die Verwendung eines Multikollektor-induktiv gekoppeltes Plasma-Massenspektrometer, mit einer niedrigen Auflösung gemessen. Die Proben werden mit einer Spritzkammer und der isotopischen Fraktionierung-Massenspektrometers induzierte correc spritztted durch Vergleich des Verhältnisses der Proben an das Seitenverhältnis eines herkömmlichen (Standardbelichtungstechnik). Das vollständige typische Vorgehensweise erzeugt ein Isotopenverhältnis mit einer 50 ppm (2 sd) Reproduzierbarkeit.

Einleitung

Die Messung hoher Genauigkeit (besser als 100 ppm / atomare Masseneinheit) Zink stabilen Isotopenzusammensetzung erst seit etwa 15 Jahren durch die Entwicklung von Multi-Kollektor-Plasmaquelle Massenspektrometer möglich und wurde seitdem hauptsächlich in Erde angewendet und Planetenwissenschaften. Die Anwendungen auf dem Gebiet der Medizin, sind neu und haben ein starkes Potential als Biomarker für Krankheiten, die den Metabolismus von Zink (zB Alzheimer-Krankheit) zu ändern. Dieses Papier berichtet über eine Methode, um mit hoher Präzision in verschiedenen Organen der Maus messen die natürlichen stabilen Isotopen-Verhältnisse von Zink. Das gleiche würde für menschlichen Proben. Das Verfahren besteht in der Auflösung der Organe, die chemische Reinigung von Zink aus dem Rest der Atome, und die Analyse der Isotopenverhältnis auf einem Massenspektrometer.

Die Qualität der Zn Isotopenmessungen ist abhängig von der Qualität der chemischen Reinigung (Reinheit von Zn, niedrigen leere Datei herunterladenared auf die Menge an Zn in der Probe vorhanden, hohe chemische Ausbeute des Verfahrens) und die Steuerung der Instrumental Bias. Die hohe Reinheit des Endproduktes Zn Fraktion benötigt wird, um sowohl isobare Interferenzen und nicht isobare Interferenzen, die eine Matrix Effekt entfernen. Isobar Nuklide erstellen direkten Eingriffe (zB ⁶⁴ Ni). Non-isobare Interferenzen erzeugen die sogenannten "Matrixeffekt" und verändern die analytische Genauigkeit der Messungen durch Ändern des Zustands der Ionisation gegenüber dem reinen Zink Standards, nach dem die Proben ¹ verglichen. Eine niedrige Leer (<10 ng) zeigt an, daß es keine Verunreinigung der Proben durch externe Zn das würde den gemessenen Biasisotopenzusammensetzung. Zn Isotope während Ionenaustauschchromatographie ² fraktioniert werden, die Sammlung aller Zn-Atome sichergestellt, dass keine isotopischen Fraktionierung auftritt, was bedeutet, daß der chemische Vorgang ein erfülltes Ertrag haben. Schließlich wird die Korrektur der instrument Isotopenfraktionierung während der Massenspektrometrie Messung über die "Standard-Belichtungsreihe" Methode.

Daher sind die Hauptschwierigkeiten zu erhalten präzise Messungen sind die Steuerung der externen Kontamination (dh niedrige blank), wodurch eine vollständige Ausbeute chemische Reinigung, die sauber von anderen Atomen oder Molekülen ist, und die Korrektur der instrument Isotopenfraktionierung auf dem Massenspektrometer. In diesem Papier werden wir unsere analytischen Protokolls beschreiben Zn aus dem Maus-Organen sowie die massenspektrometrische Messung zu trennen.

Die Extraktion unter Verwendung einer geringen Menge an verdünnten Säuren (HBr / HNO ₃ Medien) auf Mikro-Säulen (0,5 & mgr; l und 0,1 & mgr; l) des Anionenaustauscherharzes durchgeführt. Es hat einen vollen Ertrag und die Messungen eine externe Reproduzierbarkeit besser als 50 ppm auf der ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ Zn-Verhältnis. Ein weiterer Vorteil der Method ist, dass es sehr schnell ist. Das Verfahren ist daher sehr gut an den medizinischen Wissenschaften angepasst, wobei man braucht, um eine große Anzahl von Proben verglichen, um geowissenschaftlichen gegebenen wurden die analytischen Methoden entwickelt analysieren.

Protokoll

HINWEIS: Verfahren, die Tiere wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Université Paris Diderot genehmigt.

1. Vorbereitung der Materialien

1. Unter Kochen destillieren 1 L der Säuren (HNO _3, HBr), um sie von Unreinheit zu reinigen.
2. Reinigen Sie die Becher und Spitzenadapter in einem heißen (~ 100 ° C) konzentrierte HNO ₃ Säurebad für mindestens zwei Tage.
3. Waschen Sie die Pipettenspitzen in einer kalten 3 N HNO ₃ Bad für mehrere Tage und spülen einzeln dreimal mit entionisiertem Wasser.

2. Probenvorbereitung

1. Betäuben die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin. Beurteilen Anästhesie durch den Zehen Prise Methode.
2. Das Blut durch eine kardiale Punktion in Gegenwart von Heparin in 1,5-ml-Röhrchen.
3. Trennen des Plasmas von Blutzellen durch Zentrifugation (10 min, 1.500 x g) und übertragen das Plasma auf Polypropylen cryogenic Fläschchen mit Polypropylen-Tipps.
4. Entfernen Sie das restliche Blut von Organen, die durch Schneiden der Lebervene und Einspritzen von DPBS durch das Herz. Beurteilen Tod der Maus durch zervikale Dislokation.
5. Ernte der Organe mit sterilen Instrumenten erreicht, befreien sie von umgebenden Fett wenn überhaupt, und Schnapp frieren sie in Polypropylen Kryoröhrchen.

3. Chemische Reinigung

1. Zunächst lösen die Proben in einer Mischung von ~ 1 ml konzentrierter (30%) H ₂ O ₂ und ~ 1 ml konzentrierter (etwa 15 M) HNO _3. Haben alle diese Schritte innerhalb einer Abzugshaube.
   1. Legen Sie das ganze Organ von Interesse in einen 15 ml Teflonbecher. Fügen Sie dann die H ₂ O ₂ / HNO ₃ in das Becherglas ^5. Halten Sie das Becherglas offen für ein paar Minuten, um Spritzer auf die Reaktion der Oxidation des organischen Materials und die Freisetzung von CO ₂ zu vermeiden.
   2. Schließlich legte das Becherglas auf einer Heizplatte bei about 100 ° C für ein paar Stunden oder bis die Lösung völlig klar.
2. Öffnen der Becher und trocknen der Lösung auf einer heißen Platte bei etwa 100 ° C.
3. Sobald die Probe trocken ist, fügen Sie 1 ml 1,5 N HBr zu den Proben; schließen Sie das Becherglas und lassen Sie es auf einer heißen Platte lösen sich bei 100 ° C zwei Stunden.
4. In der Zwischenzeit die 500 ul Spalten vorzubereiten.
   1. Fügen Sie 500 ul der AG1X8 200-400 Mesh-Harz auf die Säule und legte es auf die Säule Rack mit einem Papierkorb-Becher darunter. Waschen des Harzes mit Wechselstrom: 5 ml von 18,2 M & Omega; cm ⋅ Wasser, 5 ml 0,5 N HNO _3, 5 ml Wasser, 5 ml 0,5 N HNO _3, und dann mit 5 ml Wasser versetzt. Zustand des Harzes mit 5 ml 1,5 N HBr.
5. Entfernen Sie die Bechergläser aus dem Kochplatte und setzen Sie sie in einem Ultraschallbad für etwa 30 min, und dann lassen Sie die Becher abkühlen auf RT.
6. Sobald der Becher wird abgekühlt und das Harz wird gewaschen, öffnen Sie das Becherglas. Setzen Sie die Spitze Adapter bis ter spritze, fügen Sie eine Pipettenspitze; Pipette die 1 ml Probe und laden Sie es auf dem Harz (sehr langsam, um nicht, um das Harz zu bewegen).
7. Nachdem die gesamte Flüssigkeit durch die Säule passiert, 5 ml 1,5 N HBr.
8. Sobald die 5 ml 1,5 N HBr durch die Säule, ersetzen Sie den Papierkorb-Becher mit einem sauberen 15 ml-Becher.
9. 5 ml von 0,5 N HNO ₃ mit 2,5 ml auf einmal. In diesem Stadium der Zn von dem Harz eluiert.
10. Nachdem 5 ml HNO ₃ durch die Säule passiert, nimmt das Becherglas und legen Sie sie auf einer heißen Platte bei 100 ° C bis getrocknet.
11. Entfernen Sie die Spalte aus der Säulenhalter; trash das Harz (verwenden Sie eine neue Harz für jede Probe).
12. Sobald die Probe trocken ist, wiederholen Sie das Protokoll mit dem gleichen Volumen von Säuren auf einer kleineren Kolonne (100 ul) und legen Sie sie auf einer heißen Platte bis getrocknet. Die Probe ist nun für die Massenspektrometrie.

4. Massenspektrometrie Measurement

1. Analysieren Sie den Zn Isotopen composition auf einer Mehrkollektor-induktiv gekoppeltes Plasma-Massenspektrometer (MC-ICP-MS).
   1. Verwenden Sie die Maschinenparameter in Tabelle 1 zusammengefasst.
2. Positionieren Sie die Faraday-Cups auf Masse (m / z) von ⁶² Ni, ⁶³ Cu, Zn ^{64, 65} Cu, ⁶⁶ Zn, ⁶⁷ Zn und ⁶⁸ Zn zu sammeln.
3. Bereiten Sie eine Lösung, die 500 ppb Zn in 0,1 M HNO ₃ für die Isotopenanalyse.
4. Analysieren Sie die 500 ppb-Lösung von Zn mit Hilfe eines Spritzkammer in Verbindung mit einer 100 & mgr; l / min Teflon Vernebler. Für jede Probe sind 30 Scans (1 Block von 30 Zyklen), in denen die Integrationszeit jeder Abtastzeile ist 8,389 sec.
5. Korrigieren Sie den Hintergrund durch Subtraktion der auf Spitze Null-Intensitäten aus einem Rohling-Lösung (0,1 M HNO ₃ Lösung zur Wiederauflösung der Proben).
6. Kontrolle und korrekte möglich ⁶⁴ Ni isobare Interferenzen durch Messung der Intensität der ⁶² Ni Höhepunkt.Angenommen, der ⁶⁴ Ni / ⁶² Ni-Verhältnis ist natürlich (0,2548), korrigieren Sie diesen Wert aus der instrumentellen Massen bias, und entfernen Sie die ⁶⁴ Ni auf die Masse 64, wie:
   ⁶⁴ Zn _Real = ⁶⁴ Zn _gemessen - ⁶⁴ Ni = ⁶⁴ Zn _gemessen - ⁽⁶⁴ Ni / ⁶² Ni) _Natur x ⁶² Ni _gemessen.
7. Korrigieren Sie die instrumental Massen Bias von Belichtungsreihen jede der Proben mit 500 ppb Standardlösung des JMC Lyon Zn-Standard (oder einem anderen verfügbaren Standard wie IRMM-3702). Führen die Standardreihe durch Dividieren der ⁶⁶ Zn / Zn ⁶⁴ Verhältnis von der Probe durch den Mittelwert der ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ Zn-Verhältnis der beiden Standards vor und nach der Probe minus 1 und multipliziert mit 1000 (siehe Gleichung 1). Typische externen Präzision auf der JMC Lyon Zn-Standard ist 0,05 permil / amu (2 Standardabweichung, 2 sd).

Ergebnisse

In 1,5 N HBr, die Hauptzinkspezies (ZnBr3-) bildet sehr starke Komplexe mit dem Anionenaustauscherharz, während die meisten anderen Elemente nicht mit dem Harz in Wechselwirkung treten. Zink wird dann durch Ändern des Mediums verdünnt HNO _3, die Änderung der Speziation von Zn zu Zn ^2+, die von dem Harz ^6,7 freigesetzt wird, zurückgewonnen.

Isotopenverhältnisse sind typischerweise als Teile pro 1.000 Abweichungen relativ zu einem Standard ausgedrückt: <...

Diskussion

Die Reproduzierbarkeit der Messungen wird durch repliziert Analysen der gleichen Proben während verschiedenen analytischen Sitzungen durchgeführt bewertet. Zum Beispiel ⁶ haben wir die gleichen terrestrischen rock 7 Mal wiederholt, und wir erhalten die Ergebnisse in der Tabelle 2 angegeben.

Wie aus der Theorie der Isotopenfraktionierung ¹⁰ erwartet und nach einem Sonnensystems Material bisher gemessen (zB Meteoriten ^11-13, pflanzen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
teflon beakers	Savillex	200-015-12
Home-made teflon colunms made with shrinkable teflon