Multi-орган Chip - Микрожидкостных Платформа для долгосрочных Multi-ткани сокультивирования

Резюме

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Аннотация

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.

For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Введение

Текущие монослой или суспензию клеток культуры анализы для разработки лекарственных средств не в состоянии эмулировать сотовой микросреды человека и, следовательно, привести к быстрому дифференцировке и потерей функции в первичных культурах клеток человека. Модели ткани с более высокой физиологической релевантности необходимы для прогнозирования эффективности и безопасности соединений, прежде чем признать их клинических испытаний. В последнее время стандартом в пробирке методов культивирования клеток развились из двумерных культур монослоя к трехмерной многоклеточных моделей, с целью имитировать в естественных условиях ткани микросреду. Эти системы уже показали значительные улучшения по отношению к более точного прогнозирования механизма действия соединений ^1,2. Кроме того, адаптация в пробирке условия культуры в узкоспециализированных потребностей клеток представляет особый интерес.

Под стандартом в условиях лабораторных, ряд важных кульПараметры хозяйство, такие как питательной и кислорода, удаление накапливающихся продуктов, и механической силы, действующие на клетки, часто не могут быть полностью контролируется в большинстве случаев. Многие органы обладают физиологически соответствующие градиенты концентрации веществ и растворенного кислорода. Тем не менее, эти высоко регулируемые и оптимизированные условия в четкой оппозиции к неконтролируемым диффузии градиентов вокруг тканей в условиях в пробирке, что приводит к крайне нестабильной среды и ограничивает развитие сотовой ^3. Таким образом, более устойчивыми и особенно более количественно в условиях пробирке необходимо сохранить клетки жизнеспособны и дифференцированные в течение длительных периодов времени. Перфузируемые системы, в которых средние компоненты регулярно устранены и заменены, часто лучше охарактеризовать и управляемы, чем статические культур, касающихся прямого Окружающая тканей. В статических условиях, диффузия градиенты клеточных выделений и питательную среду веществможет окружить культивируемые клетки ^3. Представляем хорошими характеристиками ставки среднего течения вокруг тканей позволяют клетке выделениями смешать с богатой среде через перфузии. Это позволяет генерацию определенных клеточных микросреды, обеспечивая стабильную клеточную фенотип и метаболизировать фермента выражение в течение продолжительности всего анализа ^4.

Последние события в чипе полиорганной (MOC) основе системы сочетают в себе преимущества контролируемой среды обтекания инженерии тканей с малых, средних и клеточной массы требованиям микромасштабных биореакторов, что приводит к снижению количества вещества, необходимого во время тестирования. Несколько микрожидкостных системы тканевой культуры были описаны до сих пор ^5,6. Ткани к жидкости коэффициенты в этих системах играют особенно важную роль в моделировании физиологический сотовой перекрестных помех. Тем не менее, из-за технических ограничений, таких, как использование внешних насосов и СМИ водоемов, йе целом циркулирующий объем массовой информации в большинстве систем является слишком большим по сравнению с объемами ткани. Группа Шулер и др. Были первыми, кто разработал систему, обеспечивающую надлежащее время пребывания веществ в культуре клеток отсеков и в естественных соответствующей ткани к жидкости коэффициентов ^7,8. Это было достигнуто путем расширения внешнего резервуара до 96-луночный планшет, а также представляющий "других тканей" отсек. Чтобы свести к минимуму объем циркулирующей информации в течение нашей MOC платформы, мы интегрированы перистальтический на чипе микронасос, устраняя необходимость во внешних средств схем. Это микронасос может работать с системой на выбор номера скоростей потока средств массовой информации и скоростей сдвига напряжения ^9. Микрожидкостных системы канал 500 мкм шириной и высотой 100 мкм соединяет две стандартные культуры ткани пространства, каждое из которых имеет размер одной лунку 96-луночного планшета. Придерживаясь размеров стандартных промышленных луночного планшетас позволяет интегрировать уже существующие модели тканей, производимых в формате Transwell. Кроме того, вертикальное положение клеточной культуры Transwell вставок можно регулировать, что позволяет выращивание моделей тканей, которые не только непосредственный контакт с потоком текучей среды, но также может быть поднят и защищены от основной ток. Кроме того, интерфейс культуры воздуха и жидкости возможны с использованием этой системы.

МОС платформа изготовлена ​​из полидиметилсилоксана (ПДМС) сло с высокой 2 мм и предметное стекло микроскопа с след 75 х 25 мм ^2, которые постоянно соединена с низкой окисления плазмы давление, чтобы сформировать схему микрожидкостных герметичное. Слой PDMS, содержащего соответствующие каналы и в клеточной культуре отсеков производится стандартным мягкой литографии и реплики формования ^9. Микрожидкостных дизайн МПЦ используется в ходе этого исследования состояла из двух отдельных микрофлюидных схем на чип, каждая из которых содержит два сотовых Culture отсеки соединены между собой системой каналов высокой 100 мкм. Это позволило работу двух отдельных совместных культурах двух тканей с применением одну фишку мульти-органов. Насосные частоты были скорректированы с получением среднего скорости потока 40 мкл / мин.

Это два-ткани конструкции МОС при условии, что возможность совместного культивирования сфероид печени и удар за кожей биопсии в отдельных пространств культуры, хотя и в сочетании медиа цепи при физиологических условиях потока. Дифференцированный HepaRG клетки были объединены вместе с человеческими звездчатых клеток печени (HHSteC) в соотношении 24: 1 с образованием однородных сфероидов. Это отношение было установлено, что оптимальным, так как наблюдалось в предыдущих экспериментах ^10, хотя, почти в два раза число гепатоцитов были использованы по сравнению с ситуацией в естественных условиях. Кожа была выращена на воздух-жидкость внутри вставки Transwell культуре клеток, что позволяет экспозицию актуальные вещество. Эти модели тканей были сокультивируются 28 гАйс в МОЦ, чтобы продемонстрировать полноту этой системы. Кроме того, схема Микрожидкостных канал чипов была полностью покрыта человек кожной микрососудистых эндотелиальных клеток (HDMEC), чтобы более точно имитировать сосудистую систему.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Human несовершеннолетних крайней плоти было получено информированное согласие и этика утверждения (этического комитета Шарите университета медицины, Берлин, Германия), в соответствии с соответствующими законами, с детской хирургии после плановой обрезания.

1. Производство тканей эквивалентов для выращивания в MOC

1. Совокупные HepaRG и HHSteC в свисающими пластины для создания сфероидов печени.
   1. Для того чтобы достичь трипсинизации HepaRG клеток, выращенных в культуре клеток колбах (75 см ^2), удалить носитель из сливной дифференцированные монослойных культурах, промывают PBS в два раза, и добавить 3 мл 0,05% трипсина / EDTA. Инкубировать в течение от 3 до 5 мин при 37 ° С и остановки реакции добавлением 6 мл ингибитора трипсина.
   2. Центрифуга HepaRG клетки в 150 мкг в течение 5 мин, удалить супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл HepaRG клеточной культуральной среды, и считать клеток. Жизнеспособность клеток должна быть> 90%.
   3. ВДля достижения трипсинизации HHSteC клеток, удалить носитель из монослойных культурах, промывают PBS в два раза, и добавить 3 мл 0,05% трипсина / EDTA. Инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С и остановки реакции добавлением 6 мл ингибитора трипсина.
   4. Центрифуга клетки HHSteC в 150 мкг в течение 5 мин, удалить супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл HepaRG клеточной культуральной среды, и считать клетки.
   5. Зерноуборочный HepaRG и HHSteC в соотношении 24: 1 в HepaRG клеточной культуральной среды. Для этого установите число клеток путем разбавления суспензии клеток в HepaRG среду для культивирования клеток и добавить 1 х 10 ⁵ клеток / мл HHSteC 4,8 х 10 ⁶ клеток / мл HepaRG клеток. Тщательно перемешать.
   6. Подготовьте висячей капли пластины, добавив 2 мл PBS в висящей капли и ствольной коробки.
   7. Внесите 20 мкл клеточной суспензии в каждую лунку висячей капли пластины. Всегда готовьте около 10% больше, висячей капли, чем нужно для получения агрегатов, так как некоторые агрегаты будут потеряны ДуриН. Г. процедуры. Аккуратно положите пластины в 37 ° C инкубатора. Подождите 48 ч для сфероидов в форме.
   8. Для того, чтобы восстановить сфероидов, не забудьте использовать наконечники с широкими наконечника окончаний или вырезать кончики 1 мл пипетки советов со стерильным ножом для того, чтобы расширить отверстие до примерно 2 до 3 мм. Используйте эти наконечники для обработки сфероидов, не нарушая их.
   9. Смыть сфероидов тщательно от висячей капли пластины, последовательно добавляя 1 мл среды в верхней части лунки висячей капли пластины с помощью пипетки. Промыть пластины, пока все сферические не отвалилось. Сфероиды несколько дискообразный со средним диаметром от 300 до 400 мкм и высотой от 200 до 300 мкм в этой точке.
   10. Сбор сфероидов в ствольной коробки и перенести их на 24-и ультра-низких пластин крепления с максимумом 20 сфероидов на лунку с использованием подготовленных наконечников. Отрегулируйте объемы средств массовой информации в каждую лунку по 0,5 мл. Используйте 20 агрегатов для Иноculate один контур MOC, чтобы получить скорость миниатюризации 1/100000 о в естественных условиях количество клеток.
   11. Инкубируйте сфероидов при температуре 37 ° С и 5% CO ₂ до дальнейшего использования в МОС. Не храните СФЕРОИДОВ больше, чем за три дня до использования, чтобы обеспечить сопоставимость. Развивайте агрегаты, по крайней мере, один день в ультра-низких пластин крепления для получения однородных сфероидов.
2. Проводить любой из двух подходов к генерации ткани кожи эквиваленты: использование пунша биопсии (1.2.1) или использование готовых в моделях пробирке ткани (1.3.1).
   1. Вырезать transwells с лампой накаливания ножом под кронштейном для подготовки клеточных культур вставки 96-а и магазин в стерильных условиях до дальнейшего использования.
   2. Стерилизовать крайней плоти образцов в 80% этаноле в течение 30 сек и разрезать кольцо открытым. Образцы должны иметь среднюю высоту 2 мм.
   3. Использование биопсии удар вырезать биопсии диаметром 4,5 мм, чтобы получить равное miniaturizaСоотношение ции и для печени и кожи. Загрузите биопсии в подготовленную 96-луночного Transwell вставляет щипцами. Позаботьтесь, чтобы позиционировать биопсии с эпидермального стороной вверх.
   4. Место культуры клеток вставки с биопсии в приемнике пластиной, не содержащих HepaRG клеточную культуральную среду и хранить при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ до дальнейшего использования в МОС. Не хранить образцы дольше, чем 2 до 3 часов.
3. Интеграция готовые в пробирке моделей кожи, закупить от различных поставщиков, в МПЦ, чтобы убедиться, что они находятся в 96-луночного Transwell формате. Используйте клеточную культуральную среду предоставленную поставщиком или, если Совместное культивирование с другой ткани предусматривается в качестве дальнейшего шага, используйте минимальное среду, поддерживающую как ткани. Проверьте соответствующий минимальной среде в предыдущих статических экспериментах за его способность поддерживать ткани.
   1. Получить модели кожу от опорной плиты и сократить 96-а вставки под крепежным уголком с лампой накаливания ножом.
   2. Поместите вставки обратно в приемник пластины и хранить при температуре 37 ° С и 5% CO ₂ до дальнейшего использования в МОС. Не храните образцы дольше, чем один день.

2. MOC Изготовление

1. Смешайте PDMS и отвердителя в соотношении 10: 1 (объем / объем) и поместить смесь в вакууме в течение 15 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха.
2. Между тем, лечить поликарбонатным покрытием пластину с силиконовой резины добавки при 80 ° С в течение 20 мин.
3. Вставьте тефлоновые винты в соответствующие отверстия в крышке пластины, чтобы создать четыре PDMS свободные культуры клеток, купе и шесть PDMS мембран, толщиной 500 мкм, из микронасосу.
4. Подключите подготовленный кавер-панель на мастер-форму из двух микрососудистых схем и ввести дегазированная PDMS. Будьте осторожны, не интегрировать пузырьков воздуха в систему. Если пузырьки появляются, попробуйте удалить их, наклоняя устройство.
5. Инкубируйте систему при 80 ° С в течение 60 мин, чтобы вылечить PDMS слой,
6. Снимите главный плесени и винты тефлоновые с устройства и скрепить PDMS слой в стекле с 75 х 25 мм ² след с помощью низких окисления в плазме давление.
7. Винт специальной резьбой MOC адаптеров для всех четырех клеточных культур отсеков кавер-пластины.
8. Подключите шприцы, содержащие питательную среду для женского Луер х ¼-28 мужских адаптеров и прикрепите к MOC адаптеров кавер-пластины.
9. Вводите среду в микрожидкостных цепи повторным нажатием вниз и потянув вверх шприцы плунжеров.
10. Проверить надлежащее заполнение каналов с среды под микроскопом.

3. эндотелиализацию MOC

1. До endothelializing МПЦ, флеш каждую цепь MOC со средой роста эндотелиальных клеток и инкубировать статически в течение трех дней при 37 ° С и 5% CO _2.
   1. Стерилизовать МОС с использованием этанола вытереть и поместить их под лавку ламинарного потока. Яп Кроме того, стерилизации две пары щипцов и две шестиугольные ключи для дальнейшего использования.
   2. Ослабить шапки культуры ткани отсеке МПЦ помощью шестигранного ключа и снимите крышки с помощью пинцета. После вставки носителя, колпачки обратно на МОС таким же образом.
2. Для того чтобы достичь трипсинизации человека кожной микрососудистых эндотелиальных клеток (HDMEC), удалить носитель из монослойных культурах, промывают PBS в два раза, и добавить 3 мл 0,05% трипсина / EDTA. Инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С и остановки реакции добавлением 6 мл ингибитора трипсина.
3. Центрифуга HDMEC при 220 х г в течение 5 мин, Удалить супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл эндотелиальной среде для роста клеток, а также рассчитывать клеток. Жизнеспособность клеток должна быть> 90%.
4. Регулировка количества клеток в клеточной суспензии до конечной концентрации 2 х 10 ⁷ клеток / мл путем разбавления его эндотелиальных клеток ростовой среды и передачи 250 мкл этом1 мл шприца. Применение этой концентрации клеток в МОС, чтобы скорость миниатюризации 1/100000 для всех органов.
5. Соедините шприц с женщиной Luer х ¼-28 штырем, изгнать воздух из этого фитинга и закрепите его на специальный поток MOC адаптера. Подключение адаптера к одному из двух отсеков каждого контура MOC.
6. Подключение пустой шприц таким же образом, во второй отсек схемы MOC.
7. Вводите клетки равномерно, нажав и потянув вверх два шприца поршни несколько раз в подряд образом. Управление настой клеток под микроскопом.
8. Инкубируйте MOC при 37 ° С и 5% CO ₂ в статических условиях в течение 3 ч, чтобы позволить клеткам прилипать к стенкам канала.
9. Удалить чип из инкубатора, поместите его под лавку ламинарного потока, и заменить шприцы и MOC адаптеры с помощью специальных клеточных культур камер нить MOC.
10. Добавить 400 мкл свежей среды к одному COMмента каждой цепи MOC и пусть он очистить через каналы гидростатическим давлением. После замены среды в обоих отсеках с 300 мкл свежей среды.
11. Закрыть отсеках с помощью крышки, как описано в разделе 3.1.2.
12. Подключите чип к блоку управления насоса. Отрегулируйте скорость откачки при частоте 0,475 Гц и развивать чип при 37 ° С и 5% CO _2.
13. Замените среду каждого MOC отсека каждый на два дня и следить за морфология клеток с помощью световой микроскопии.

4. Загрузка Чипа

1. Поместите MOC под скамье ламинарным потоком и открыть его, как описано в стадии 3.1.2.
2. Выньте материал из тканевых культур отсеков и заменить его 300 мкл свежей HepaRG клеточной культуральной среды.
3. Передача 20 предварительно отформованных сфероидов в один отсек для культуры ткани в каждой цепи MOC, используя наконечники пипеток с широким отверстием (см шаги 1.1.8 / 9). Закройте CAP с помощью щипцов и шестиугольные ключи.
4. Передача клеточной культуры вставки 96-а, содержащие эквиваленты кожи к оставшейся ткани культуры отсеке каждого контура MOC с помощью щипцов. Будьте осторожны, чтобы избежать образования пузырьков под мембраной эквивалента кожи. Для того, чтобы сделать это, вставьте transwells под углом слегка наклонена и надавите мягко. Удалить избыток среды вокруг Transwell толкают снизу с помощью пипетки.
5. Закройте крышку, используя щипцы и шестиугольные ключи.

5. Подключение микросхемы в блок управления насосами

1. Установите эксплуатационные параметры в блоках управления к значениям лучшего. Изменить давление воздуха от 0 до 8000 мбар, вакуум от 0 до -800 мбар, и частотой накачки от 0,24 до 2,4 Гц. Выберите направление перекачки по часовой стрелке или против часовой стрелки.
2. Удалить МПЦ содержащих клетчатку эквиваленты из-под скамейки ламинарного потока и подключите его к блоку управления насоса.
3. После numeratионный на трубах, вставьте трубку давления воздуха в соответствующих фитингов на МОС.
4. Выращивают МОС при 37 ° С и 5% CO ₂ в инкубаторе или, в случае изображений живых тканей, использовать MOC поддержку для нагрева чипа до 37 ° С и культивировать чип вне инкубатора. Используйте подогревом поддержку культивировать клетки в МПЦ под обычного микроскопа.

6. Выполнение Медиа куплю, отбор проб СМИ и воздействие веществ,

1. Выполнение рутинных обмен СМИ каждый день или через день, учитывая тип ткани культурной и метаболической активности клеток.
   1. Получить МПЦ из инкубатора и наблюдать его под микроскопом, чтобы контролировать скорость потока средств массовой информации и проверка на наличие загрязнений.
   2. Отключите МПЦ от блока управления насосом, отсоединив трубку давления воздуха. Стерилизовать МПЦ с использованием этанола салфетки и положить его под лавку ламинарного потока.
   3. Откройте тканевой культуры компartment содержащий сфероиды печени, как описано в стадии 3.1.2.
   4. Удалить до 200 мкл из отсека с помощью пипетки, не нарушая сфероидов и сохранить среду в пустой скважины глубокого-луночного планшета. Анализ образца медиа прямо или закрыть глубокую-луночного планшета и хранить образцы носителей при -80 ° С для последующего анализа.
   5. Замените среду МОЦ с до 250 мкл свежей среде для культивирования клеток и закройте крышку. Разница в количестве среде удален и заменен счета за потери из-за небольших количествах утечки из чипа при закрытии системы.
   6. Откройте крышку культуры ткани отсека холдинга эквиваленты кожи в этой точке, чтобы проверить ткани сохранности. Позаботьтесь, чтобы не вводить пузырьков воздуха в систему. Закройте крышку.
   7. Подключите трубку устройства управления насосом в МПЦ, в соответствии с шагом 5,3, и поместить МПЦ в инкубаторе.

7, Анализ образцов Ежедневно Media и выполнить оперативный анализ

1. Анализ тканей производительность культуры на линии с помощью живого изображения клеток или в автономном режиме, путем анализа суточных проб средств массовой информации. Выполните последний стандартными обычных ферментативных анализов (например, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) деятельности) или ELISA (например, концентрация альбумина). Онлайн анализ описан в следующем.
2. Извлеките носитель из endothelialized MOC, как описано в шагах 6.1.1 до 6.1.4, и заменить его в обоих тканевых культур отсеков с 200 мкл 10 мкг липопротеина (LDL) раствор низкой плотности / мл ацетилированного флуорофора, конъюгированный (разводили в среда культуры клеток).
3. Закройте крышки. Подключение MOC на блок управления насосом, в соответствии с этапом 5,3, и насос ее в течение 30 мин при 0,475 Гц распределить раствор равномерно в микрожидкостных цепи.
4. Остановка накачки и инкубировать MOC статически в течение 3,5 ч при 37 ° С и 5% СО _2.
5. Аналогичная тО шагу 7,2, снимите ацетилированный LDL решение от обеих камерах и заменить его 400 мкл свежей среды в одном из двух отсеков.
6. Подождите от 3 до 5 мин, чтобы гидростатическое давление приводной среды через схему микрожидкостных канала.
7. Замена среды, которая текла через 300 мкл свежей среды, а также заполнить второй отсек тканевой культуры с 300 мкл свежей среды.
8. Закройте MOC, в соответствии с шагом 3.1.2. Положите его под флуоресцентным микроскопом и наблюдать рост клеток и жизнеспособность.
9. Поместите запятнанную MOC назад в инкубаторе, чтобы продолжить совершенствование. Удалить пятно утечки из клеток с каждым следующим сменных носителей.

8. Получить Tissue эквивалентов в МПЦ и выполнить конечную точку Анализы

1. Получить тканей эквивалентов в МПЦ в конце эксперимента для проведения анализов конечной точки.
   1. Для того, чтобы восстановить печень и кожу Equivalents от MOC, извлекайте носитель из каждой культуры ткани купе, как описано в шагах 6.1.1 6.1.4.
   2. Удалить культуру 96-а клетки вставки, содержащие кожу от МПЦ с помощью щипцов. Лупиться мембрану тщательно от вставки, взявшись за его, с одной стороны пинцетом и тянет его вниз. Позаботьтесь, чтобы не потерять эквивалента кожи в этой точке.
   3. Замораживание мембрану проведения эквивалент кожи в крио-герметики и хранить его при температуре -80 ° C до дальнейшего анализа.
2. Удалить эквиваленты печени аналогично из тканевой культуры отсека с помощью пипетки их с помощью разреза наконечники (этап 1.1.8 / 9).
   1. Код для вставки сфероидов печени в крио-вложение соединения. Будьте осторожны, не передавать слишком много жидкости и удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки. После размещения сфероидов на герметики и удаления среды, добавить дополнительные крио соединение на верхней части сфероидов, чтобы полностью закрыть их.
   2. Замораживание эквиваленты печени и хранить его при температуре -80 ° C до дальнейшего анализа.
3. Выполнение конечной анализ путем разрезания эквиваленты тканей в крио-микротома 8 мкм секций и окрашивания для ткане-специфических маркеров, как описано в предыдущих протоколов ^10.

Результаты

Стандартный в пробирке тканевые культуры выполняются в статических условиях, ограничивающих диффузию кислорода и питательных веществ к тканям. Жидкостная системы, показывающие улучшенные характеристики питания, которые зачастую мешают их большими средними требованиями, имея не-физиологически высокую среды в соотношении ткани. Таким образом, метаболиты разбавляют и клетки не способны обусловить свое окружение. МОС представлены в данном исследовании соединяет две отдельные культуры ткани отсеков, каждый размер одной скважины в стандартной 96-луночный планшет, по микрожидкостных системы канала. Небольшой масштаб системы и интеграции насоса на чипе позволяет системе работать при объемах СМИ только 200 до 800 мкл. Это соответствует общей системной среды в соотношении ткани 8: 1 до 31: 1, соответственно, для печени и кожной ткани совместных культурах (имеющих общий объем ткани около 26 мкл). Общий объем внеклеточной жидкости в человека весом 73 кг 14,6 л, из которых intercapillary объем жидкости 5,1 л, что приводит к физиологической внеклеточной жидкости в соотношении ткани 1: 4. Таким образом, количество средств массовой информации во всей системе циркуляции в МОС по-прежнему больше, по сравнению с физиологической ситуации; и все же, она представляет собой наименьшую СМИ соотношения тканей сообщил сих пор для многих органов системы ^5. Как стандартные форматы для культуры ткани сохраняются, исследователи смогли объединить существующие и уже проверенные модели статического ткани в общий поток жидкости. Рисунок 1 показывает схематическое изображение экспериментальной установки возможных MOC одного тканей или нескольких тканей совместных культурах. Основные биопсии ткани и в пробирке -порожденная ткани эквиваленты из клеточных линий или первичных клеток можно выращивать либо с помощью клеточных культур вставки 96-а или путем размещения их непосредственно в ткань культуры отсеков. Как канальная система взаимосвязанных культуре клеток отсеков находится всего в 100 μм, ткань эквиваленты, превышающие эти размеры будут сохранены в культуре отсеков. Эндотелиализацию цепи MOC с первичными HDMECs позволяет еще один шаг вперед в направлении более физиологических условиях культивирования, обеспечивая биологическое сосудистых структур.

Рисунок 1:. Схематическое изображение МОС тканевых культур эквиваленты подготовлена ​​в соответствии с условиями стандарта в пробирке, вносили в МПЦ и культивировали в виде отдельных культур или совместных культурах при динамических условиях. Образцы Ежедневные СМИ и анализ конечных точек выполняются. Давление воздуха для привода насоса подается через три синих трубок, подключаемых к МПЦ сверху. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

После протокола эндотелизации, сливная HDMEC охват цепи микрожидкостных канала получают в течение четырех дней динамической культуры, как показано на рисунке 2. Клетки легко прилипают к стенкам канала MOC, создать сливающийся монослой и удлиненные вдоль сдвига напряжений (2В). Кроме того, клетки покрывают всю окружность каналов, как сообщалось ранее ^9. Никаких дополнительных изменений в морфологии эндотелиальных не наблюдалось после четырех дней культивирования до конца культуры.

Рисунок 2:. Endothelialized MOC каналы человека кожный микрососудистых эндотелиальных клеток (HDMEC) сформировали сливающийся монослой в микрожидкостных цепи. Клетки окрашивали ацетилированного LDL после 23 дней MOC культуры. (А) Весь мicrovascular схема была покрыта клетками и (б) клеток, вытянутых вдоль напряжения сдвига. Scale бары: (A) 1000 мкм и (б) 100 мкм.

В другом эксперименте, последовательные дисковые сферические клеток печени образуются из HepaRG и HHSteC в течение двух дней висячей капли культуры, как эта модель системы сообщалось ранее как пригодные для метаболизма препарата изучает ^{11 - 13.} Для демонстрационных целей, одна культура ткани отсека каждой цепи MOC был посеян с 20 сфероидов в культуре клеток вставками 96-а и ткани были выращены в течение 14 дней в динамических условиях с использованием не-endothelialized МОС. Любое количество агрегатов или количества первичного материала могут быть интегрированы непосредственно в отсеки или с использованием клеточных культур пластины. Иммунофлуоресцентного окрашивание сфероидов после извлечения из МПЦ показывает сильную, однородную выражение для Liвер-типичный цитокератин 8/18 и фаза I метаболизме ферментов цитохрома P450 3A4 и 7A1 (рис 3A и 3B). Окрашивание канальцевая транспортера с множественной лекарственной резистентности белка 2 (MRP-2) показал, поляризованный фенотип и существование рудиментарных желчных канальцев, как сетей (3С).

Рисунок 3 :. Выращивание человека искусственный печени микро-тканей в MOC. Печень агрегатов, выращиваемых на 14 дней в МПЦ окрашивали в течение (А) цитокератина 8/18 (красный) и (B) цитохрома P450 3A4 (красный) и 7A1 (зеленый). (C) Выражение канальцев транспортера MRP-2 (зеленый), синий Окрашивание. Шкала бары: 100 мкм.

Как производство альбумина является одним из важнейших предпосылок ткани печени культур, он имеет пчелун, выбранные для мониторинга печени, типичной активности в МПЦ. Анализируя суточных проб носителя для альбумина производства показывает значительное увеличение темпов производства в МПЦ культур по сравнению со статическими культур (рис 4) и значений, описанными в литературе ^11. Увеличение альбумина скорости синтеза может быть связано с увеличением подачи кислорода и питательных веществ в МПЦ культур. Таким образом, MOC способен выдержать агрегаты печени в течение периода культивирования 14 дней в метаболически активном состоянии, повышение печени, типичное поведение, например, производства альбумина.

Рисунок 4: Четырнадцать дней производительность сфероид печени в МПЦ Альбумин производство печени культур отдельных тканей в МПЦ и в статическом культуры.. Данные средства ± SEM (n = 4).

Подсистемные повторное тестирование токсичность Чеmicals и косметика на животных требуется от 21 до 28 дней после контакта, как это определено директивой ОЭСР нет. 410 "повторением дозы кожная токсичность: 21/28 дней исследование." Долгосрочные совместных культурах кожи печени примером здесь до 28 дней, чтобы справиться с нормативными требованиями. Воздух-жидкость интерфейс предназначен для воздействия позже кожная вещества, культивируя биопсии кожи в культуре клеток вставками 96-а. Эксперимент Совместное культивирование осуществляется образцово в endothelialized МОС доказать ли три-ткани Совместное культивирование в сочетании СМИ схемы может быть жизнеспособным и метаболически активными в течение 28 дней.

Анализ активности ЛДГ в СМИ супернатантами показал неуклонно снижается уровень в течение первых восьми дней культуры, которые остались на постоянном уровне примерно 80 Ед / л после этого (рисунок 5). Это указывает на то искусственный, но стабильный оборот ткани в системе в более поздних временных точках. Сравнивая три тканей совместного культивирования с тем чтобы выделить печени-tissue и печени и эндотелиальных эксперименты совместного культивирования, значительно сниженный уровень ЛДГ может быть найден, особенно в течение первых дней в культурах не включая кожу. Гибель клеток в течение этого первого периода высокой активности ЛДГ произошло в основном в культуральной кожи отсека, как кожные ткани одного MOC культуры показали (данные не показаны). Это может быть из-за раненой области, окружающей биопсии в результате пробивки кожи.

Рисунок 5: Пятнадцать дней производительность ткани в активности ЛДГ MOC в средствах массовой супернатантах печени одного тканевых культур (MOC Li), культур печени в endothelialized МОС (МОС Li-ва) и совместных культурах печени кожи в endothelialized MOC (MOC Ли. -Va-Sk). Данные средства ± SEM (n = 4).

В 28-дневного периода культивирования, сфероиды печени прикреплен к нижней части MOC ай клетки росли, образуя многослойную связь между соседними сфероидов. Это не помешало функциональность ткани. Конечная Анализ методом иммунофлуоресценции, показали, что сфероиды печени были еще метаболически активными после 28 дней совместного культивирования MOC, как показано на цитохром Р450 3А4 окрашивания (фиг.6А). HHSteC были распределены по всей печени, эквивалентной, как показано виментина окрашивания (фиг.6В). Увеличение интенсивности окрашивания виментина можно было наблюдать в районах, где клетки выросли из сфероидов. Окрашивание для фактора фон Виллебранда (ФВ), показали, что эндотелиальные клетки не проникла глубоко в ткани, но были в непосредственном контакте клетка-клетка с наружными гепатоцитов (рис 6в).

Иммуногистохимия окрашивание биопсии кожи показали, выражение тенасцина С и коллагена IV в базальной мембране (рис 6D), в то время как окрашивание статического контроля показал, elevatУровни ЭД тенасцина С (рис 6E). Тенасцин C было показано, быть позитивно регулируется во время заживления ран, воспалительных процессов и фиброза, предполагая, вызванной фиброзных процессов в статических, но не в динамических культур ^14,15.

Стабильный жизнеспособности и функции тканей после 28-дневного совместного культивирования в МОЦ клеток доказать, что система способна поддерживать сочетание до трех тканей в общей схеме массовой информации. Первичные клетки, а также модели, ткани и биопсии, могут быть выращены одновременно в MOC системы.

Рис. 6: Выполнение нескольких тканевых культур более 28 дней эквивалентов печени и биопсии кожи культивировали в endothelialized функциональности MOC и клеток было показано иммунным окрашиванием (A) Фазы I ферментами цитохрома P4503A4 (красный), (B) виментин (красный), (C) цитокератин 8/18 (красный) и фактора Виллебранда (зеленый) в ткани печени. Кожные биопсии сокультивируются в течение 28 дней (D) в МПЦ или (E) в статических условиях окрашивали в течение тенасцина с (красный) и коллагена IV (зеленый), голубой ядерного окрашивания. (F), Н & Е окрашивание кожи после 28 дней MOC культуры. Шкала бары: 100 мкм.

Обсуждение

MOC платформа описано здесь представляет собой стабильный и мощный инструмент для культивирования тканей различного происхождения при динамических условиях потока среды на протяжении длительного культивирования периоды ^10,16. В этом примере, платформа была использована для выращивания первичных клеток (HDMEC), тканевые эквиваленты, полученные из клеточной линии (агрегаты печени), а также совместного культивирования из вышеупомянутых с биопсии ткани. MOC был в состоянии поддерживать три тканей совместного культивирования до 28 дней в комбинированном среднего цепи. Для лучших знаний авторов, это первый раз, мульти-ткани Совместное культивирование, включая биопсию, первичных клеток и клеточных линий была выполнена в течение четырех недель.

Одним из основных недостатков микрожидкостных систем сродство малых молекул прилипает к поверхности материала жидкостного контура. Как отношение поверхности к объему особенно высоко в микрофлюидных систем, этот эффект становится еще более выраженным ¹⁷ . Стабильный HDMEC покрытия из каналов, представленные здесь, могут действовать в качестве биологического барьера, препятствующего адгезии молекул в МОС. Кроме того, он может служить в качестве гемосовместимого судна для всей кровообращения, предотвращения свертывания крови. Тем не менее, использование цельной крови в качестве среднего замещения не представляется возможным, как полная васкуляризация эквивалентов органов еще не было достигнуто. Проделанная работа по васкуляризации в пробирке -порождённых тканей является перспективным и направляет путь для дальнейших исследований ^18,19.

Это хорошо известно, что гепатоциты теряют свои печенью конкретных функций с течением времени в статических двумерных в пробирке условия культивирования ^20. Метаболизировать ферменты, такие как Р450 семейства цитохрома, имеют особое значение, если метаболизм определенного препарата должен быть изучен. Цитохром Р450 3А4, фермент, связанные с биотрансформации ксенобиотиков многих, и цитохром Р450 7A, шHICH участвует в синтезе желчных кислот, были выражены в печени агрегатов культивировали в МОЦ в течение 14 дней. Это указывает на сохранение метаболически активной фенотипа, что позволяет метаболизма лекарственных исследований. Увеличение скорости производства альбумина агрегатов в МПЦ по сравнению со статическими культур дополнительное указание адекватных условий культивирования. Темпы производства альбумина наблюдается в ходе этого исследования были сопоставимы или даже выше, чем сообщалось ранее значений, полученных микрофлюидных чипов в том числе клеток HepG2 ^{21 - 23,} однако, значения не достигают тех первичных культур гепатоцитов человека ^24. Кроме того, МОС система, в свою временную компоновки, не позволяет отдельным сегрегации желчи. Клетки в совокупности поляризованных и образованных желчных канальцев-подобных структур, как показывает MRP-2 окрашивания. Тем не менее, эти канальцы не связан с технической канала сбора желчи. Это не-физиологических смесьфлу- желчи отсека крови должен быть рассмотрен в будущем реконструкцию системы.

Регулировка характеристик потока имеет большое значение ^25, особенно в отношении тканей, чувствительных к напряжению сдвига, например, в печени. Количество напряжения сдвига воспринимается ткани может быть изменен двумя способами: во-первых, давление воздуха используется для передачи вниз мембраны насоса может быть снижена, уменьшая пиковые значения напряжения сдвига в системе. Во-вторых, ткани могут быть встроены в внеклеточного матрикса слоев или культивировали в Transwell культуры вставками. Последнее защитить ткани от основной ток с пористой мембраной. Эти корректировки должны быть выполнены в индивидуальном порядке для каждого органа эквивалента до начала MOC эксперимент. В операции пульсирующей 2,4 Гц, например, что соответствует высокой, но все еще физиологического, сердечной деятельности 144 ударов / мин в организме человека, напряжение сдвига, измеренной вканалы цепи микрососудов достигает примерно 25 дин / см ^2. Это соответствует физиологического напряжения сдвига в более высоком конце шкалы в микрососудов и, следовательно, также применимы для экспериментов в том числе эндотелизации каналов. Однако, как ток Микрожидкостных расположение MOC системы, представленной состоит только из одного СМИ цепи, соединяющей два отделения органов, один курс стресс скорость откачки и сдвига должен быть выбран для всей системы. Таким образом, точная настройка характеристик потока к потребностям каждого отдельного органа не всегда возможно.

Кроме того, внимание должно быть принято при корректировке клеток в общей среде. Клетки культивировали в MOC в комбинированной схемы медиа, таким образом, ни один человек среда культуры клеток не могут быть использованы для каждой модели ткани, как это стандарт для экстракорпорального клеточной культуре. Минимальный комбинированный препарат СМИ должны быть определены заранее и тон клетки должны быть отрегулированы ступенчато к этой новой массовой информации. Процедура настройки 80% / 20% старой к новым СМИ в течение двух дней, затем 50% / 50% с последующим 20% / 80%, а полный обмен всегда приводит к разумному жизнеспособности клеток и функциональности культур в наших руках.

Ток Микрожидкостных расположение MOC системы позволяет совместного культивирования до трех тканей. Совместное культивирование, по меньшей мере, десять самых важных органов человеческого тела, необходимое для достижения гомеостаза. Таким образом, система представлена ​​может предсказать конкретные ткани ткани взаимодействий, но не истинный системный ответ на вещества. Дальнейшее развитие МОЦ, чтобы включить больше органов полости предусмотрено. Кроме того, действия системы должно быть показано с помощью набора контрольных соединений. Предпочтительно, соединения, которые не смогли в ходе клинических испытаний (например, Троглитазон) должны быть проверены на их выступления в МПЦ. Принимая во внимание, правда, проверка таких сложных систем, по-прежнему препятствуют бу отсутствие стандартизации в отношении биомаркеров и конечных точек для функциональной оценки, собирая все больше данных о токсикологической выполнения этой и подобных систем позволит расширить их надежности и область применения.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HepaRG cells	Biopredic International		undifferentiated cells
HHSteC	ScienCell Research Laboratories		cells and all culture supplements
HepaRG Medium	Sigma-Aldrich		William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate
HDMEC Medium	PromoCell		Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth		add 2% to HepaRG media
Trypsin/EDTA	Biowest
Trypsininhibitor	Carl Roth
MAXYMum Recovery Tips	Corning		1,000 µl Pipet Tips Wide Bore
384-Well Hanging Drop Plate	3D Biomatrix		Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate
Tissue culture flasks	Corning		75 cm2
Ultra-low attachment plate	Corning		24-well
Transwell cell culture inserts	Corning		96-well unit, 0.4 µm pore size
Deep well plates	Corning		96-well, 1 ml
Biopsy punch	Stusche		4.5 mm
Glass microscope slide	Menzel		footprint of 75 x 25 mm
Polydimethylsiloxane	Dow Corning		Sylgard 184
Silicon rubber additive	Wacker Chemie		Wacker Primer G790
Tubes for air pressure	SMC Pneumatik GmbH		Polyurethan-Schlauch, metrisch
Alumin ELISA	Bethyl Laboratories		Human Albumin ELISA Quantitation Set
Lactate dehydrogenase assay	Stanbio Laboratory		LDH Liqui-UV kit
Alexa Fluor 594 acetylated LDL	Invitrogen		1 mg/ml