Alte le misure di precisione di zinco isotopiche applicate a mouse Organi

Riepilogo

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Abstract

Vi presentiamo una procedura per misurare con elevata precisione i rapporti isotopici di zinco negli organi di topo. Lo zinco è composto da 5 isotopi stabili ⁽⁶⁴ Zn, Zn ^{66, 67, 68} Zn Zn e ⁷⁰ Zn) che sono naturalmente frazionati tra gli organi del mouse. Per prima cosa mostriamo come sciogliere i diversi organi, al fine di liberare gli atomi Zn; questo passaggio è realizzato da una miscela di HNO ₃ e H ₂ O _2. Abbiamo poi purificare gli atomi di zinco da tutti gli altri elementi, in particolare da interferenze isobariche (ad esempio, Ni), mediante cromatografia a scambio anionico in un diluita HBr / HNO ₃ medio. Questi primi due passaggi vengono eseguiti in un laboratorio pulito utilizzo di prodotti chimici di elevata purezza. Infine, i rapporti isotopici sono misurati utilizzando un multi-collettore accoppiato induttivamente-plasma spettrometro di massa, in bassa risoluzione. I campioni sono iniettati usando una camera di nebulizzazione e frazionamento isotopico indotto dalla spettrometro di massa è correcta confrontando il rapporto dei campioni al rapporto di uno standard (tecnica bracketing standard). Questo procedimento tipico completo produce un rapporto isotopico con un 50 ppm (2 sd) riproducibilità.

Introduzione

La misura di alta precisione (migliore di 100 ppm / unità di massa atomica) zinco composizione isotopica stabile è stato possibile solo per circa 15 anni grazie allo sviluppo di multi-collettore plasma-source spettrometri di massa e da allora è stato in gran parte applicata in Terra e delle scienze planetarie. Le applicazioni al campo medico sono nuovi e hanno un forte potenziale come biomarcatori per le malattie che modificano il metabolismo di zinco (ad esempio, il morbo di Alzheimer). Questo lavoro riporta un metodo per misurare con elevata precisione i naturali rapporti dell'isotopo stabili di zinco in vari organi di topo. Lo stesso sarebbe applicabile a campioni umani. Il metodo consiste nella dissoluzione degli organi, la depurazione chimica dello zinco dal resto degli atomi, e quindi l'analisi del rapporto isotopico su un spettrometro di massa.

La qualità delle misure isotopiche Zn dipende dalla qualità della depurazione chimica (purezza di Zn, bassa comp vuotoared alla quantità di Zn presente nel campione, alta resa chimica della procedura) e sul controllo della polarizzazione strumentale. È necessaria la elevata purezza della frazione Zn finale per rimuovere sia le interferenze isobariche e le interferenze non isobarico che creano un effetto matrice. Nuclidi isobariche creano interferenze dirette (ad esempio, ⁶⁴ Ni). Interferenze non isobariche generare il cosiddetto effetto "matrice" alterano la precisione analitica delle misurazioni cambiando la condizione di ionizzazione rispetto allo standard di zinco puro a cui sono confrontate a ^1. Un basso vuoto (<10 ng) indica che non vi è alcuna contaminazione dei campioni da Zn esterno che sarebbe influenzare la composizione isotopica misurata. Come isotopi Zn possono essere frazionati durante cromatografia a scambio ionico ^2, l'insieme di tutti gli atomi di Zn assicura che non si verifica alcun frazionamento isotopico, che implica che il procedimento chimico dovrebbe avere un rendimento completo. Infine, la correzione del frazionamento isotopico strumentale durante la misurazione spettrometria di massa è fatto tramite il metodo "staffaggio standard".

Pertanto, le principali difficoltà per ottenere misure precise controllano la contaminazione esterna (cioè basso vuoto), producendo una piena resa depurazione chimica che è pulito di altri atomi o molecole, e correggendo il frazionamento isotopico strumentale sul spettrometro di massa. In questo articolo descriveremo il nostro protocollo analitico per separare Zn dagli organi di topo e le misure di spettrometria di massa.

L'estrazione viene fatto utilizzando una bassa quantità di acidi diluiti (HBr / HNO ₃ media) su micro-colonne (0,5 microlitri e 0,1 microlitri) di resina a scambio anionico. Ha una resa completa e le misurazioni hanno una riproducibilità esterna superiore a 50 ppm dal rapporto ⁶⁶ Zn / Zn ^64. Un altro vantaggio del method è che è molto veloce. Il metodo è quindi molto ben adattato alle scienze mediche, in cui si ha la necessità di analizzare un gran numero di campioni rispetto al geosciences, dove sono stati sviluppati questi metodi analitici.

Protocollo

NOTA: Le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso l'Université Paris Diderot.

1. Preparazione dei materiali

1. Sub-ebollizione distillare 1 L degli acidi (HNO _3, HBr) per purificarli da impurità.
2. Pulire i bicchieri e l'adattatore punta in un caldo (~ 100 ° C) concentrati HNO ₃ bagno di acido per almeno due giorni.
3. Lavare i puntali delle pipette in una fredda 3 N HNO ₃ bagno per diversi giorni e risciacquare singolarmente per tre volte con acqua deionizzata.

Preparazione 2. campione

1. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Valutare l'anestesia con il metodo pizzico piedi.
2. Raccogliere il sangue da una puntura cardiaca in presenza di eparina in provette da 1,5 ml.
3. Separare il plasma dalle cellule ematiche mediante centrifugazione (10 min, 1.500 xg) e trasferire il plasma al polipropilene cfiale ryogenic con punte di polipropilene.
4. Rimuovere il sangue rimanente dagli organi tagliando la vena epatica e l'iniezione DPBS attraverso il cuore. Valutare la morte del mouse per dislocazione cervicale.
5. Raccogliere le organi con strumenti sterili in acciaio inox, liberarli di circondare grasso, se del caso, e scatto-congelare in polipropilene fiale criogeniche.

3. Chemical Purificazione

1. Innanzitutto, sciogliere i campioni in un mix di ~ 1 ml di concentrato (30%) H ₂ O ₂ e ~ 1 ml di concentrato (~ 15 M) HNO _3. Fare tutti questi passaggi all'interno di una cappa aspirante.
   1. Inserire l'intero organo di interesse in un becher da 15 ml Teflon. Quindi, aggiungere l'H ₂ O ₂ / HNO ₃ nel becher ^5. Mantenere la coppa aperta per pochi minuti per evitare spruzzi dovuti alla reazione di ossidazione della sostanza organica e il rilascio di CO _2.
   2. Infine, mettere il bicchiere su un piatto caldo a about 100 ° C per un paio d'ore o fino a quando la soluzione è perfettamente chiaro.
2. Aprire il becher e asciugare la soluzione su una piastra calda a circa 100 ° C.
3. Una volta che il campione è asciutto, aggiungere 1 ml di 1,5 N HBr ai campioni; chiudere il bicchiere e farlo sciogliere su una piastra calda a 100 ° C per due ore.
4. Nel frattempo preparare le 500 colonne microlitri.
   1. Aggiungere 500 ml di resina maglia AG1X8 200-400 alla colonna e metterlo sulla cremagliera colonna con un bicchiere rifiuti sotto. Lavare la resina alternando: 5 ml di 18,2 MW ⋅ cm di acqua, 5 ml di 0,5 N HNO _3, 5 ml di acqua, 5 ml di 0,5 N HNO _3, e poi 5 ml di acqua. Condizionare la resina con 5 ml di 1,5 N HBr.
5. Togliere i bicchieri dal piatto caldo e metterli in un bagno ad ultrasuoni per circa 30 minuti, e poi lasciare che i bicchieri raffreddare a temperatura ambiente.
6. Una volta che il bicchiere viene raffreddata e si lava la resina, aprire il becher. Mettere l'adattatore punta a tegli siringa, aggiungere una punta della pipetta; pipettare i 1 ml di campione e caricarlo sulla resina (molto lentamente per non agitare la resina).
7. Una volta che tutto il liquido passa attraverso la colonna, aggiungere 5 ml di 1,5 N HBr.
8. Una volta che i 5 ml di 1,5 N HBr passano attraverso la colonna, sostituire il becher cestino con un bicchiere pulito 15 ml.
9. Aggiungere 5 ml di 0,5 N HNO ₃ 2,5 ml per volta. In questa fase l'Zn viene eluito dalla resina.
10. Una volta 5 ml di HNO ₃ passa attraverso la colonna, togliere il beaker e posizionarlo su una piastra calda a 100 ° C fino essiccato.
11. Rimuovere la colonna dal supporto della colonna; cestinare la resina (utilizzare una nuova resina per ogni campione).
12. Una volta che il campione è asciutto, ripetere il protocollo con lo stesso volume di acidi su una colonna più piccola (100 microlitri) e poi posto su una piastra calda fino essiccato. Il campione è ora pronto per spettrometria di massa.

4. spettrometria di massa di misura

1. Analizzare il compo isotopica Znsizione su un plasma-spettrometro di massa a più collettore ad accoppiamento induttivo (MC-ICP-MS).
   1. Utilizzare i parametri macchina riassunti nella tabella 1.
2. Posizionare le tazze di Faraday per raccogliere in massa (m / z) di ⁶² Ni, ⁶³ Cu, Zn ^{64, 65} Cu, Zn ^{66, 67} e ⁶⁸ Zn Zn.
3. Preparare una soluzione contenente 500 ppb Zn in 0.1 M HNO ₃ per l'analisi isotopica.
4. Analizzare la soluzione 500 ppb di Zn utilizzando una camera di nebulizzazione combinato con 100 microlitri / min nebulizzatore teflon. Per ogni campione, misura 30 scansioni (1 blocco di 30 cicli) in cui il tempo di integrazione di ogni scansione è 8,389 sec.
5. Correggere il fondo sottraendo i on-picco a zero intensità da una soluzione in bianco (la M HNO soluzione 0,1 ₃ utilizzati per ri-sciogliere i campioni).
6. Controllo e corretta possibile ⁶⁴ Ni interferenze isobarica misurando l'intensità del picco ⁶² Ni.Si supponga che il / ⁶² rapporto Ni ⁶⁴ Ni è naturale (0,2548), correggere questo valore dal pregiudizio di massa strumentale, e quindi rimuovere il ⁶⁴ Ni sulla massa 64 come:
   ⁶⁴ Zn _reale = ⁶⁴ Zn _misurato - ⁶⁴ Ni = ⁶⁴ Zn _misurato - ⁽⁶⁴ Ni / ⁶² Ni) _naturale x ⁶² Ni _misurato.
7. Correggere la distorsione di massa strumentale di bracketing ciascuno dei campioni con una soluzione 500 ppb standard della norma JMC Lione Zn (o un altro standard disponibile come IRMM-3702). Eseguire il bracketing serie dividendo il rapporto ⁶⁶ Zn / Zn ⁶⁴ del campione per la media del rapporto ⁶⁶ Zn / Zn ⁶⁴ delle due norme misurati prima e dopo il campione meno 1 e moltiplicato per 1.000 (vedere equazione 1). Tipico precisione esterno sullo standard JMC Lione Zn è di 0,05 per mille / amu (2 deviazioni standard, 2 sd).

Risultati

In 1.5 N HBr, le principali specie di zinco (ZnBr3-) forma complessi molto forti con la resina scambiatrice di anioni, mentre la maggior parte degli altri elementi non interagiscono con la resina. Lo zinco viene quindi recuperato cambiando medio HNO ₃ diluito, cambiando la speciazione di Zn di Zn ²⁺ che si libera dal ^6,7 resina.

Rapporti isotopici sono tipicamente espressi come parti per 1.000 deviazioni relative a uno standard:

Discussione

La riproducibilità delle misure viene valutata mediante analisi replicate degli stessi campioni sono effettuati durante diverse sessioni analitiche. Ad esempio ^6, abbiamo replicato stessa roccia terrestre 7 volte e abbiamo ottenuto i risultati riportati nella Tabella 2.

Come previsto dalla teoria di frazionamento isotopico ¹⁰ e misurata in qualsiasi materiale sistema solare finora (ad esempio, ^11-13 meteoriti, piante ^3-5,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
teflon beakers	Savillex	200-015-12
Home-made teflon colunms made with shrinkable teflon