마우스 기관에 적용 높은 정밀도 아연 동위 원소 측정

요약

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

초록

우리는 마우스 기관에서 높은 정밀도 아연 동위 원소 비율로 측정 할 수있는 방법을 제시한다. 아연은 자연스럽게 마우스 기관 사이에 분획있다 (5) 안정 동위 원소 ⁽⁶⁴ 아연, 아연 ^{66, 67} 아연, ⁶⁸ 아연 및 아연 ^70)로 구성되어있다. 우리는 먼저 아연 원자를 확보하기 위해 다른 기관을 용해하는 방법을 보여줍니다; 이 단계는 HNO _3, H ₂ O _(2)의 혼합물에 의해 실현된다. 우리는 그 다음 묽은의 HBr / HNO ₃ 매체에 음이온 교환 크로마토 동중 간섭 (예, 니켈)로부터 특히 다른 모든 요소에서 아연 원자를 정제. 이러한 처음 두 단계는 고순도 화학 물질을 사용하여 깨끗한 실험실에서 수행된다. 마지막으로, 동위 원소 비율은 낮은 해상도, 다중 콜렉터 유도 결합 플라스마 질량 분석계를 사용하여 측정된다. 샘플 correc 인 스프레이 챔버 및 질량 분광기에 의해 유도 된 분획을 사용하여 동위 원소 주입표준 (표준 브라켓 기술)의 비율로 샘플의 비율을 비교하여 테드. 이것은 전체 전형적인 절차는 50ppm (2 SD) 재현성 동위 원소 비를 생성한다.

서문

높은 정밀도의 측정은 (더 이상 100 PPM / 원자 질량 단위) 아연 안정 동위 원소 조성은 다중 콜렉터 플라즈마 소스 질량 분석기의 개발로 약 15 년 감사 가능한 왔으며 보낸 주로 어스 적용된 행성 과학. 의료 분야에 응용 프로그램은 소설이며, 아연의 대사 (예를 들어, 알츠하이머 병)를 수정 질환의 바이오 마커로서 강력한 잠재력을 가지고있다. 이 논문은 여러가지 마우스의 장기에 고정밀 아연 천연 안정 동위 원소 비율을 측정하는 방법을보고한다. 같은 인간의 샘플에 적용될 수있다. 이 방법은 장기 원자의 나머지 아연의 화학적 정제 한 다음 질량 분광기상에서 동위 원소 비의 분석 용해 이루어져있다.

아연 동위 측정 품질은 화학 정제의 품질 (아연의 순도, 낮은 빈 샘플 콘텐츠에 의존샘플에 존재하는 아연의 양에 ared, 높은 화학적 과정의 수율)과 계기 바이어스 컨트롤. 최종 Zn으로 분획의 고순도가 매트릭스 효과를 동중 간섭 비 등압 간섭 모두를 제거하는데 필요하다. 동중 핵종 직접 간섭 (예를 들어, ⁶⁴ 니켈)을 만듭니다. 비 동중 간섭은 소위 "매트릭스"효과를 생성하고, 시료 ^1로 비교되는 순수한 아연 표준에 비해 이온화 상태를 변경하여 측정 분석의 정밀도를 변경. 저 빈 (<10 NG)는 외부 아연에 의한 샘플의 어떤 오염이 없음을 나타냅니다 바이어스 측정 된 동위 원소 조성 것. 아연 동위 원소가 이온 교환 크로마토 그래피에 ² 중 분획 수있는 바와 같이, 모든 아연 원자의 컬렉션에는 동위 원소 분획은 화학적 방법으로 전체 수율을 가져야한다는 것을 의미하는 발생하지 않는 것을 보장. 마지막으로, 질량 분석기 측정시 악기 동위 원소 분별의 보정은 "표준 브라케팅"방법을 통해 이루어집니다.

따라서, 주요 어려움 얻기 위해 정확한 측정은 다른 원자 또는 분자의 깨끗 전체 수율 화학 정제를 생산, (빈 즉, 낮음) 외부 오염을 제어하고, 질량 분석기에 쓸모 동위 원소 분류를 수정하고 있습니다. 본 논문에서는 마우스의 장기뿐만 아니라 질량 분광법 측정으로부터 아연을 분리하기 위해 분석 프로토콜을 설명한다.

추출은 음이온 교환 수지의 마이크로 컬럼 (0.5 μL, 0.1 μL)에 희석 산의 낮은 양 (HBr로 / HNO ₃ 용지)를 사용하여 수행된다. 그것은 전체 수율을 가지며, 측정 재현성을 외부 Zn으로 ⁶⁶ / ⁶⁴ 아연 비율에 더는 50ppm 이하를 갖는다. 메트의 또 다른 장점OD는 아주 빠르다는 것이다. 방법은 하나 따라서 잘 이러한 분석 방법이 개발되었다 지학에 비해 많은 수의 샘플을 분석 할 필요가있는 의료 과학하도록 구성된다.

프로토콜

참고 : 동물을 포함하는 절차는 Université 파리 디드로의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

재료 1. 준비

1. 하위 종기 더러움을 정화하기 위해 산의 1 L (HNO _3의 HBr)를 증류.
2. 뜨거운 (~ 100 °의 C)에서 커와 팁 어댑터 청소 적어도 이틀 동안 HNO ₃ 산욕을 농축시켰다.
3. 며칠 동안 감기 3 N HNO ₃ 조에서 피펫 팁을 세척하고 탈 이온수 개별적으로 세 번 씻어.

2. 샘플 준비

1. 케타민과 자일 라진의 복강 내 주사하여 쥐를 마취. 발가락 핀치 방법으로 마취를 평가합니다.
2. 1.5 ㎖의 튜브에 헤파린의 존재하에 심장 천자에 의해 혈액을 수거.
3. 원심 분리 (10 분, 1,500 XG)에 의해 혈액 세포에서 플라즈마를 분리 및 폴리 프로필렌 (C)에 플라즈마를 전송폴리 프로필렌 정보를 사용하여 ryogenic 병.
4. 심장을 관통 DPBS를 간 정맥을 절단하고 주입하여 기관에서 남아있는 혈액을 제거합니다. 자궁 전위에 의해 마우스의 죽음을 평가합니다.
5. 멸균 스테인레스 스틸 악기와 장기를 수확있는 경우 지방 주변을 무료로, 폴리 프로필렌 극저온 유리 병에서 그들을 동결 스냅.

3. 화학 정제

1. 첫째, 집중 (30 %)의 ~ 1 ml의 H ₂ O _2와 농축 (~ 15 M) HNO ₃ ~ 1 ML의 혼합에 샘플을 녹인다. 흄 후드 내부의 모든 단계를 수행합니다.
   1. 15 ml의 테플론 비커에 관심있는 모든 기관을 놓습니다. 그런 다음, 비커 ⁵ H ₂ O ₂ / HNO _3를 추가합니다. 유기물의 산화 반응 및 CO _2의 방출로 인한 스플래시를 피하기 위해 몇 분 동안 열기 비이커 유지.
   2. 마지막으로, ABO 핫 플레이트에 넣어 비이커솔루션 시간이나 때까지 몇 UT 100 ° C는 완벽하게 알 수있다.
2. 비커를 열고 약 100 ℃의 핫 플레이트에 솔루션을 건조.
3. 샘플이 건조되면, 샘플에 1.5 N의 HBr 1 ㎖을 추가; 비커를 닫고 몇 시간 100 ℃에서 핫 플레이트에 용해 할 수 있습니다.
4. 한편 500 μL 열을 준비합니다.
   1. 컬럼에 AG1X8 200-400 메쉬 수지의 500 μl를 추가하고 아래의 쓰레기 비커와 열 선반에 넣어. 5 ㎖ MΩ ⋅ cm, 물, 0.5 N HNO ₃ 5 ㎖, 물 5 ㎖, 0.5 N HNO ₃ 5 ㎖ 18.2을, 그리고 물을 5 ml의 : 교번하여 수지를 씻어. 1.5 N HBr을 5 ml의 수지를 조정.
5. 비커 실온까지 냉각 할 수 후 열판에서 비커를 제거하고 약 30 분간 초음파 욕조에 넣어합니다.
6. 비이커 냉각시키고 수지를 세척 후, 비커를 연다. T로 끝 어댑터를 넣어그는 주사기 피펫 팁을 추가; 샘플의 1 ml에 피펫 (수지를 선동하지 않기 위해 매우 느리게) 수지에로드합니다.
7. 모든 액체가 컬럼을 통해 통과하면 1.5 N의 HBr 5 mL를 추가한다.
8. 1.5 N의 HBr의 5 ml의 칼럼을 통해 합격 한 후, 깨끗한 15 비이커와 쓰레기 비커를 교체합니다.
9. 한 번에 0.5 N HNO ₃ 2.5 ml의 5 mL를 추가합니다. 이 단계에서 아연이 수지로부터 용출된다.
10. HNO _3의 5 ml의 컬럼을 통과하면, 비커를 제거하고 건조 할 때까지 100 ℃의 핫 플레이트에 놓습니다.
11. 열 홀더에서 열을 제거; 수지 쓰레기 (각 샘플에 대한 새로운 수지를 사용).
12. 샘플이 건조되면, 작은 컬럼에 산 (100 μL)의 동일한 부피의 프로토콜을 반복 한 후 건조 할 때까지 핫 플레이트 위에 놓는다. 샘플은 질량 분석을위한 준비가되었습니다.

4. 대량 분석 측정

1. 아연 동위 원소 COMPO 분석멀티 콜렉터 - 유도 결합 플라즈마 질량 분석기 (MC-ICP-MS)에 sition.
   1. 표 1에 요약 시스템 파라미터를 사용한다.
2. ⁽⁶²⁾ 니켈, 구리 ^{(63), (64)} 아연, 구리 ^{(65), (66)} 아연, 아연 ^{67, 68} 아연의 질량 (M / Z)에서 수집하는 패러데이 컵을 놓습니다.
3. 동위 원소 분석을 위해 0.1 M HNO ₃ 500 PPB의 아연을 함유 한 용액을 준비합니다.
4. 100 μL / 분 테플론 분무기와 함께 분무 챔버를 사용하여 아연 500 ppb의 용액을 분석한다. 각 샘플에 대해, 각 주사의 통합 시간은 8.389 초 30 인 스캔 (30 사이클의 1 블록)를 측정한다.
5. 빈 솔루션 (샘플을 다시 용해하는 데 사용되는 0.1 M HNO ₃ 용액)에서의 피크 제로 강도를 뺀 배경을 수정합니다.
6. 제어 및 ⁶² 니켈 피크의 강도를 측정하여 정확한 수 ⁽⁶⁴⁾ 니켈 동중 간섭.올바른, ⁶⁴ 니켈 / ⁶² 니켈의 비율이 자연이라는 악기 질량 바이어스에서이 값을 (0.2548)을 가정 한 다음과 같은 질량 64 ⁶⁴ 니켈을 제거 :
   _측정 ⁽⁶⁴⁾ 아연 _실제 = ⁶⁴ 아연 - 니켈 _측정 ⁽⁶⁴⁾ = ⁶⁴ 아연 - ⁽⁶⁴ 니켈 / ⁶² 니켈)는 ⁶² X _자연은 니켈 _측정.
7. JMC 리옹 아연 표준의 500 ppb의 표준 용액 (또는 IRMM-3702과 같은 다른 가능한 표준)으로 각각의 샘플을 다단계로 악기 대량 편견을 수정합니다. 이전과 샘플 1을 뺀 후에 측정 1,000 곱하여 두 표준 ⁶⁶ 아연 / ⁶⁴ 아연 비율 평균하여 샘플의 ⁶⁶ 아연 / ⁶⁴ 아연 비율 나눈 표준 브라케팅 수행 (수학 식 1 참조). JMC 리옹 아연 표준에 전형적인 외부 정밀도는 0.05 permil / AMU (2 표준 편차, 2 SD)입니다.

결과

1.5 N의 HBr에서 메인 아연 종 (ZnBr3-) 음이온 교환 수지와 함께 강한 착물 형성은 대부분의 다른 요소는 수지와 상호 작용하지 않는 상태. 아연은, 희석 HNO ₃ 매질을 변화 ^-6,7- 수지로부터 방출되는 Zn을 Zn과의 분화 ^​​2+ 변경함으로써 회수된다.

동위 원소 비율은 전형적으로 표준 편차에 대하여 1,000 분율로 표현된다 :

토론

측정의 재현성이 다른 분석 세션 동안 수행 동일한 샘플 복제의 분석을 통해 평가된다. 예 ^6에서, 우리는 같은 지상파 록 7 번 복제 된 우리가 표 2에보고 된 결과를 얻었다.

동위 원소 분별 ^(10)의 이론에서 예상하고 지금까지 어떤 태양계 물질의 측정 (예, 운석 ^{11-13, 3-5,} 심해 퇴적물 ^(14), 동물 ^{15-17 식물)으로,} 결과는 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
Teflon beakers	Savillex	200-015-12
In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon