JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Abstract

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.

For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Introduction

أحادي الطبقة أو تعليق الحالية فحوصات زراعة الخلايا لتطوير الأدوية تفشل في محاكاة المكروية الخلوية الإنسان، وبالتالي يؤدي إلى فقد التمايز السريع وفقدان وظائف في مزارع الخلايا البشرية الأولية. وهناك حاجة إلى نماذج الأنسجة مع ارتفاع أهمية الفسيولوجية للتنبؤ فعالية وسلامة المركبات قبل قبولهم في التجارب السريرية. في الآونة الأخيرة، ومعيار في تقنيات زراعة الخلايا في المختبر تطورت من الثقافات أحادي الطبقة ثنائية الأبعاد إلى نماذج متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد، وتهدف لمحاكاة في الجسم الحي الأنسجة المكروية. هذه النظم قد أظهرت بالفعل تحسينات رئيسية نحو التنبؤ أكثر دقة من طريقة عمل مركبات 1،2. وعلاوة على ذلك، والتكيف في المختبر ظروف التربية لاحتياجات متخصصة للغاية من خلايا غير ذات أهمية خاصة.

تحت مستوى في ظروف المختبر، ومجموعة متنوعة من طريق مسدود المهمالمعلمات تلح، مثل المغذيات والأكسجين العرض، وإزالة تراكم المنتجات، وقوة ميكانيكية تعمل على خلايا في كثير من الأحيان لا يمكن التحكم بدقة في معظم الحالات. تمتلك العديد من الأجهزة التدرجات تركيز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للمواد والأكسجين الذائب. ومع ذلك، هذه الشروط درجة عالية من التنظيم والأمثل هي في تناقض واضح مع التدرجات نشر لا يمكن السيطرة عليها في جميع أنحاء الأنسجة تحت ظروف في المختبر، مما يؤدي إلى بيئة غير مستقرة للغاية والحد من تطوير الخلوية 3. وهكذا، مطلوبة أكثر ثباتا وأكثر قابلة للقياس الكمي وخاصة في ظروف المختبر للحفاظ على الخلايا قابلة للحياة ومتباينة على مدى فترات طويلة من الزمن. أنظمة perfused ل، حيث يتم إزالة بانتظام المكونات المتوسطة واستبدال، وغالبا ما تكون أفضل السمات التي تميزت والسيطرة عليها من ثقافات ثابتة بشأن المحيطة مباشرة من الأنسجة. في ظل ظروف ثابتة، التدرجات نشر إفرازات الخلايا والعناصر الغذائية مستنبتقد تحيط الخلايا المستزرعة 3. إدخال جيدا اتسم معدلات تدفق المتوسطة في جميع أنحاء الأنسجة تسمح للإفرازات الخلية إلى المزيج مع المتوسط ​​الغني من خلال نضح. وهذا يتيح توليد microenvironments الخلوية المحددة، وضمان النمط الظاهري الخلوية مستقر ويتفاعل التعبير انزيم طوال فترة الفحص كلها 4.

المستندة إلى التطورات الأخيرة في الأعضاء المتعددة رقاقة (وزارة التجارة) نظم تجمع بين فوائد تدفق المتوسط ​​تسيطر حول هندسة الأنسجة مع متطلبات المتوسطة وكتلة الخلايا صغيرة من المفاعلات الحيوية الميكروسكيل، مما يؤدي إلى نقص كمية مادة اللازمة أثناء الاختبار. وقد وصفت العديد من أنظمة ميكروفلويديك لزراعة الأنسجة حتى الآن 5،6. الأنسجة إلى السائل النسب داخل هذه الأنظمة تلعب دورا حاسما وخصوصا في محاكاة الحديث المتبادل الخلوي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك، بسبب القيود التقنية، مثل استخدام المضخات الخارجية والخزانات وسائل الاعلام، الالبريد المنتشرة عموما حجم وسائل الإعلام في معظم النظم كبير جدا بالمقارنة مع حجم الأنسجة. وكانت مجموعة من شولر وآخرون أول من وضع نظام يكفل الأوقات الإقامة المناسبة للمواد داخل مقصورات زراعة الخلايا في الجسم الحي والنسب ذات الصلة 7،8 الأنسجة إلى السائل. وقد تحقق ذلك عن طريق التوسع الخزان الخارجي وصولا الى لوحة 96-جيدا، وتمثل أيضا "الأنسجة الأخرى" المقصورة. من أجل تقليل حجم وسائل الإعلام المنتشرة ضمن منصة وزارة التجارة لدينا، نحن متكاملة لتحوي micropump على الرقاقة، مما يلغي الحاجة للدوائر وسائل الإعلام الخارجية. هذا micropump قادر على تشغيل النظام في اختيار عدد من سرعات تدفق وسائل الاعلام ومعدلات إجهاد القص 9. نظام قناة ميكروفلويديك من 500 عرض ميكرون و 100 ميكرون ارتفاع سيربط اثنين موحدة مساحات زراعة الأنسجة، ولكل منها حجم بئر واحد من لوحة 96-جيدا. التمسك أحجام معيار الصناعة لوحة جيداالصورة يسمح دمج نماذج الأنسجة الموجودة بالفعل إنتاجها في شكل transwell. وعلاوة على ذلك، الوضع الرأسي للtranswell إدراج ثقافة الخلية هو قابل للتعديل، مما يتيح زراعة نماذج الأنسجة التي لم يتم كشفها مباشرة فقط لتدفق السوائل، ولكن يمكن أيضا أن رفعت ومحمية من التيار الأساسي. وبالمثل، الثقافات واجهة الهواء السائل قابلة للتنفيذ باستخدام هذا النظام.

ملفقة منصة وزارة التجارة من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) طبقة 2 مم عالية والمجهر شريحة زجاجية مع بصمة من 75 × 25 مم 2، والتي المستعبدين بشكل دائم عن طريق انخفاض ضغط الأكسدة البلازما لتشكيل دائرة السائل ضيق ميكروفلويديك. ويتم إنتاج طبقة PDMS تحتوي على قنوات كل منها والمقصورات ثقافة الخلية عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة القياسية وصب متماثلة 9. تصميم ميكروفلويديك من وزارة التجارة التي استخدمت خلال هذه الدراسة يتكون من اثنين من الدوائر ميكروفلويديك منفصلة لكل شريحة، كل تحتجز اثنين من خلية جمقصورات ulture مترابطة من خلال نظام القناة 100 ميكرون عالية. هذا ما سمح للأداء الفردي اثنين cocultures الأنسجة اثنين باستخدام رقاقة واحدة الأعضاء المتعددة. تم تعديل ترددات ضخ أن تسفر معدلات تدفق المتوسطة من 40 ميكرولتر / دقيقة.

هذا التصميم MOC الأنسجة اثنين توفير القدرة على coculture كروي الكبد وخزعة الجلد لكمة في الأماكن ثقافة منفصلة، ​​وإن كان ذلك في دائرة الإعلام جنبا إلى جنب في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. تم تجميع خلايا متباينة HepaRG جنبا إلى جنب مع الخلايا البشرية الكبدية النجمية (HHSteC) بنسبة 24: 1 لتشكيل الأجسام الشبه الكروية متجانسة. تم العثور على هذه النسبة لتكون الأمثل، كما لوحظ في التجارب السابقة 10، على الرغم من، ما يقرب من ضعف عدد خلايا الكبد واستخدمت مقارنة مع الوضع في الجسم الحي. كان يزرع الجلد في واجهة الهواء السائل داخل ثقافة إدراج خلية transwell، وبالتالي تمكين التعرض مادة موضعي. تم cocultivated هذه النماذج الأنسجة لمدة 28 دآيس في وزارة التجارة للتدليل على شمولية هذا النظام. وعلاوة على ذلك، على حلبة قناة ميكروفلويديك من رقائق كانت مغطاة تماما مع الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الجلدية الإنسان (HDMEC) لمحاكاة أكثر عن كثب الأوعية الدموية.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على القلفة الأحداث البشرية مع موافقة موافقة وأخلاقيات علم (لجنة أخلاقيات الطب جامعة شاريتيه في برلين، ألمانيا)، وفقا للقوانين ذات الصلة، من جراحة الأطفال بعد الختان الروتيني.

1. إنتاج مكافئات الأنسجة للزراعة في وزارة التجارة

  1. تجميع HepaRG وHHSteC في شنقا لوحات قطرة لتوليد الأجسام الشبه الكروية الكبد.
    1. من أجل تحقيق trypsinization الخلايا HepaRG تزرع في قوارير ثقافة خلية (75 سم 2)، وإزالة المتوسطة من متكدسة والثقافات أحادي الطبقة متباينة، ويغسل مع PBS مرتين، وإضافة 3 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA. احتضان لمدة 3 إلى 5 دقائق عند 37 ° C ووقف رد فعل عن طريق إضافة 6 مل من التربسين المانع.
    2. خلايا الطرد المركزي HepaRG في 150 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل من ثقافة الخلية HepaRG المتوسطة، وعدد الخلايا. وينبغي أن يكون بقاء الخلية> 90٪.
    3. فيأجل تحقيق trypsinization الخلايا HHSteC، وإزالة المتوسطة من الثقافات أحادي الطبقة، ويغسل مع PBS مرتين، وإضافة 3 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، ووقف رد فعل عن طريق إضافة 6 مل من التربسين المانع.
    4. الطرد المركزي الخلايا HHSteC في 150 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل من ثقافة الخلية HepaRG المتوسطة، وعدد الخلايا.
    5. الجمع بين HepaRG وHHSteC بنسبة 24: 1 في HepaRG مستنبت الخلية. للقيام بذلك، وضبط أعداد الخلايا عن طريق تمييع تعليق خلية في HepaRG مستنبت الخلية وإضافة 1 × 10 5 خلية / مل HHSteC إلى 4.8 × 10 6 خلايا خلية / مل HepaRG. مزيج بعناية.
    6. إعداد قطرة لوحة معلقة بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني إلى انخفاض شنقا لوحة والمتلقي.
    7. ماصة 20 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من لوحة قطرة شنقا. إعداد دائما قطرات حوالي 10٪ أكثر مما تحتاج شنقا لاسترداد المجاميع، كما فقدت بعض المجاميع الدورينانوغرام الإجراء. وضع بعناية لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية. انتظر 48 ساعة لالكروية لتشكيل.
    8. من أجل استرداد الكروية، تأكد من استخدام نصائح ماصة مع نهايات طرف واسعة أو قطع نصائح من 1 مل نصائح ماصة بسكين معقمة من أجل توسيع الانفتاح على حوالي 2 إلى 3 مم. استخدام هذه النصائح ماصة للتعامل مع الأجسام الشبه الكروية دون تعطيل لهم.
    9. يغسل الأجسام الشبه الكروية بعناية من لوحة قطرة شنقا بإضافة مرارا وتكرارا 1 مل من وسائل الإعلام إلى الأعلى من الآبار من لوحة قطرة شنقا باستخدام ماصة. غسل لوحة حتى سقطت كل الأجسام الشبه الكروية خارج. الأجسام الشبه الكروية هي قليلا مع قطر متوسط ​​من 300 و 400 ميكرون وارتفاعها بين 200 و 300 ميكرومتر في هذه المرحلة على شكل قرص.
    10. جمع الأجسام الشبه الكروية في لوحة الاستقبال ونقلها إلى لوحات مرفق 24-كذلك منخفضة للغاية بحد أقصى 20 الأجسام الشبه الكروية لكل بئر باستخدام ماصة نصائح المعدة. ضبط كميات سائل الإعلام في كل بئر إلى 0.5 مل. استخدام 20 المجاميع لاينوculate واحد الدائرة زارة التجارة للحصول على معدل التصغير من 1 / 100،000 فيما يتعلق بأعداد خلية الجسم الحي.
    11. احتضان الأجسام الشبه الكروية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى استخدامها مرة أخرى في وزارة التجارة. لا تقم بتخزين الكروية أطول من ثلاثة أيام قبل الاستخدام لضمان إمكانية المقارنة. زراعة المجاميع ليوم واحد على الأقل في لوحات مرفق منخفضة للغاية لاسترداد الكروية متجانسة.
  2. متابعة أي من النهجين لتوليد حكمه أنسجة الجلد: استخدام الخزعات لكمة (1.2.1) أو استخدام الجاهزة في نماذج الأنسجة في المختبر (1.3.1).
    1. قطع transwells مع سكين المتوهجة تحت قوس لإعداد 96-جيدا إدراج ثقافة خلية وتخزين تحت ظروف معقمة حتى استخدامها مرة أخرى.
    2. تعقيم عينات القلفة في 80٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية وقطع حلقة مفتوحة. وينبغي أن يكون عينات يبلغ متوسط ​​ارتفاعها 2 مم.
    3. استخدام لكمة خزعة لخفض خزعات من 4.5 مم للحصول على miniaturiza يساوينسبة نشوئها لكل من الكبد والجلد. تحميل الخزعات في استعداد 96-جيدا transwell إدراج بالملقط. احرص على وضع الخزعات مع الجانب البشرة متجهة لأعلى.
    4. ثقافة مكان خلية إدراج مع الخزعات في طبق استقبال تحتوي على HepaRG مستنبت الخلية وتخزينها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى استخدامها مرة أخرى في وزارة التجارة. لا تخزين العينات لفترة أطول من 2 إلى 3 ساعة.
  3. دمج الجاهزة في نماذج الجلد في المختبر، تم شراؤها من مختلف الموردين، إلى وزارة التجارة، والتأكد من أنهم في 96-جيدا شكل transwell. استخدام خلية ثقافة المتوسط ​​الموردة من قبل البائع أو، إذا تم المتوخاة من coculture مع أنسجة أخرى في خطوة أخرى، استخدم وسيلة الحد الأدنى من دعم كل من الأنسجة. اختبار المتوسطة الحد الأدنى منها في التجارب السابقة ثابتة لقدرته على دعم الأنسجة.
    1. استرداد نماذج الجلد من لوحة حامل وقطع إدراج 96-أقل بكثير من شريحة مع سكين وهاج.
    2. ضع إدراج مرة أخرى في لوحة الاستقبال وتخزينها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى استخدامها مرة أخرى في وزارة التجارة. لا تخزين عينات أطول من يوم واحد.

2. تلفيق وزارة التجارة

  1. خلط PDMS وكيل علاج في نسبة 10: 1 (ت / ت) ووضع الخليط في ظل فراغ لمدة 15 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
  2. وفي الوقت نفسه، علاج البولي غطاء لوحة مع المضافات المطاط والسيليكون في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. إدراج مسامير تفلون في ثقوب كل من غطاء لوحة لإنشاء مقصورات أربعة المجانية PDMS-زراعة الخلايا والأغشية PDMS ستة، 500 ميكرون سميكة، من micropump.
  4. سد أعد غطاء لوحة إلى القالب الرئيسي من اثنين من الدوائر الاوعية الدموية الدقيقة وحقن PDMS نزع الغاز. والحرص على عدم دمج فقاعات الهواء في النظام. إذا فقاعات تظهر، في محاولة لإزالتها عن طريق إمالة الجهاز.
  5. احتضان النظام في 80 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة لعلاج طبقة PDMS.
  6. إزالة القالب الرئيسي ومسامير تفلون من الجهاز والسندات طبقة PDMS إلى شريحة زجاجية مع بصمة 75 × 25 مم 2 باستخدام انخفاض ضغط الأكسدة البلازما.
  7. المسمار محولات موضوع MOC خاصة لجميع المقصورات ثقافة الخلية الأربعة من غطاء لوحة.
  8. توصيل الحقن التي تحتوي على مستنبت إلى الإناث لور س ¼-28 محولات الذكور والمسمار لهم المحولات وزارة التجارة من الغطاء لوحة.
  9. حقن المتوسطة في الدائرة ميكروفلويديك عن طريق دفع مرارا وتكرارا إلى أسفل وسحب ما يصل الغطاسون محاقن.
  10. تحقق ملء السليم للقنوات مع المتوسط ​​تحت المجهر.

3. تبطنن من وزارة التجارة

  1. قبل endothelializing وزارة التجارة، دافق كل دائرة وزارة التجارة مع خلية البطانية المتوسطة النمو واحتضان أنه ثابت لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    1. تعقيم MOCS باستخدام الايثانول مسح ووضعها تحت مقعد تدفق الصفحي. أنان بالإضافة إلى ذلك، تعقيم اثنين من أزواج من ملقط ومفتاحين سداسية لاستخدامها مرة أخرى.
    2. تخفيف قبعات من مقصورة زراعة الأنسجة من وزارة التجارة باستخدام مفاتيح سداسية وتنزع الأغطية باستخدام ملقط. بعد إدخال المتوسطة، المسمار قبعات مرة أخرى إلى MOCS بنفس الطريقة.
  2. من أجل تحقيق trypsinization من الجلد الاوعية الدموية الدقيقة الخلايا البطانية الإنسان (HDMEC)، وإزالة المتوسطة من الثقافات أحادي الطبقة، ويغسل مع PBS مرتين، وإضافة 3 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، ووقف رد فعل عن طريق إضافة 6 مل من التربسين المانع.
  3. أجهزة الطرد المركزي في HDMEC في 220 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل من البطانية المتوسطة نمو الخلايا، وعدد الخلايا. وينبغي أن يكون بقاء الخلية> 90٪.
  4. ضبط عدد الخلايا في تعليق خلية إلى تركيز النهائي من 2 × 10 7 خلية / مل عن طريق تمييع مع البطانية المتوسطة نمو الخلايا ونقل 250 ميكرولتر من لحقنة 1 مل. تطبيق هذا تركيز الخلايا إلى وزارة التجارة للحفاظ على معدل التصغير من 1 / 100،000 لجميع الأجهزة.
  5. ربط حقنة لأنثى لور س ¼-28 محول الذكور، وطرد الهواء للخروج من هذا المناسب، والمسمار على محول خاص موضوع زارة التجارة. ربط محول إلى واحد من اثنين من مقصورات من كل دائرة وزارة التجارة.
  6. توصيل حقنة فارغة في نفس الطريق إلى المقصورة الثانية من الدائرة وزارة التجارة.
  7. حقن الخلايا بالتساوي عن طريق دفع إلى أسفل وسحب ما يصل اثنين من الغطاسون حقنة عدة مرات بطريقة متتالية. السيطرة على ضخ الخلايا تحت المجهر.
  8. احتضان وزارة التجارة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في ظل ظروف ثابتة لمدة 3 ساعة للسماح للخلايا على الانضمام إلى جدران القناة.
  9. إزالة الشريحة من الحاضنة، وضعه تحت مقعد تدفق الصفحي، واستبدال المحاقن والمحولات وزارة التجارة مع خاصة موضوع MOC غرف ثقافة الخلية.
  10. إضافة 400 ميكرولتر من متوسطة جديدة لكوم واحدالمصدر: إدارة كل دائرة وزارة التجارة والسماح لها مطاردة من خلال القنوات التي كتبها الضغط الهيدروليكي. بعد ذلك، استبدل المتوسطة في كل من المقصورات مع 300 ميكرولتر من متوسطة جديدة.
  11. إغلاق مقصورات باستخدام القبعات، وكما هو موضح في 3.1.2.
  12. ربط رقاقة إلى وحدة تحكم المضخة. ضبط سرعة الضخ إلى تردد من 0.475 هرتز وزراعة رقاقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  13. استبدال المتوسطة في كل حجرة وزارة التجارة كل واحد إلى يومين ورصد مورفولوجيا الخلايا بواسطة المجهر الضوئي.

4. تحميل من رقاقة

  1. وضع وزارة التجارة تحت مقاعد البدلاء تدفق الصفحي وفتحه، كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.
  2. إزالة وسائل الإعلام من المقصورات زراعة الأنسجة واستبدالها مع 300 ميكرولتر من الطازجة HepaRG مستنبت الخلية.
  3. نقل 20 الأجسام الشبه الكروية بريفورميد إلى الأنسجة واحد الثقافة مقصورة من كل دائرة وزارة التجارة باستخدام نصائح ماصة مع فتحة واسعة (انظر الخطوات 1.1.8 / 9). إغلاق جا ف ب باستخدام ملقط ومفاتيح سداسية.
  4. نقل 96-جيدا إدراج ثقافة الخلية التي تحتوي على حكمه الجلد إلى ما تبقى مقصورة زراعة الأنسجة من كل دائرة وزارة التجارة باستخدام ملقط. الحرص على تجنب تشكيل فقاعة تحت الغشاء ما يعادل الجلد. من أجل القيام بذلك، أدخل transwells بزاوية مائلة قليلا ودفع إلى أسفل بلطف. إزالة المتوسطة الزائدة حول transwell يتم دفعها من الأسفل مع ماصة.
  5. أغلق الغطاء باستخدام ملقط ومفاتيح سداسية.

5. ربط رقاقة إلى وحدة تحكم مضخة

  1. المطلوب تعيين المعلمات التشغيلية في وحدات التحكم إلى القيم. تعديل ضغط الهواء من 0 إلى 8،000 م بار، والفراغ من 0 إلى -800 م بار، وضخ تردد ،24-2،4 هرتز. تحديد اتجاه الضخ في اتجاه عقارب الساعة أو عكس.
  2. إزالة وزارة التجارة التي تحتوي على حكمه الأنسجة من تحت مقاعد البدلاء تدفق الصفحي وتوصيله إلى وحدات تحكم مضخة.
  3. بعد numeratأيون على أنابيب، إدراج ضغط الهواء أنابيب إلى التجهيزات الخاصة على وزارة التجارة.
  4. زراعة وزارة التجارة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة أو، في حالة التصوير الأنسجة الحية، استخدم دعم وزارة التجارة لتسخين رقاقة إلى 37 درجة مئوية وزراعة رقاقة خارج الحاضنة. استخدام الدعم ساخنة لزراعة الخلايا في وزارة التجارة تحت المجهر القياسية.

6. إجراء تبادل وسائل الإعلام، أخذ العينات وسائل الإعلام والتعرض للمواد

  1. أداء الصرف وسائل الإعلام روتيني كل يوم أو كل يومين، والنظر في نوع من الأنسجة مثقف والنشاط الأيضي للخلايا.
    1. استرداد وزارة التجارة من الحاضنة والالتزام به تحت المجهر للسيطرة على وسائل الإعلام معدلات التدفق والتحقق من التلوث.
    2. فصل وزارة التجارة من وحدة التحكم المضخة عن طريق إلغاء توصيل أنابيب ضغط الهواء. تعقيم وزارة التجارة باستخدام مناديل الايثانول ووضعها تحت مقاعد البدلاء تدفق الصفحي.
    3. فتح شركات زراعة الأنسجةartment تحتوي على الأجسام الشبه الكروية الكبد، كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.
    4. إزالة ما يصل إلى 200 ميكرولتر من مقصورة باستخدام ماصة دون تعطيل الكروية وتخزين المتوسطة في بئر فارغة من لوحة عميقة أيضا. تحليل عينة سائل الإعلام بشكل مباشر أو إغلاق صحن عميق جيدا وتخزين العينات وسائل الإعلام في -80 ° C لمزيد من التحليل.
    5. استبدال المتوسطة من وزارة التجارة مع ما يصل إلى 250 ميكرولتر الطازجة المتوسطة ثقافة الخلية وأغلق الغطاء. الفرق في كمية إزالتها واستبدالها الحسابات عن فقدان المتوسطة بسبب تسرب كميات صغيرة من رقاقة عند إغلاق النظام.
    6. فتح الغطاء من حجرة زراعة الأنسجة عقد في حكمه الجلد في هذه المرحلة للتحقق من intactness الأنسجة. والحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في النظام. أغلق الغطاء.
    7. قم بتوصيل أنابيب من وحدة التحكم مضخة لوزارة التجارة، وفقا إلى الخطوة 5.3، ووضع وزارة التجارة في حاضنة.

7. تحليل عينات يومية وسائل الإعلام ونفذ على الخط تحليل

  1. تحليل أداء زراعة الأنسجة على الانترنت باستخدام التصوير الخلية الحية أو غير متصل، من خلال تحليل عينات من وسائل الإعلام اليومية. أداء هذا الأخير عن طريق معيار المقايسات الأنزيمية الروتينية (مثل اللاكتات نازعة (LDH) النشاط) أو ELISA (على سبيل المثال تركيز الزلال). يوصف تحليلا الإنترنت في ما يلي.
  2. إزالة وسائل الإعلام من وزارة التجارة endothelialized، كما هو موضح في الخطوات 6.1.1 إلى 6.1.4، واستبدالها في كل من المقصورات زراعة الأنسجة مع 200 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل fluorophore مترافق الأسيتيل البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) الحل (المخفف في خلية الإعلام الثقافة).
  3. إغلاق مباراة دولية. ربط وزارة التجارة إلى وحدة تحكم مضخة، وفقا إلى الخطوة 5.3، وضخه لمدة 30 دقيقة في 0.475 هرتز لتوزيع حل بالتساوي داخل الدائرة ميكروفلويديك.
  4. وقف ضخ واحتضان وزارة التجارة بشكل ثابت لمدة 3.5 ساعة عند 37 ° C وCO 2 5٪.
  5. ر مماثلس خطوة 7.2، وإزالة الحل LDL الأسيتيل من كل من مقصورات واستبدالها مع 400 ميكرولتر من متوسطة جديدة في واحدة من القسمين.
  6. الانتظار لمدة 3 إلى 5 دقائق للسماح للضغط الهيدروستاتيكي تدفع المتوسطة عبر الدائرة قناة ميكروفلويديك.
  7. استبدال المتوسطة التي تتدفق من خلال مع 300 ميكرولتر من متوسطة جديدة، وكذلك ملء الثانية مقصورة زراعة الأنسجة مع 300 ميكرولتر من متوسطة جديدة.
  8. إغلاق وزارة التجارة، وفقا لخطوة 3.1.2. وضعها تحت المجهر مضان ومراقبة نمو الخلايا وقدرتها على البقاء.
  9. وضع وزارة التجارة الملون مرة أخرى في حاضنة لمواصلة زراعة. إزالة وصمة عار تسرب الخلايا مع بعضها استبدال الوسائط التالية.

8. استرداد حكمه الأنسجة من وزارة التجارة وتنفيذ تحليلات نقطة النهاية

  1. استرداد حكمه الأنسجة من وزارة التجارة في نهاية التجربة لتحليلات نقطة النهاية.
    1. من أجل استرداد الكبد والجلد البريدquivalents من وزارة التجارة، وإزالة وسائل الإعلام من كل الأنسجة الثقافة مقصورة، كما هو موضح في الخطوات 6.1.1 إلى 6.1.4.
    2. إزالة إدراج خلية ثقافة 96-جيدا تحتوي على الجلد من وزارة التجارة باستخدام ملقط. تقشر الغشاء بعناية من إدراج التي تحكم قبضتها عليها على جانب واحد مع ملقط وسحب عليه. والحرص على عدم فقدان ما يعادل الجلد في هذه المرحلة.
    3. تجميد غشاء عقد ما يعادل الجلد في مجمع تضمين البرد وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
  2. إزالة حكمه الكبد بالمثل من الثقافة مقصورة الأنسجة بواسطة pipetting لهم باستخدام نصائح ماصة قطع (راجع الخطوة 1.1.8 / 9).
    1. تضمين الكروية الكبد في مجمع تضمين البرد. والحرص على عدم نقل الكثير من السوائل وإزالة أي السوائل الزائدة مع ماصة. بعد وضع الأجسام الشبه الكروية على مجمع تضمين وإزالة المتوسطة، إضافة مزيد من مجمع البرد على الجزء العلوي من الأجسام الشبه الكروية لإحاطة كاملة لهم.
    2. تجميد حكمه الكبد وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
  3. لتحليل نقطة النهاية عن طريق خفض حكمه الأنسجة في البرد مشراح إلى 8 ميكرون أقسام وتلطيخ لعلامات الأنسجة محددة، كما هو موضح في البروتوكولات السابقة 10.

النتائج

المعيار في المختبر يتم إجراء مزارع الأنسجة تحت ظروف ثابتة، مما يحد من انتشار الأكسجين والمغذيات العرض إلى الأنسجة. أنظمة الموائعية، والتي تبين تحسين خصائص العرض، وغالبا ما يعوقها متطلبات متوسطة كبيرة، وجود وسط غير من الناحية الفسيولوجية عالية لنسب الأنسجة. وهكذا، والمخفف الأيض والخلايا ليست قادرة على شرط محيطهم. وزارة التجارة التي قدمت في هذه الدراسة تربط اثنين من مقصورات زراعة الأنسجة منفصلة، ​​كل منها في حجم بئر واحد من معيار لوحة 96-جيدا، من خلال نظام قناة ميكروفلويديك. صغر حجم النظام والتكامل من المضخة على رقاقة يسمح النظام للعمل في وحدات التخزين وسائل الإعلام فقط 200-800 ميكرولتر. هذا يتوافق مع المتوسط ​​النظامية الكلي إلى نسبة الأنسجة من 8: 1 إلى 31: 1، على التوالي، لcocultures الكبد والجلد الأنسجة (وجود حجم الأنسجة الإجمالي من حوالي 26 ميكرولتر). إجمالي حجم السائل خارج الخلوي في رجل وزنها 73 كجم هي 14.6 L، ومنها حجم السائل بين الشعيرات هو 5.1 L، مما يؤدي إلى السائل خارج الخلية الفسيولوجية لنسبة الأنسجة من 1: 4. ولذلك، فإن كمية وسائل الإعلام في نظام التداول كله في وزارة التجارة لا تزال أكبر مقارنة بالوضع الفسيولوجية. وبعد، لأنها تمثل أصغر وسائل الإعلام إلى نسبة الأنسجة التي ذكرت حتى الآن لأنظمة الأعضاء المتعددة 5. كما يتم الاحتفاظ صناعة الأشكال زراعة الأنسجة القياسية والباحثين قادرين على الجمع بين نماذج الأنسجة الثابتة القائمة والتحقق من صحتها بالفعل ضمن تدفق السوائل المشترك. الشكل 1 يبين التخطيطي للالتجريبية مجموعة المتابعة من نسيج واحد وزارة التجارة أو متعدد الأنسجة cocultures ممكن. -generated الخزعات النسيجية الأولية في المختبر يمكن زراعة الأنسجة في حكمه من خطوط الخلايا أو الخلايا الأولية إما باستخدام 96-جيدا إدراج ثقافة الخلية أو عن طريق وضعها مباشرة في مقصورات زراعة الأنسجة. ونظرا لأن نظام ربط قناة المقصورات ثقافة الخلية هو فقط 100 μمترا، سيتم الاحتفاظ حكمه الأنسجة تتجاوز هذه الأبعاد داخل مقصورات الثقافة. وتبطنن للدائرة وزارة التجارة مع HDMECs الابتدائي تمكن خطوة أخرى إلى الأمام نحو مزيد من الشروط الثقافة الفسيولوجية من خلال توفير بنية الأوعية الدموية البيولوجي.

figure-results-2124
يتم إعداد التمثيل التخطيطي للثقافات وزارة التجارة المعادل الأنسجة تحت القياسية في المختبر الشروط، تلقيح في وزارة التجارة وزراعتها، لأن الحضارات واحدة أو cocultures في ظل ظروف دينامية: الشكل 1. يتم تنفيذ عينات سائل الإعلام اليومية والتحليلات نقطة النهاية. يتم تطبيق ضغط الهواء لدفع المضخة عن طريق الأنابيب الزرقاء ثلاثة متصلة وزارة التجارة من فوق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد بروتوكول تبطنن، يتم الحصول على متكدسة تغطية HDMEC من الدائرة قناة ميكروفلويديك في غضون أربعة أيام من ثقافة ديناميكية، كما هو مبين في الشكل 2. الخلايا تتقيد بسهولة على الجدران للقناة وزارة التجارة، وخلق أحادي الطبقة متموجة، واستطال على طول القص الإجهاد (الشكل 2B). وعلاوة على ذلك، وخلايا تغطي محيط كامل من القنوات، وكما ذكرت سابقا 9. ولم يلاحظ أي تغيير آخر في التشكل البطانية بعد أربعة أيام من زراعة حتى نهاية الثقافة.

figure-results-3397
الشكل 2: Endothelialized قنوات وزارة التجارة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الجلدية البشرية (HDMEC) شكلت أحادي الطبقة متموجة في الدائرة ميكروفلويديك. كانت ملطخة الخلايا مع LDL الأسيتيل بعد 23 يوما من الثقافة وزارة التجارة. (A) وم كلهوتمت تغطية الدوائر icrovascular مع الخلايا و (ب) الخلايا ممدود على طول إجهاد القص. الحانات النطاق: (A) 1،000 ميكرون و (ب) 100 ميكرون.

في تجربة أخرى، تتشكل متسقة الكبد الكروية خلية على شكل قرص من HepaRG وHHSteC خلال يومين من شنقا ثقافة الإفلات، كما ورد هذا النظام نموذجا سابقا عن كونه مناسبة لعملية التمثيل الغذائي المخدرات يدرس 11-13. لأغراض العرض التوضيحي، وكان المصنف واحدة مقصورة زراعة الأنسجة من كل دائرة وزارة التجارة مع 20 الأجسام الشبه الكروية في 96-جيدا إدراج زراعة الخلايا والأنسجة وتزرع أكثر من 14 يوما في الظروف الديناميكية باستخدام MOCS غير endothelialized. يمكن أن تكون متكاملة أي عدد من المجاميع أو كمية المواد الأولية إما مباشرة في المقصورات أو باستخدام إدراج ثقافة الخلية. تلوين مناعي من الأجسام الشبه الكروية بعد استرجاعها من وزارة التجارة ويظهر والتعبير متجانس قوي للىcytokeratin النسخة نموذجي 18/08 والمرحلة الأولى يتفاعل أنزيمات السيتوكروم P450 3A4 و7A1 (الشكل 3A و 3B). تلطيخ للنقل قنيوي أدوية المتعددة المقاومة البروتين 2 كشف (MRP-2) النمط الظاهري الاستقطاب وجود شبكات تشبه نفيق الصفراء بدائية (الشكل 3C).

figure-results-5062
الشكل (3) :. كانت ملطخة زراعة الكبد الاصطناعي الأنسجة الدقيقة الإنسان في المجاميع وزارة التجارة. الكبد المزروعة لمدة 14 يوما في وزارة التجارة ل(A) cytokeratin 18/08 (الأحمر) و (B) السيتوكروم P450 3A4 (أحمر) و7A1 (الخضراء). (C) التعبير عن قنيوي نقل MRP-2 (الأخضر)، وتلطيخ النووي الأزرق. الحانات النطاق: 100 ميكرون.

وحيث أن إنتاج الألبومين هو واحد شرط أساسي للثقافات أنسجة الكبد، فقد النحلن اختيار لمراقبة نشاط الكبد نموذجي في وزارة التجارة. تحليل عينات سائل الإعلام اليومية لإنتاج الألبومين يدل على زيادة كبيرة في معدل الإنتاج في الثقافات وزارة التجارة مقارنة الثقافات ثابتة (الشكل 4)، وإلى القيم التي أعلن عنها في الأدب (11). يمكن أن تعزى الزيادة في معدل تخليق الألبومين إلى زيادة الأكسجين والمغذيات العرض في الثقافات وزارة التجارة. وبالتالي، فإن وزارة التجارة غير قادرة على الحفاظ على المجاميع الكبد خلال فترة ثقافة 14 يوما في حالة نشطة عملية الأيض، وتعزيز السلوك الكبد نموذجي، مثل إنتاج الألبومين.

figure-results-6341
الشكل 4: أربعة عشر يوما أداء كروي الكبد في وزارة التجارة إنتاج الزلال من الكبد مزارع الأنسجة واحدة في وزارة التجارة والثقافة ثابتة. البيانات هي وسائل ± SEM (ن = 4).

Subsystemic المتكررة اختبار السمية جرعة من تشيmicals ومستحضرات التجميل في الحيوانات يتطلب 21 إلى 28 يوما من التعرض، على النحو المحدد من قبل التوجيهي OECD لا. 410 "وكرر الجرعة الجلدية سمية: دراسة 21/28 يوما". ومن الأمثلة على المدى الطويل cocultures الجلد الكبد هنا لمدة تصل إلى 28 يوما للتعامل مع المتطلبات التنظيمية. يتم توفير واجهة الهواء السائل لاحق التعرض مادة الجلد من خلال زراعة خزعات الجلد في 96-جيدا إدراج ثقافة الخلية. يتم تنفيذ التجربة coculture exemplarily في MOCS endothelialized لإثبات ما إذا كان coculture ثلاثة الأنسجة في دائرة الإعلام مجتمعة يمكن أن تظل قابلة للحياة ونشطة عملية الأيض أكثر من 28 يوما.

تحليل النشاط LDH في supernatants وسائل الإعلام كشفت عن وجود مستوى تناقص مطرد خلال الثمانية أيام الأولى من الثقافة، والتي بقيت ثابتة عند نحو 80 U / لتر بعد ذلك (الشكل 5). وهذا يدل على دوران الأنسجة الاصطناعية ولكن مستقر في النظام في نقاط زمنية لاحقة. مقارنة coculture ثلاثة الأنسجة لاحد الكبدتجارب coculture -tissue والكبد البطانية، بشكل كبير انخفاض مستوى LDH ويمكن الاطلاع، وخصوصا خلال الأيام الأولى في الثقافات ليس بما في ذلك الجلد. موت الخلايا خلال هذه الفترة الأولى من النشاط LDH عالية حدث في المقام الأول في مقصورة الثقافة الجلد، والجلد الأنسجة واحدة الثقافات وزارة التجارة وكشفت (لا تظهر البيانات). قد يكون هذا يرجع إلى المنطقة المحيطة الجرحى خزعة نتيجة لاللكم من الجلد.

figure-results-8168
الشكل 5: أداء الأنسجة خمسة عشر يوما في وزارة التجارة النشاط LDH في supernatants وسائل الإعلام من الثقافات أنسجة الكبد واحدة (MOC لي)، والثقافات الكبد في MOCS endothelialized (وزارة التجارة ليثيوم فرجينيا) وcocultures الكبد والجلد في endothelialized وزارة التجارة (MOC لي. -Va-SK). البيانات هي وسائل ± SEM (ن = 4).

خلال الفترة الثقافة 28 يوما، الأجسام الشبه الكروية الكبد التقيد في الجزء السفلي من وزارة التجارة لنمت الخلايا ND خارج، وتشكيل اتصال متعدد الطبقات بين الأجسام الشبه الكروية المجاورة. إلا أن ذلك لم يعرقل وظائف الأنسجة. وأظهر تحليل نقطة النهاية التي كتبها المناعي أن الأجسام الشبه الكروية الكبد لا تزال نشطة عملية الأيض بعد 28 يوما من coculture وزارة التجارة، كما يتضح من السيتوكروم P450 3A4 تلطيخ (الشكل 6A). تم توزيع HHSteC طوال ما يعادل الكبد كله، كما يتضح من تلطيخ فيمنتين (الشكل 6B). ويمكن ملاحظة زيادة في كثافة تلطيخ فيمنتين في المناطق التي الخلايا قد نمت من الأجسام الشبه الكروية. تلطيخ لعامل فون ويلبراند (VWF) أظهرت أن الخلايا البطانية لم توغلت عميقا في الأنسجة، ولكن كان في اتصال مباشر خلية خلية مع خلايا الكبد الخارجية (الشكل 6C).

أظهر المناعية تلطيخ من خزعات الجلد تعبير عن tenascin C والكولاجين IV في الغشاء القاعدي (الشكل 6D)، في حين تلطيخ للسيطرة ثابتة وأظهرت elevatمستويات إد من tenascin C (الشكل 6E). وقد تبين Tenascin C إلى أن upregulated أثناء التئام الجروح والعمليات الالتهابية والتليف، مما يوحي بفعل عمليات تليفي في ثابت، ولكن ليس في الثقافات ديناميكية 14،15.

بقاء الخلية مستقرة وظائف الأنسجة بعد coculture 28 يوما في وزارة التجارة تثبت أن النظام قادر على الحفاظ على مزيج من ما يصل الى ثلاثة الأنسجة في الدائرة الإعلامية المشتركة. الخلايا الأولية، وكذلك نماذج الأنسجة والخزعات، يمكن زراعتها في وقت واحد في نظام وزارة التجارة.

figure-results-10341
الشكل (6): تم عرض أداء الثقافات المتعددة الأنسجة أكثر من 28 يوما زرعت في حكمه الكبد وخزعات الجلد في وظائف وزارة التجارة والخلايا المناعية التي كتبها endothelialized من (A) المرحلة الأولى الانزيمات السيتوكروم P4503A4 (الحمراء)، (B) فيمنتين (الحمراء)، (C) cytokeratin 18/08 (أحمر) وVWF (الأخضر) في أنسجة الكبد. كانت ملطخة خزعات الجلد cocultivated لمدة 28 يوما (D) في وزارة التجارة أو (E) في ظل ظروف ثابتة لtenascin ج (أحمر) والكولاجين IV (الأخضر)، وتلطيخ النووي الأزرق. (F) H & E تلطيخ من الجلد بعد 28 يوما من الثقافة وزارة التجارة. الحانات النطاق: 100 ميكرون.

Discussion

منصة وزارة التجارة وصفها هنا تمثل أداة مستقرة وقوية لزراعة الأنسجة من أصول مختلفة في ظروف تدفق المتوسطة ديناميكية على مدى فترات الثقافة لفترات طويلة 10،16. في هذا المثال، تم استخدام منصة لزراعة الخلايا الأولية (HDMEC)، المعادل الأنسجة الناتجة عن خط الخلية (المجاميع الكبد)، وcoculture ما سبق مع خزعة الأنسجة. كانت قادرة على الحفاظ على coculture ثلاثة الأنسجة لمدة تصل إلى 28 يوما في دائرة المتوسطة مجتمعة وزارة التجارة. لأفضل لمعرفة المؤلفين، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تنفيذ عملية coculture متعددة الأنسجة، بما في ذلك الخزعات، الخلايا الأولية وخطوط الخلايا أكثر من أربعة أسابيع.

واحدة من العوائق الرئيسية لنظم ميكروفلويديك هو تقارب من جزيئات صغيرة على التمسك المواد السطحية من الدائرة الموائعية. كما السطح إلى نسبة حجم مرتفع خاصة في النظم ميكروفلويديك، يصبح هذا التأثير أكثر وضوحا 17 . التغطية HDMEC مستقرة من القنوات، قدم هنا، قد يكون بمثابة حاجز البيولوجي منع التصاق جزيئات إلى وزارة التجارة. وعلاوة على ذلك، فإنه قد يكون بمثابة سفينة hemocompatible للدورة الدموية كله، ومنع تجلط الدم. ومع ذلك، فإن استخدام الدم الكامل كبديل المتوسط ​​ليس ممكنا كما لم يتم التوصل إلى الأوعية الدموية الكامل للمكافئات الجهاز بعد. العمل على الأوعية الدموية للأنسجة -generated في المختبر القائم واعدة ويوجه الطريق لمزيد من الدراسات 18،19.

ومن المعروف أن خلايا الكبد تميل الى فقدان وظائف الكبد محددة على مر الزمن تحت ساكنة ثنائية الأبعاد في المختبر ظروف التربية 20. تأييض الإنزيمات، مثل P450 السيتوكروم، هي من أهمية خاصة إذا كان التمثيل الغذائي للدواء معين ليتم دراستها. السيتوكروم P450 3A4، انزيم المتعلقة أحيائي من xenobiotics كثيرة، والسيتوكروم P450 7A، ثويشارك hich في تركيب الحامض المراري، وأعرب عن في الكبد مجاميع المثقف في وزارة التجارة أكثر من 14 يوما. وهذا يدل على الحفاظ على النمط الظاهري نشط عملية الأيض، مما يسمح للدراسات التمثيل الغذائي المخدرات. زيادة الزلال معدل إنتاج الركام في وزارة التجارة مقارنة الثقافات ثابتة هو مؤشر إضافي لشروط الثقافة الكافية. وكانت معدلات إنتاج الألبومين التي لوحظت خلال هذه الدراسة للمقارنة أو حتى أعلى من القيم ذكرت سابقا التي حصلت عليها رقائق ميكروفلويديك بما في ذلك الخلايا HepG2 21-23، ومع ذلك، القيم لم تصل تلك الثقافات الأولية الكبدية الإنسان 24. وعلاوة على ذلك، فإن نظام وزارة التجارة، في تخطيطه مؤقت، لا يسمح لفصل منفصل الصفراء. خلايا في الصفراء الهياكل الشبيهة نفيق الاستقطاب وشكلت الإجمالية، كما يتضح من MRP-2 تلطيخ. ومع ذلك، لم تكن مرتبطة تلك نفيق إلى قناة الفنية جمع الصفراء. هذا المزيج غير الفسيولوجيةجي من الصفراوية مع مقصورة الدم لابد من معالجتها في إعادة تصميم المستقبلي للنظام.

تعديل خصائص التدفقات غير ذات أهمية عالية 25، وخاصة فيما يتعلق الأنسجة الحساسة للإجهاد القص، مثل الكبد. كمية من إجهاد القص ينظر إليها من قبل الأنسجة يمكن تعديل بطريقتين: أولا، ضغط الهواء تستخدم لدفع أسفل الأغشية المضخة يمكن تخفيضها، وخفض قيم إجهاد القص الذروة في النظام. ثانيا، الأنسجة يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ في مصفوفة طبقات الخلية أو مثقف في إدراج الثقافة transwell. هذا الأخير حماية الأنسجة من الكامنة الحالية مع غشاء مسامي. وتحتاج هذه التعديلات التي يتعين القيام بها على أساس فردي لكل ما يعادل الجهاز قبل بدء التجربة وزارة التجارة. في عملية نابض من 2.4 هرتز، على سبيل المثال، والتي تتطابق مع، نشاط القلب عالية، ولكن لا يزال الفسيولوجية من 144 نبضة / دقيقة في البشر، وإجهاد القص قياس فيقنوات الدائرة الاوعية الدموية الدقيقة تصل حوالي 25 داين / سم 2. هذا يتوافق مع إجهاد القص الفسيولوجية في نهاية أعلى من النطاق في الأوعية الدموية الدقيقة وغير، وبالتالي، تنطبق جيدا للتجارب بما في ذلك تبطنن من القنوات. لكن، وكما تخطيط ميكروفلويديك الحالي للنظام وزارة التجارة قدمت يتكون من واحد فقط الدائرة الإعلامية ربط اثنين من المقصورات الجهاز، والتي سيتم اختيارها واحدة سرعة الضخ والقص معدل الإجهاد للنظام بأكمله. ولذلك، تعديلا الدقيق لخصائص التدفقات لاحتياجات كل جهاز واحد ليس ممكنا دائما.

وعلاوة على ذلك، لابد من توخي الحذر في ضبط الخلايا إلى متوسطة المشترك. تزرع الخلايا في وزارة التجارة في دائرة الإعلام مجتمعة، وبالتالي، لا الفردية وسائل الإعلام ثقافة الخلية يمكن أن تستخدم في كل نموذج الأنسجة، كما هو المعيار لفي المختبر ثقافة الخلية. وتحتاج الحد الأدنى من صياغة وسائل الإعلام مجتمعة إلى تعريف مسبقا ورتحتاج انه الخلايا ليتم تعديل تدريجي لهذا الإعلام الجديد. إجراء تعديل 80٪ / 20٪ القديم إلى وسائل الإعلام الجديدة لمدة يومين، ثم 50٪ / 50٪ تليها 20٪ / 80٪، والتبادل الكامل أدت دائما إلى بقاء الخلية معقولة وظائف الثقافات في أيدينا.

تخطيط ميكروفلويديك الحالي للنظام وزارة التجارة يسمح للcoculture تصل إلى ثلاثة الأنسجة. وهناك حاجة إلى coculture ما لا يقل عن عشرة أهم أجهزة الجسم البشري للوصول إلى التوازن. ولذلك، فإن نظام عرض قادر على التنبؤ التفاعلات الأنسجة الأنسجة محددة، ولكن ليس استجابة النظامية الحقيقية لمادة. ومن المزمع إجراء مزيد من التطوير وزارة التجارة لتشمل المزيد من تجاويف الجهاز. وعلاوة على ذلك، من صحة هذا النظام هو ليتم عرضها باستخدام مجموعة من المركبات المرجعية. ويفضل، والمركبات التي فشلت خلال التجارب السريرية (مثل Troglitazone) هي لفحصها لأدائها في وزارة التجارة. في حين، والتحقق من صحة الحقيقي لمثل هذه النظم المعقدة لا تزال تعرقل بذ وعدم وجود توحيد المتعلقة المؤشرات الحيوية والنهاية للتقييم وظيفي، وجمع المزيد من البيانات حول أداء السمية لهذا وما شابهه من النظم توسيع موثوقيتها ومجال التطبيق.

Disclosures

أوفي ماركس هو الرئيس التنفيذي لشركة TissUse محدودة التي تنتج وتسوق منصة متعدد الجهاز رقاقة تستخدم في هذه المادة. وقد تم تمويل هذه النشرة من قبل على جائزة تمنحها شركة كورنينج

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث العلمي، GO-بيو منحة رقم 0315569.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HepaRG cellsBiopredic Internationalundifferentiated cells
HHSteCScienCell Research Laboratoriescells and all culture supplements
HepaRG MediumSigma-AldrichWilliam's Medium E
10% FCS
100 U/ml penicillin
100 µg/ml streptomycin
5 µg/ml human insulin
2 mM L-glutamine
5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate
HDMEC MediumPromoCellEndothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin
Dimethyl sulfoxideCarl Rothadd 2% to HepaRG media
Trypsin/EDTABiowest
TrypsininhibitorCarl Roth
MAXYMum Recovery TipsCorning1,000 µl Pipet Tips Wide Bore
384-Well Hanging Drop Plate3D BiomatrixPerfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate
Tissue culture flasksCorning75 cm2
Ultra-low attachment plateCorning24-well
Transwell cell culture insertsCorning96-well unit, 0.4 µm pore size
Deep well platesCorning96-well, 1 ml
Biopsy punchStusche4.5 mm
Glass microscope slideMenzelfootprint of 75 x 25 mm
PolydimethylsiloxaneDow CorningSylgard 184
Silicon rubber additiveWacker ChemieWacker Primer G790
Tubes for air pressureSMC Pneumatik GmbHPolyurethan-Schlauch, metrisch
Alumin ELISABethyl LaboratoriesHuman Albumin ELISA Quantitation Set
Lactate dehydrogenase assayStanbio LaboratoryLDH Liqui-UV kit
Alexa Fluor 594 acetylated LDLInvitrogen1 mg/ml

References

  1. Kelm, J. M., Fussenegger, M. Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly. Trends in biotechnology. 22 (4), 195-202 (2004).
  2. Marx, U., Walles, H., et al. Human-on-a-chip Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man. ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  3. Baudoin, R., Griscom, L., Prot, J. M., Legallais, C., Leclerc, E. Behavior of HepG2/C3A cell cultures in a microfluidic bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 53 (2), 172-181 (2011).
  4. Dash, A., Inman, W., et al. Liver tissue engineering in the evaluation of drug safety. Expert opinion on drug metabolism & toxicology. 5 (10), 1159-1174 (2009).
  5. Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing--organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab on a chip. 13 (18), 3481-3495 (2013).
  6. Huh, D., Torisawa, Y., Hamilton, G. a., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  7. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors. Biotechnology progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  8. Tatosian, D. a., Shuler, M. L. A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers. Biotechnology and bioengineering. 103 (1), 187-198 (2009).
  9. Schimek, K., Busek, M., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a chip. 13 (18), 3588-3598 (2013).
  10. Wagner, I., Materne, E. -. M., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  11. Vieira, U., et al. HepaRG human hepatic cell line utility as a surrogate for primary human hepatocytes in drug metabolism assessment in vitro. Journal of pharmacological and toxicological methods. 63 (1), 59-68 (2010).
  12. Abu-Absi, S. F., Hansen, L. K., Hu, W. -. S. Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells. Cytotechnology. 45 (3), 125-140 (2004).
  13. Leite, S. B., Wilk-Zasadna, I., et al. Three-dimensional HepaRG model as an attractive tool for toxicity testing. Toxicological sciences. 130 (1), 106-116 (2012).
  14. Chiquet-Ehrismann, R. Tenascins. The international journal of biochemistry & cell biology. 36 (6), 986-990 (2004).
  15. Sidgwick, G. P., Bayat, A. Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology JEADV. 26 (2), 141-152 (2012).
  16. Ataç, B., Wagner, I., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  17. Wu, M. -. H., Huang, S., Lee, G. -. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a chip. 10 (8), 939-956 (2010).
  18. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models A new approach for the refinement of biomedical research. Journal of Biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  19. Holnthoner, W., Hohenegger, K., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. J Tissue Eng Regen Med. , (2012).
  20. Dunn, J. C. Y., Yarmush, M. L., Koebe, H. G., Tompkins, R. G. Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration. FASEB Journal. 3, 174-177 (1989).
  21. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  22. Kim, M. S., Yeon, J. H., Park, J. -. K. A microfluidic platform for 3-dimensional cell culture and cell-based assays. Biomedical microdevices. 9 (1), 25-34 (2007).
  23. Prot, J. -. M., Aninat, C., et al. Improvement of HepG2/C3A Cell Functions in a Microfluidic Biochip. Biotechnology and bioengineering. 108 (7), 1704-1715 (2011).
  24. Riccalton-Banks, L., Liew, C., Bhandari, R., Fry, J., Shakesheff, K. Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells. Tissue engineering. 9 (3), 401-410 (2003).
  25. Powers, M. J., Domansky, K., et al. A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture. Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

98 microphysiological organoids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved