マウス臓器に印加される高精度の亜鉛同位体測定

要約

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

要約

我々は、マウスの臓器における高精度の亜鉛同位体比で測定するための手順を提示します。亜鉛は、マウスの臓器の間に自然に分画される5安定同位体^（64 Znを^、66の^Zn、67の^Zn、68 Znおよび⁷⁰ Zn系）で構成されています。まず、Zn原子を解放するために、異なる臓器を溶解する方法を示しています。このステップは、HNO ₃とH ₂ O ₂の混合物によって実現されます。それから、希のHBr / HNO ₃媒体に陰イオン交換クロマトグラフィーによる同重体干渉（ 例えば 、Ni）の、より具体的には、他のすべての要素からの亜鉛原子を精製します。これらの最初の2つのステップは、高純度化学薬品を使用して、きれいな実験室で行われています。最後に、同位体比は、低解像度のマルチコレクタ誘導結合プラズマ質量分析計を用いて測定されます。サンプルはcorrecあるスプレーチャンバーと質量分析計により誘導される同位体分別を用いて注入されています標準（標準ブラケット技術）の比にサンプルの比率を比較することにより、テッド。この完全な典型的な手順は、50 ppmの（2 SD）再現性の同位体比を生成します。

概要

高精度（より良い100ppm以下/原子質量単位）の測定は、亜鉛安定同位体組成は約15年間、マルチコレクタプラズマソース質量分析計の開発のおかげで可能になった、それ以来、主に地球に適用されています惑星科学。医療分野への応用は、新規であり、亜鉛（ 例えば、アルツハイマー病）の代謝を変更する疾患のバイオマーカーとしての大きな可能性を持っています。本稿では、種々のマウス臓器で高精度に亜鉛の自然な安定同位体比を測定する方法を報告します。同じことが、ヒトサンプルに適用可能です。この方法は、臓器、原子の残りの部分からの亜鉛の化学的精製、その後、質量分析計での同位体比の分析の溶解で構成されています。

亜鉛同位体測定の質は、化学的精製（亜鉛の純度、低ブランクCOMPの品質に依存していますサンプル中のZnの存在量、手順の高い化学収率）にし、楽器のバイアスの制御にared。最終的な亜鉛画分の純度は、マトリックス効果を作成両方同重体干渉と非同重体干渉を除去するために必要とされます。同重体核種が直接干渉（ 例えば^、64のNi）を作成します。非同重体干渉は、いわゆる「マトリックス」効果を生成し、サンプルが¹と比較される純亜鉛の標準に比べてイオン化の条件を変更することにより、測定値の分析精度を変化させます。低ブランク（<10 ngの）そのバイアス測定同位体組成を、外付けのZnによる試料のコンタミネーションがないことを示しています。亜鉛同位体は、イオン交換クロマトグラフィーの間に²分画できるように、すべてのZn原子の集合は、化学的手順は、完全な収率を有していなければならないことを意味する、いかなる同位体分別が起こらないことを保証します。最後に、質量分析測定中の楽器の同位体分別の補正は、「標準ブラケット "メソッドを介して行われます。

そのため、正確な測定値を得るための主な困難は、他の原子または分子のクリーンで完全降伏化学的精製を製造、および質量分析計で楽器同位体分別の補正、外部汚染（ すなわち、低ブランク）を制御しています。本稿では、マウスの臓器と同様に質量分析の測定値からのZnを分離するために私たちの分析プロトコルを記述します。

抽出は、陰イオン交換樹脂のマイクロカラム（0.5μLおよび0.1μL）で希釈した酸（HBrを/ HNO ₃メディア）の少量を使用して行われます。これは、完全な収率を有しており、測定値が⁶⁶のZn / ⁶⁴のZn比で50ppmのよりも優れた外部再現性を持っています。メタの別の利点ODが、それは非常に高速であるということです。この方法は、極めてよくつこれらの分析法が開発された地球科学に比べて多数のサンプルを分析する必要のある、医学に適合されます。

プロトコル

注：動物を含む手順は、大学のパリディドロにおける施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。

材料の作製

1. サブ沸騰不純物からそれらを精製するために酸（HNO _3、HBrを）の1 Lを蒸留します。
2. きれいに熱い（〜100℃）でビーカーと先端アダプタは、少なくとも2日間HNO ₃酸浴を濃縮しました。
3. 数日間の冷3 N HNO ₃浴中でピペットチップを洗浄し、脱イオン水で個別に3回すすいでください。

2.サンプル調製

1. ケタミンとキシラジンの腹腔内注射によりマウスを麻酔。つま先のピンチ方式により麻酔を評価します。
2. 1.5ミリリットルチューブ内のヘパリンの存在下での心臓穿刺により血液を収集します。
3. 遠心分離（10分、1,500×gで）により血液細胞から血漿を分離し、ポリプロピレンcにプラズマを転送しますポリプロピレンのヒントを使用してryogenicバイアル。
4. 肝静脈を切断し、心臓にDPBSを注入することにより器官から残りの血液を除去。頚椎脱臼によりマウスの死を評価します。
5. 滅菌ステンレス鋼の機器との臓器を収穫、もしあれば脂肪周囲のそれらを解放し、スナップ凍結してポリプロピレンの低温バイアル中。

3.化学精製

1. まず、濃（30％）〜1ミリリットルH ₂ O _2、濃縮（15〜M）HNO ₃の約1 mlと混合物中にサンプルを溶解します。ヒュームフード内のすべての手順を実行してください。
   1. 15ミリリットルのテフロンビーカーに関心のある器官全体を配置します。その後、ビーカー⁵にH ₂ O ₂ / HNO _3を追加。有機物の酸化反応およびCO ₂の放出に起因する飛沫を避けるために、数分間開放ビーカーにしてください。
   2. 最後に、ABOのホットプレート上でビーカーを置きます時間のカップルのための、または溶液が完全に透明になるまで100℃でユタ。
2. ビーカーを開き、約100℃のホットプレート上に溶液を乾燥。
3. サンプルが乾燥すると、サンプルに1.5 NのHBrの1ミリリットルを追加します。ビーカーを閉じて、それが時間のカップルのため、100℃のホットプレート上で溶解させます。
4. 一方、500μlのカラムを準備します。
   1. 列にAG1X8 200〜400メッシュの樹脂の500μlを添加して、その下のゴミ箱のビーカーでカラムラックの上に置きました。 5ミリリットル18.2のMΩ⋅センチ水、0.5 N 5mlのHNO _3、5mlの水、0.5 N 5mlのHNO _3、および水の後、5ミリリットルを：交互に樹脂を洗浄。 1.5 NのHBr 5mlで樹脂を調整。
5. ホットプレートからビーカーを取り出して、約30分間超音波浴に入れ、その後、ビーカーを室温まで冷却させます。
6. ビーカーを冷却し、樹脂を洗浄した後、ビーカーを開きます。 tに先端アダプタを入れて彼は、注射器、ピペットチップを追加します。サンプルの1ミリリットルをピペット（樹脂を攪拌させないために、非常にゆっくりと）樹脂上にロードします。
7. すべての液体がカラムを通過した後、1.5 NのHBrの5ミリリットルを追加します。
8. 1.5 NのHBr 5mlをカラムを通過すると、きれいな15ミリリットルビーカーでゴミのビーカーを交換してください。
9. 一度に0.5 NのHNO ₃ 2.5ミリリットルの5ミリリットルを追加します。この段階で、Znが樹脂から溶出されます。
10. HNO ₃ 5mlをカラムを通過したら、ビーカーを除去し、乾燥するまで、100℃のホットプレート上に置きます。
11. カラムホルダーから列を削除します。樹脂をゴミ箱（各サンプルのための新しい樹脂を使用します）。
12. サンプルが乾燥したら、小さい列に酸（100μl）を同容量のプロトコルを繰り返した後、乾燥するまで、ホットプレートの上に置きます。サンプルは、質量分析のための準備ができました。

4.質量分析測定

1. 亜鉛同位体コンポを分析マルチコレクタ - 誘導結合プラズマ質量分析計（MC-ICP-MS）にジション。
   1. 表1にまとめた機械パラメータを使用してください。
2. ⁶²の^Ni、63銅^、64亜鉛、銅^65、66の^Zn、67 Znおよび⁶⁸ Znを質量（M / Z）で収集するために、ファラデーカップを置きます。
3. 同位体分析のために、0.1M HNO ₃で500 ppbでのZnを含む溶液を調製します。
4. 100μL/分テフロンネブライザーと組み合わせたスプレーチャンバを使用して、亜鉛の500 ppbの液を分析。各サンプルについて、各スキャンの積分時間は8.389秒である30のスキャン（30サイクルの1ブロック）を測定します。
5. ブランク溶液（サンプルを再溶解するために使用される、0.1M HNO ₃溶液）からのピークゼロ強度を差し引くことにより、バックグラウンドを修正してください。
6. ⁶² Niのピークの強度を測定することによって制御し、正しい可能性⁶⁴ Niの同重体干渉。⁶⁴のNi / ⁶² Ni比が（0.2548）自然で、楽器のマスバイアスから、この値を修正し、などのマス64の⁶⁴のNiを削除することを想定します。
   ⁶⁴ Znの_実 = ⁶⁴ Znを_測定 - ⁶⁴のNi = ⁶⁴のZnを_測定 - ^（64のNi / ⁶² Ni）の_自然のx ⁶² Niを_{測定しました} 。
7. JMCリヨンのZn標準の500 ppbの標準溶液（またはIRMM-3702のような別の利用可能な標準）での各サンプルをブラケットにより楽器マスバイアスを修正してください。 （ 式1を参照）は、2つの標準サンプルマイナス1前後で測定し、千を乗じの⁶⁶のZn / ⁶⁴のZn比の平均による試料の⁶⁶のZn / ⁶⁴ Znの比を割ることにより、標準のブラケットを実行します。 JMCリヨンのZn標準の一般的な外部精度は0.05パーミル/ AMU（2標準偏差、2 SD）です。

結果

1.5 NのHBrでは、主亜鉛種（ZnBr3-）陰イオン交換樹脂でフォーム非常に強い複合体は、他のほとんどの要素は、樹脂と相互作用しないながら。亜鉛は、その後、樹脂^6,7から放出される²⁺ Znに亜鉛の分化を変化させる、希釈HNO ₃に培地を変更することによって回収されます。

同位体比は、典型的には、標準に比べて千の偏差当たりの部として表現さ​?...

ディスカッション

測定の再現性は、異なる分析セッション中に行うと同じサンプルの複製された分析によって評価されます。例⁶のために、私たちは同じ地上岩を7回繰り返しており、我々は表2に報告された結果を得ました。

^（15〜17 例えば、隕石^11-13、植物^3-5、深海堆積物^14、動物）、これまで任意の太陽系材料で測定同位体分?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
teflon beakers	Savillex	200-015-12
Home-made teflon colunms made with shrinkable teflon