Altas medidas de precisión de zinc isotópicos aplicados a Ratón Órganos

Resumen

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Resumen

Se presenta un procedimiento para medir con alta precisión las proporciones de isótopos de zinc en órganos de ratón. Zinc se compone de 5 isótopos estables ⁽⁶⁴ Zn, Zn ^{66, 67, 68} Zn Zn y Zn) ⁷⁰ que se fraccionan naturalmente entre los órganos de ratón. En primer lugar, mostramos cómo disolver los diferentes órganos con el fin de liberar a los átomos de Zn; este paso se realiza por una mezcla de HNO ₃ y H ₂ O _2. A continuación, purificamos los átomos de zinc de todos los otros elementos, en particular de interferencias isobáricas (por ejemplo, Ni), por cromatografía de intercambio aniónico en un / HNO ₃ HBr medio diluido. Estos dos primeros pasos se realizan en un laboratorio limpio utilizando productos químicos de alta pureza. Por último, las proporciones de isótopos se miden usando un multi-colector-plasma de acoplamiento inductivo-espectrómetro de masas, en baja resolución. Las muestras se inyectaron usando una cámara de pulverización y el fraccionamiento isotópico inducido por el espectrómetro de masas es corrected mediante la comparación de la relación de las muestras a la relación de un estándar (técnica de horquillado estándar). Este procedimiento típico completo produce una relación isotópica con un 50 ppm (2 sd) reproducibilidad.

Introducción

La medición de alta precisión (mejor que 100 ppm / unidad de masa atómica) de zinc composición de isótopos estables sólo ha sido posible por cerca de 15 años gracias al desarrollo de varios colectores de plasma de código espectrómetros de masa y desde entonces ha sido aplicado en su mayoría en la Tierra y las ciencias planetarias. Las aplicaciones en el campo médico son nuevos y tienen un fuerte potencial como biomarcadores para enfermedades que modifican el metabolismo del zinc (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer). Este trabajo presenta un método para medir con alta precisión las proporciones de isótopos estables naturales de zinc en diversos órganos de ratón. Lo mismo sería aplicable a muestras humanas. El método consiste en la disolución de los órganos, la purificación química de zinc del resto de los átomos, y luego el análisis de la relación isotópica en un espectrómetro de masas.

La calidad de Zn mediciones isotópicas depende de la calidad de la purificación química (pureza de Zn, bajo un borrador en blancoared a la cantidad de Zn presente en la muestra, rendimiento alto química del procedimiento) y en el control del sesgo instrumental. Se necesita la alta pureza de la fracción de Zn final para eliminar ambos interferencias isobáricas e interferencias no isobárica que crean un efecto de la matriz. Nucleidos isobáricas crean interferencias directas (por ejemplo, ⁶⁴ Ni). Interferencias no isobáricas generan el llamado efecto de "matriz" y alteran la precisión analítica de las mediciones por el cambio de la condición de la ionización en comparación con el estándar de zinc puro a la que las muestras se comparan con ^1. Un bajo blanco (<10 ng) indica que no hay contaminación de las muestras por Zn externa que sesgo la composición isotópica medido. Como isótopos de Zn pueden fraccionarse durante la cromatografía de intercambio iónico ^2, la colección de todos los átomos de Zn asegura que ningún fraccionamiento isotópico se produce, lo que implica que el procedimiento químico debe tener un rendimiento completo. Por último, la corrección del fraccionamiento isotópico decisivo durante la medición espectrometría de masas se realiza mediante el método de "horquillado estándar".

Por lo tanto, las principales dificultades para obtener mediciones precisas son el control de la contaminación externa (es decir, baja en blanco), la producción de una purificación química pleno rendimiento que está limpio de cualquier otros átomos o moléculas, y corregir el fraccionamiento isotópico instrumental en el espectrómetro de masas. En este artículo vamos a describir nuestro protocolo de análisis para separar Zn de los órganos de ratón, así como las mediciones de espectrometría de masas.

La extracción se realiza usando una baja cantidad de ácidos diluidos (HBr / HNO ₃ medios de comunicación) en micro-columnas (0.5 mu l y 0,1 mu l) de resina de intercambio aniónico. Tiene un rendimiento total y las mediciones tienen una reproducibilidad externa mejor que 50 ppm en la relación de ⁶⁶ Zn / Zn ^64. Otra ventaja de la metod es que es muy rápido. El método está por lo tanto muy bien adaptada a las ciencias médicas, en el que uno tiene que analizar un gran número de muestras en comparación con ciencias de la tierra, donde se desarrollaron estos métodos analíticos.

Protocolo

NOTA: Los procedimientos con animales han sido aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) en la Université Paris Diderot.

1. Preparación de los materiales

1. Sub-ebullición destilar 1 L de los ácidos (HNO _3, HBr) con el fin de purificarlos de la impureza.
2. Limpie los vasos y adaptador de punta en un caliente (~ 100 ° C) concentra HNO ₃ baño ácido durante al menos dos días.
3. Lavar las puntas de pipeta en un resfriado 3 N HNO ₃ baño durante varios días y enjuagar individualmente tres veces con agua desionizada.

Preparación 2. Muestra

1. Anestesiar a los ratones por inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina. Evaluar la anestesia por el método pizca dedo del pie.
2. Recoger la sangre por una punción cardiaca en presencia de heparina en tubos de 1,5 ml.
3. Separar el plasma de los glóbulos por centrifugación (10 min, 1500 xg) y transferir el plasma a polipropileno cviales ryogenic utilizando puntas de polipropileno.
4. Retire la sangre restante a partir de órganos por el corte de la vena hepática y la inyección de DPBS a través del corazón. Evaluar la muerte del ratón por dislocación cervical.
5. Cosecha de los órganos con instrumentos de acero inoxidable estériles, liberarlos de la grasa que rodea su caso, y SNAP-congelarlos en polipropileno viales criogénicos.

3. Química Purificación

1. En primer lugar, disolver las muestras en una mezcla de ~ 1 ml de concentrado (30%) H ₂ O ₂ y ~ 1 ml de concentrado (~ 15 M) HNO _3. ¿Todos estos pasos dentro de una campana de humos.
   1. Colocar todo el órgano de interés en un vaso de precipitados de teflón 15 ml. A continuación, añadir el H ₂ O ₂ / HNO ₃ al vaso ^5. Mantenga el vaso de precipitados abierto durante unos minutos con el fin de evitar salpicaduras debido a la reacción de oxidación de la materia orgánica y la liberación de CO _2.
   2. Por último, poner el vaso de precipitados sobre una placa caliente a about 100 ° C durante un par de horas o hasta que la solución es perfectamente claro.
2. Abrir el vaso de precipitados y secar la solución sobre una placa caliente a aproximadamente 100 ° C.
3. Una vez que la muestra está seca, añadir 1 ml de 1,5 N HBr a las muestras; cerrar el vaso y deje que se disuelva en una placa caliente a 100 ° C durante un par de horas.
4. Mientras tanto preparar las 500 columnas mu l.
   1. Añadir 500 l de la resina de malla AG1X8 200-400 a la columna y lo puso en el estante de la columna con un vaso de la basura debajo de ella. Lavar la resina alternando: 5 ml de 18,2 mO ⋅ cm de agua, 5 ml de 0,5 N HNO _3, 5 ml de agua, 5 ml de 0,5 N HNO _3, y luego 5 ml de agua. Acondicionar la resina con 5 ml de 1,5 N HBr.
5. Retire los vasos de la placa caliente y los puso en un baño de ultrasonidos durante aproximadamente 30 minutos, y luego dejar que los vasos se enfríen a temperatura ambiente.
6. Una vez que el vaso de precipitados se enfrió y la resina se lava, abra el vaso de precipitados. Ponga el adaptador de punta a tél jeringa, añadir una punta de pipeta; pipetear los 1 ml de muestra y cargarlo en la resina (muy lentamente a fin de no agitar la resina).
7. Una vez que todo el líquido pasa a través de la columna, añadir 5 ml de 1,5 N HBr.
8. Una vez que los 5 ml de 1,5 N HBr pasan a través de la columna, reemplazar el vaso de precipitados de basura con un limpio vaso de precipitados de 15 ml.
9. Añadir 5 ml de 0,5 N HNO ₃ 2,5 ml a la vez. En esta etapa el Zn se eluye de la resina.
10. Una vez 5 ml de HNO ₃ pasa a través de la columna, retire el vaso de precipitados y colocarlo en una placa caliente a 100 ° C hasta que se seca.
11. Retire la columna del soporte columna; trash la resina (usar una nueva resina para cada muestra).
12. Una vez que la muestra está seca, repetir el protocolo con el mismo volumen de ácidos sobre una columna más pequeña (100 l) y luego se coloca en un plato caliente hasta que se seca. La muestra está ahora listo para espectrometría de masas.

4. Masa-espectrometría de Medición

1. Analizar el compo isotópica Znsición en un colector acoplado inductivamente espectrómetro de masas con plasma multi (MC-ICP-MS).
   1. Utilice los parámetros de la máquina que se resumen en la Tabla 1.
2. Coloque las tazas de Faraday para recoger en masa (m / z) de ⁶² Ni, ⁶³ Cu, Zn ^{64, 65} Cu, Zn ^{66, 67} y ⁶⁸ de Zn Zn.
3. Preparar una solución que contiene Zn 500 ppb en 0,1 M HNO ₃ para el análisis isotópico.
4. Analizar la solución 500 ppb de Zn mediante el uso de una cámara de pulverización combinada con un / nebulizador teflón min 100 l. Para cada muestra, mida 30 exploraciones (1 bloque de 30 ciclos) en la que el tiempo de integración de cada exploración es 8,389 seg.
5. Corrija el fondo restando las intensidades de cero en pico de una solución en blanco (la M HNO ₃ 0,1 solución utilizada para volver a disolver las muestras).
6. Control y corregir posibles ⁶⁴ Ni interferencia isobárica mediante la medición de la intensidad del pico ⁶² Ni.Suponga que la relación ^{62 64} Ni / Ni es algo natural (0.2548), corregir el valor del sesgo masa instrumental, y luego retire el ⁶⁴ Ni en la masa 64 como:
   ⁶⁴ Zn _reales = ⁶⁴ Zn _medido - ⁶⁴ Ni = ⁶⁴ Zn _medido - ⁽⁶⁴ Ni / ⁶² Ni) _naturales x ⁶² _mide Ni.
7. Corregir el sesgo masa instrumental de horquillado cada una de las muestras con una solución de 500 ppb de la norma JMC Lyon Zn (u otro estándar disponibles, tales como IRMM-3702). Realizar el horquillado estándar dividiendo la relación Zn Zn ^66/64 de la muestra por el promedio de la relación Zn Zn ^66/64 de los dos estándares medidos antes y después de la muestra menos 1 y multiplicada por 1000 (véase la ecuación 1). Precisión externa típica en el estándar JMC Lyon Zn es 0,05 permil / amu (2 desviación estándar, 2 sd).

Resultados

En 1,5 N HBr, las principales especies de zinc (ZnBr3-) forma complejos muy fuertes con la resina de intercambio de aniones, mientras que la mayoría de otros elementos no interactúan con la resina. El zinc se recupera a continuación cambiando el medio a HNO ₃ diluido, el cambio de la especiación de Zn a Zn ²⁺ que se libera de la resina de ^6,7.

Las relaciones de isótopos se expresan típicamente como partes por 1000 desviaciones relativas a un estándar: ...

Discusión

La reproducibilidad de las mediciones se evalúa a través de análisis replicados de las mismas muestras realizadas durante las diferentes sesiones de análisis. Por ejemplo ^6, hemos reproducido la misma roca terrestre 7 veces y hemos obtenido los resultados presentados en la Tabla 2.

Como se esperaba de la teoría de fraccionamiento isotópico ¹⁰ y como se mide en cualquier material sistema solar hasta el momento (por ejemplo, meteorito ^...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
teflon beakers	Savillex	200-015-12
Home-made teflon colunms made with shrinkable teflon