JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Abstract

المتعدد الوسائط، والتصوير الجزيئي يسمح التصور من العمليات البيولوجية في قرارات الخلوية، والتحت خلوية، والمستوى الجزيئي باستخدام متعددة، وتقنيات التصوير التكميلية. هذه العوامل التصوير تسهيل تقييم في الوقت الحقيقي من مسارات وآليات في الجسم الحي، مما يعزز فعالية التشخيصية والعلاجية على حد سواء. تقدم هذه المقالة بروتوكول لتركيب biofunctionalized النانوية الزرقاء البروسية (PB NPS) - فئة جديدة من وكلاء لاستخدامها في المتعدد الوسائط، وتطبيقات التصوير الجزيئي. طرائق التصوير تأسست في الجسيمات النانوية، والتصوير مضان والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، لها ميزات متكاملة. وPB مصادر القدرة النووية تمتلك التصميم الأساسية قذيفة حيث الجادولينيوم وأيونات المنغنيز أدرجت ضمن المساحات فراغي من شعرية PB توليد MRI النقيض من ذلك، سواء في T 1 و T 2 -weighted متواليات. والمغلفة للPB مصادر القدرة النووية مع أفيدين الفلورسنت باستخدام الكهربائي الذاتي كماsembly، والتي تمكن التصوير مضان. يتم تعديل النانوية المغلفة أفيدين مع بروابط المعقدة البيروكسيديز التي تمنح قدرات استهداف الجزيئية لالنانوية. يتم قياس الاستقرار وسمية الجسيمات النانوية، وكذلك relaxivities MRI بهم. ثم يتم أظهر، وقدرات التصوير الجزيئي المتعدد الوسائط من هذه PB مصادر القدرة النووية biofunctionalized باستخدام لهم للتصوير مضان وMRI الجزيئي في المختبر.

Introduction

التصوير الجزيئي هو التصور غير الغازية والمستهدفة من العمليات البيولوجية في الخلوية، والتحت خلوية، ومستويات الجزيئية 1. يسمح التصوير الجزيئي عينة للبقاء في المكروية موطنه الأصلي في حين يتم تقييمها ممراتها الداخلية وآليات في الوقت الحقيقي. عادة، والتصوير الجزيئي ينطوي على إدارة وكيلا التصوير خارجي في شكل جزيء صغيرة، جزيء أو جسيمات متناهية الصغر لتصور، الهدف، وتتبع العمليات الفسيولوجية ذات الصلة التي تجري دراستها 2. طرائق التصوير المختلفة التي تم استكشافها في التصوير الجزيئي وتشمل MRI، CT، PET، SPECT، الموجات فوق الصوتية، photoacoustics، رامان الطيفي، تلألؤ بيولوجي، مضان، وintravital المجهري 3. التصوير المتعدد الوسائط هو مزيج من اثنين أو أكثر من طرائق التصوير حيث يعزز الجمع بين القدرة على تصور وتميز العمليات والأحداث 4 البيولوجية المختلفة. Multimodaل التصوير يستغل نقاط القوة في تقنيات التصوير الفردية، في حين أن التعويض عن القيود الفردية 3.

تقدم هذه المقالة بروتوكول لتركيب biofunctionalized النانوية الزرقاء البروسية (PB NPS) - فئة رواية المتعدد الوسائط، وكلاء التصوير الجزيئي. وتستخدم في PB لتلك المصادر في التصوير مضان وMRI الجزيئي. PB هو صبغة تتألف من بالتناوب الحديد (II) والحديد (III) الذرات في الشبكة مكعب محورها الوجه (الشكل 1). وتتألف شعرية PB من بروابط السيانيد الخطية في الحديد II - CN - الربط الحديد III الذي يشتمل على الكاتيونات لتحقيق التوازن بين التهم ضمن شبكة ثلاثية الأبعاد لها 5. يتم استغلال قدرة PB لدمج الكاتيونات إلى شعرية من قبل بشكل منفصل تحميل الجادولينيوم وأيونات المنغنيز في مصادر القدرة النووية PB للتصوير بالرنين المغناطيسي التباين.

الأساس المنطقي وراء السعي لتصميم جسيمات متناهية الصغر للتصوير بالرنين المغناطيسي النقيض هو بسببمزايا هذا التصميم يوفر نسبة إلى وكلاء MRI النقيض الحالي. الغالبية العظمى من الهيئة وافقت عليها الولايات المتحدة وكلاء MRI المقابل هي يخلب الجادولينيوم التي هي ممغطس في الطبيعة وتوفير النقيض الإيجابي من قبل آلية الاسترخاء 6،7،8 تدور شعرية. بالمقارنة مع واحد الجادولينيوم-كلاب التي توفر انخفاض كثافة إشارة من تلقاء نفسها، وإدماج أيونات الجادولينيوم متعددة داخل شعرية PB من الجسيمات النانوية يتيح تعزيز كثافة إشارة (على النقيض إيجابي) 3،9. وعلاوة على ذلك، فإن وجود أيونات الجادولينيوم متعددة داخل شعرية PB يزيد من كثافة تدور الشاملة وحجم بارامغناطيسية من الجسيمات النانوية، والذي يزعج المجال المغناطيسي المحلي في المناطق المجاورة لها، وبالتالي توليد النقيض السلبي من قبل آلية الاسترخاء تدور تدور. وهكذا فإن الجسيمات النانوية التي تحتوي على الجادولينيوم تعمل على حد سواء كما T 1 (إيجابي) وT 2 كلاء (السلبي) على النقيض 10،11.

في مجموعة فرعية من المرضى الذين يعانون من اختلال وظائف الكلى، وقد تم ربط إدارة عوامل التباين القائم الجادولينيوم في تطوير التليف النظامية كلوي 8،12، 13، وقد دفعت هذه الملاحظة التحقيق في استخدام أيونات ممغطس البديلة وعوامل التباين ل التصوير بالرنين المغناطيسي. لذلك، يتم تكييف تصميم تنوعا من الجسيمات النانوية لدمج أيونات المنغنيز داخل شعرية PB. وعلى غرار الجادولينيوم-يخلب والمنغنيز-يخلب هي أيضا ممغطس وعادة ما تستخدم لتوفير كثافة إشارة إيجابية في MRI 7،14. كما هو الحال مع المحتوية على الجادولينيوم PB مصادر القدرة النووية، والتي تحتوي على المنغنيز PB مصادر القدرة النووية تعمل أيضا T 1 (إيجابي) وT 2 كلاء (سلبي) التباين.

لدمج قدرات التصوير مضان، والمغلفة للجسيمات متناهية الصغر "النوى" مع "biofunctional" قذيفة يتألف من أفيدين fluorescently المسمى بروتين سكري (الشكل 1). أفيدين تمكن ليس فقط التصوير مضان، ولكن أيضا بمثابة منصة لرسو السفن لبروابط المعقدة البيروكسيديز التي تستهدف خلايا معينة والأنسجة. والسندات أفيدين البيوتين هو واحد من أقوى المعروفة والسندات غير التساهمية التي تتميز تقارب ملزم قوية للغاية بين أفيدين والبيوتين 15. الحجز على بروابط المعقدة البيروكسيديز إلى المغلفة أفيدين PB مصادر القدرة النووية يمنح قدرات استهداف الجزيئية لمصادر القدرة النووية PB.

الدافع لمواصلة التألق وMR التصوير باستخدام PB مصادر القدرة النووية لأن هذه الطرائق التصوير تمتلك ميزات متكاملة. التصوير مضان هي واحدة من تقنيات التصوير الجزيئي البصرية الأكثر استخداما على نطاق واسع، ويسمح لتصور في وقت واحد من كائنات متعددة في حساسيات عالية 1،16،17. التصوير مضان هو آمنة، طريقة غير الغازية ولكن يرتبط أعماق منخفضة من الاختراق والقرارات المكانية 1،3،16. من ناحية أخرى، MRI يولد زمنية عاليةالتحليل المكاني د غير جراحية ودون الحاجة إلى الإشعاع المؤين 1،3،16. ومع ذلك MRI يعاني من حساسية منخفضة. لذلك تم اختيار التصوير مضان والتصوير بالرنين المغناطيسي حيث تقنيات التصوير الجزيئي بسبب خصائصها التكميلية لاختراق عمق، والحساسية، والتحليل المكاني.

تقدم هذه المقالة بروتوكول لتركيب وbiofunctionalization للمعايير المهنية الوطنية PB، PB مصادر القدرة النووية (GdPB)، والتي تحتوي على الجادولينيوم PB مصادر القدرة النووية (MnPB) 10،11 تحتوي على المنغنيز. يتم وصف الطرق التالية: 1) قياس الحجم، تهمة، والاستقرار الزمني للالنانوية، 2) تقييم السمسة من الجسيمات النانوية، 3) قياس relaxivities MRI، و 4) استخدام الجسيمات النانوية لمضان والتصوير الجزيئي MR من السكان من الخلايا المستهدفة في المختبر. هذه النتائج تظهر إمكانات مصادر القدرة النووية لاستخدامها المتعدد الوسائط، وكلاء التصوير الجزيئي في الجسم الحي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. توليف PB مصادر القدرة النووية، GdPB، وMnPB

ويتحقق توليف النانوية (PB مصادر القدرة النووية، GdPB، أو MnPB) باستخدام نظام التوليف وعاء واحد عن طريق تنفيذ الخطوات المفصلة أدناه:

  1. يعد حل 'A' تحتوي على 5 مل من 5 hexacyanoferrate ملي البوتاسيوم (II) في منزوع الأيونات (DI) المياه. اعتمادا على نوع من جسيمات متناهية الصغر يتم توليفها - PB مصادر القدرة النووية، GdPB، أو MnPB، وإعداد حل 'B' على النحو التالي:
    1. إلى PB مصادر القدرة النووية: إعداد 10 مل من محلول يحتوي على 2.5 ملي الحديد (III) الكلوريد في المياه DI.
    2. لGdPB مصادر القدرة النووية: إعداد 10 مل من محلول يحتوي على 2.5 ملي كل من الجادولينيوم (III) النترات والحديد (III) الكلوريد في المياه DI
    3. لMnPB مصادر القدرة النووية: إعداد 10 مل من محلول يحتوي على 2.5 ملي كل من المنغنيز (II) كلوريد الحديد و(III) الكلوريد في المياه DI.
  2. إضافة حل 'B' إلى دورق كروي، ويقلب محتويات القارورة في درجة حرارة الغرفة (RT) و1،000 دورة في الدقيقة. إضافة حل 'A' إسقاط الحكيم في قارورة تحتوي على حل مستديرة أسفل 'B'. السيطرة على معدل التدفق لإضافة حل 'A' إلى 'B' بواسطة مضخة تحوي المقرر أن تستغني ما يقرب من 10 مل / ساعة.
  3. تواصل اثارة في 1،000 دورة في الدقيقة في RT لمدة 30 دقيقة إضافية بعد إضافة محلول 'A' إلى 'B' غير كاملة. وقف اثارة وجمع الخليط.
  4. نقل aliquots من الخليط في أنابيب microcentrifuge لشطف النانوية خالية من المكونات غير المتفاعلة. إضافة 5 M كلوريد الصوديوم (0.2 مل كلوريد الصوديوم / مل خليط التفاعل) لكل قسامة للمساعدة في جمع الجسيمات بواسطة الطرد المركزي.
  5. الطرد المركزي كل قسامة من الجسيمات النانوية لمدة 10 دقيقة على الأقل في 20،000 × ز. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية طاف.
  6. و resuspend كل بيليه جسيمات متناهية الصغر في 1 مل من الماء DI عبر صوتنة باستخدام microtip (صوتنة النبض على / قبالة = 1/1 ثانية، والسعة = 50٪، والمدة =5 ثانية، والطاقة sonicator تصنيف = 125 W) لتفريق بيليه.
  7. كرر الخطوات من 1.4-1.6 3 × على الأقل للتأكد من أن الجسيمات النانوية خالية من أي مكونات من رد فعل وردة فعل منتجاته الأولية. بعد الطرد المركزي النهائي، و resuspend الجسيمات في 1 مل من الماء DI.

2. Biofunctionalization من PB مصادر القدرة النووية، GdPB، وMnPB

Biofunctionalization من الجسيمات النانوية ينطوي على طلاء من جسيمات متناهية الصغر "النوى" مع أفيدين وإضافة بروابط المعقدة البيروكسيديز كما هو موضح أدناه:

  1. طلاء من النانوية مع نيون أفيدين
    ويتحقق طلاء النانوية مع أفيدين الفلورسنت باستخدام كهرباء التجميع الذاتي حيث موجبة الشحنة أفيدين (بي ~ 10.5) وهي مغلفة إلى سالبة الشحنة النانوية على النحو التالي (18):
    1. إعداد تعليق من مصادر القدرة النووية PB، GdPB، أو MnPB في 1 مل من الماء DI. تصفية فلور اليكسا 488 المسمى أفيدين (A488، أعيد في الماء DI)من خلال 0.2 ميكرومتر النايلون فلتر microcentrifuge في 14،000 × ز لمدة 10 دقيقة. إضافة ≤0.2 ملغ النانوية أفيدين / ملغ. إضافة كل قسامة تصفيتها من A488 بشكل منفصل إلى aliquots من PB مصادر القدرة النووية، GdPB، أو MnPB.
    2. الاتصال النانوية مع A488 لمدة 2-4 ساعة مع الهز لطيف أو دوران في 4 درجات مئوية. حماية العينات من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
      ملاحظة: هذا A488 عوائد خطوة المغلفة PB مصادر القدرة النووية (PB-A488)، GdPB (GdPB-A488)، وMnPB (MnPB-A488).
  2. الحجز على الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز
    الحجز على الأجسام المضادة التي تستهدف المعقدة البيروكسيديز على الجسيمات النانوية المغلفة أفيدين وتحقيقه باستخدام التفاعلات أفيدين البيوتين على النحو التالي:
    1. إعداد تعليق من أفيدين المغلفة النانوية - PB-A488، A488-GdPB، وMnPB-A488 في 1 مل من الماء DI. تصفية الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز (كما تم توفيره من قبل الشركة المصنعة) من خلال مرشح ميكروسنتريفوج 0.2 ميكرومتر النايلون في 14،000 × ز لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: وهنا، تستخدم هذه الدراسة بيوتinylated مكافحة الخلايا العصبية، الدبقية مستضد 2 (ANG2) الذي يستهدف NG2 overexpressed داخل الخلايا والأنسجة في الجهاز العصبي المركزي والمعقدة البيروكسيديز eotaxin-3 المضادة للالبشري (Eot3) الذي يستهدف مستقبلات overexpressed على الحمضات أو خطوط الخلايا الحمضة.
    2. إضافة كل قسامة تصفيتها من الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز على حدة إلى مأخوذة من الجسيمات النانوية المغلفة أفيدين. إضافة ≤0.05 ملغ المعقدة البيروكسيديز الأجسام المضادة / ملغ أفيدين المغلفة الجسيمات النانوية. الاتصال النانوية المغلفة أفيدين مع الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز (ANG2 أو Eot3) لمدة 2-4 ساعة مع طيف والهز أو دوران في 4 درجات مئوية. حماية العينات من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
      ملاحظة: هذا غلة خطوة الأجسام المضادة النانوية المغلفة (على سبيل المثال GdPB-A488-Eot3 وMnPB-A488-ANG2).

3. تحجيم، زيتا المحتملة، والزمانية استقرار النانوية

يتم قياس حجم التوزيع، تهمة، واستقرار الجسيمات النانوية باستخدام ديناميكيةتشتت الضوء (DLS) طرق كما هو موضح أدناه:

  1. التحجيم من النانوية
    التحجيم من الجسيمات النانوية ويتحقق باستخدام تشتت الضوء الديناميكي على النحو التالي:
    1. إضافة 10 ميكرولتر من عينة جسيمات متناهية الصغر (1 ملغ / مل) إلى 990 ميكرولتر من المياه DI في كوفيت البلاستيك القابل للتصرف.
      ملاحظة: هذا هو قيمة تمثيلية للإشارة DLS جيدة.
    2. سقف كفيت ودوامة لالمزيج جيدا. ضع كفيت في النظام المستخدم لتحليل حجم الجسيمات من أجل قياس حجم الجسيمات النانوية. إجراء تحليل حجم الجسيمات في زاوية القياس من 173 درجة.
  2. إمكانات زيتا من الجسيمات النانوية
    يتم قياس زيتا إمكانات النانوية باستخدام ضوء تحليل المرحلة نثر على النحو التالي:
    1. إضافة 100 ميكرولتر من عينة جسيمات متناهية الصغر (1 ملغ / مل) إلى 900 ميكرولتر من المياه DI في زنزانة الشعرية البلاستيك القابل للتصرف. هذه القيمة هي ممثل لقياس المحتملة زيتا جيد.
    2. ضع capillarذ خلية في النظام المستخدم لتحليل إمكانات زيتا من أجل قياس إمكانات زيتا من الجسيمات النانوية باستخدام المعلمات الافتراضية عند 25 ° C.
  3. الاستقرار الزمني للالنانوية
    يتم قياس الاستقرار الزمني للالنانوية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي على النحو التالي:
    1. تقييم استقرار الجسيمات النانوية عن طريق قياس أحجام الجسيمات النانوية في الماء DI وكذلك التعديل المتوسطة Dulbecco والنسر (DMEM) كما هو موضح في القسم 3.1.
    2. تكرار قياسات حجم في الماء DI وDMEM مرة واحدة / يوم على مدى فترة من 5 أيام.

4. السمسة من النانوية

يتم قياس السمية الخلوية من الجسيمات النانوية باستخدام XTT تكاثر الخلايا الفحص على النحو التالي:

  1. البذور 10،000-15،000 خلايا / جيد من كل نوع من الخلايا درس (Neuro2a، BSG D10، موسوعة الحياة-1، وOE21) في لوحة 96-جيدا. تأكد من أن الحجم الكلي للخلايا المصنف لا البريدإكسيد 0.2 مل / جيد. احتضان خلايا المصنفة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. الاتصال النانوية مع الخلايا:
    1. احتضان الخلايا مع تركيزات مختلفة من الجسيمات النانوية (0،01 حتي 0،5 ملغ / مل). الرجوع إلى الجدول 1 كجدول التمثيلي الذي يصف كميات من الجسيمات النانوية (في 50 ميكرولتر) تضاف إلى الخلايا بعد إزالة 50 ميكرولتر من المتوسطة / جيد.
      1. لحساب أي الامتصاصية التدخل من الجسيمات النانوية داخل الفحص، إضافة فارغة تتكون من التركيز المناسب من الجسيمات النانوية (0-0،5 ملغ / مل، في معادلة للقيمة المضافة للخلايا) إلى وسيط وبدون الخلايا.
    2. احتضان الخلايا مع النانوية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. وسائل الإعلام نضح من كل بئر وشطف مع العازلة تلطيخ تتألف من 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) في محلول الفوسفات مخزنة (PBS). إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام دون أحمر الفينول ويحضن في CO 2 37 درجة مئوية و 5٪ل16-18 ساعة.
  3. إعداد XTT خلية انتشار الفحص الحل تعمل عن طريق خلط مكونات عدة (XTT الكاشف وXTT المنشط) وفقا للمواصفات الشركة المصنعة. نضح وسائل الإعلام من الآبار وإضافة 100 ميكرولتر من RPMI (RPMI ث / س الفينول الحمراء + 10٪ FBS + 1 × القلم بكتيريا) أو المتوسطة المناسب لنوع من الخلايا التي تمت دراستها. إضافة 50 ميكرولتر من حل XTT العمل على كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل2-2.5 ساعة.
  4. قياس الامتصاصية في 490 نانومتر، مع طول موجة إشارة من 630 نانومتر إلى تصحيح لبصمات الأصابع أو اللطخات. حساب الامتصاصية تصحيح لكل بئر (A -A 490 630) ومتوسط ​​القراءات لمكررات.
  5. طرح قراءات فارغة من كل قيمة جيدة لحساب القيم الامتصاصية تصحيح النهائية. حساب النسبة المئوية بقاء لكل عينة عن طريق تطبيع الامتصاصية تصحيح النهائي لتلك الخلايا غير المعالجة دون النانوية. مؤامرة سونسبة rvival بوصفها وظيفة من تركيز جسيمات متناهية الصغر.

5. MRI Relaxivities للمعايير المهنية الوطنية PB، GdPB، وMnPB

يتم قياس relaxivity التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام T 1 - وT 2 -weighted متواليات من خلال إعداد "الوهمية" MRI باستخدام لوحة 96-جيدا تحتوي على الجسيمات النانوية كما هو موضح أدناه:

  1. إعداد فانتوم
    1. إعداد لوحة 96-جيدا مع بعضها تحتوي على 100 ميكرولتر النانوية (PB مصادر القدرة النووية، GdPB، أو MnPB) في تركيز المناسب. بدءا من تركيز 0.4 ملي لكل نوع من جسيمات متناهية الصغر، وتمييع متسلسل النانوية 2 × استخدام المياه DI حتى تركيز 2.4 × 10 -5 يتم التوصل M (وهذا يتطلب 14 التخفيفات و15 بئرا).
    2. إضافة 100 ميكرولتر من المنصهر 1٪ محلول الاغاروز في الماء DI في كل بئر وتخلط جيدا. السماح للهلام ليصلب في 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
      ملاحظة: هذا غلة الوهمية التي تحتوي على التخفيفات المسلسلالنانوية في الاغاروز طدت.
    3. وضع الوهمية في الأفقي 3 T المغناطيس السريري تحت كتلة صلبة من 2٪ أجار (150 سم 3). تأمين الوهمية وكتلة من أجار داخل المركز من 8 قنوات HD لفائف الدماغ. قياس الأوقات الاسترخاء باستخدام 0.5 ملم شرائح سميكة الاكليلية في منتصف ارتفاع لوحة 96-جيدا 11.
  2. T 1 - وT 2 -Weighted المتتاليات
    استخدام الإعدادات التمثيلية التالية للحصول على تسلسل في المغناطيس السريري.
    ملاحظة: يتم تحسين هذه القيم لالنانوية المستخدمة في هذه الدراسة:
    1. اكتساب T 1 -weighted الصور (T1W) MR باستخدام السوائل الانتعاش في أعقاب انقلاب موهن (FLAIR) تسلسل: صدى القطار (ET) = 8، والوقت التكرار (TR) = 2،300 ميللي ثانية، والوقت صدى (TE) = 24.4 ميللي ثانية، وحجم مصفوفة = 512 × 224، مجال الرؤية (فوف) = 16 × 16 سم 2.
    2. اكتساب T 2 -weighted الصور (T2W) MR باستخدام relaxa سريع التاليةنشوئها سريع تدور الصدى (FRFSE) تسلسل: ET = 21؛ TR = 3،500 مللي ثانية. TE = 104 مللي ثانية. حجم المصفوفة = 512 × 224. FOV = 16 × 16 سم 2.
    3. اكتساب T1W وT2W MR الصور في 127 ميغاهيرتز (3 T) في الأوقات انعكاس التالية: 50، 177، 432، 942، 1،961، و 4،000 مللي ثانية.
  3. قياس Relaxivities MRI
    1. بعد الحصول على T1W وT2W الصور باستخدام تسلسل هو موضح في القسم 5.2، وقياس كثافة إشارة لكل جيدا باستخدام يماغيج، المعينة من الآن فصاعدا باسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) عن طريق اختيار كل ROI باستخدام زر المحاصيل البيضاوي تقع على شريط الأدوات الرئيسي، ثم اختيار تحليل> قياس.
      ملاحظة: وينبغي أن يكون المنبثقة عرض متوسط ​​كثافة إشارة لكل ROI تحت العمود المسمى "المتوسط".
    2. لكل ROI، رسم شدة إشارة تقاس قته انعكاس معين. إذا لزم الأمر، ونقاط المقلوب (قراءات) التي تولد على "فقاعة" الأولية أو القيم المتطرفة في بداية المؤامرة (أقل انقلابمرات).
      ملاحظة: يتم إنشاء هذه القراءات في بعض الأحيان انعكاس منخفضة لأن MRI يقيس حجم أو قيمة مطلقة الصور بدلا من الفعلية (السلبية) قيمة، الذي يحتاج الى استأثرت / تصحيح ل19.
    3. إعداد تناسب الأسي ل كل قطعة من كثافة إشارة لرويس (SI) مقابل مرة انعكاس (T I) كما هو موضح في القسم 5.2. مؤامرة T أنا على محور س، SI على المحور الصادي. ɑ وΔ هي الثوابت التي تحددها الانحدار، وT 1 أو 2 T هو المتغير لحلها:
      figure-protocol-14293
      حيث t = T 1، T 2.
    4. حل لT 1 أو T 2 باستخدام المعادلة المذكورة أعلاه ورسم معكوس القيم المحسوبة (1 / T 1 و 1 / T 2) ضد تركيزات الجسيمات النانوية المستخدمة في كل ROI.
    5. حساب المنحدر من الرسم البياني الخطي الذيتعطي relaxivities ص 1 و ص 2.
      ملاحظة: القسم التالي من بروتوكول يصف تطبيق النانوية لوضع العلامات الفلورية وتوليد النقيض MRI في الخلايا المستهدفة.

6. وصفها نيون من الخلايا المستهدفة باستخدام الجسيمات النانوية - متحد البؤر المجهر

ملاحظة: الجسيمات النانوية (PB مصادر القدرة النووية، GdPB، وMnPB) يمكن استخدامها لتسمية السكان من الخلايا المستهدفة (رصدها بواسطة المجهر متحد البؤر) على النحو التالي fluorescently:

  1. توليف للنيون النانوية
    1. توليف GdPB-A488، A488-GdPB-Eot3، MnPB-A488، A488-MnPB-ANG2 لوضع العلامات الفلورية من السكان من الخلايا المستهدفة عن طريق اتباع الخطوات بالتفصيل في المادتين 1 و 2.
  2. إعداد الخلايا لاستهداف الإسفار
    1. معطف لا. 1.5 النظارات غطاء الصغيرة عن طريق غمس لهم في حل من 0.002٪ بولي (L-ليسين) هيدروبروميد لمدة 90 دقيقة. إزالة النظارات غطاء من الحل والسماح لهم لتجف لمدة 24 ساعة.
    2. بذور الخلايا (مثل موسوعة الحياة-1، BSG D10، SUDIPG1) على النظارات غطاء المغلفة وضعها في لوحة 6 جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 16 ساعة على الأقل. شطف الخلايا مع الحل 1 × PBS و(اختياري) مع تحديد 10٪ الفورمالديهايد في حل العازلة محايد لمدة 15 دقيقة. خلايا وصمة عار مع 5 ميكرومتر الأحمر البرتقالي صبغ الخلايا نفيذ في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وفي وقت لاحق، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
  3. > وصفها نيون من الخلايا المستهدفة
    1. إضافة 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA، في الماء DI) إلى الخلايا لتقليل غير محددة ملزمة على الخلايا، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. احتضان الخلايا مع النانوية في 1٪ BSA لمدة 1 ساعة. لموسوعة الحياة-1: احتضان مع 0.2 ملغ / مل GdPB-A488 أو GdPB-A488-Eot3. لBSG D10 وSUDIPG1: احتضان مع 0.2 ملغ / مل MnPB-A488 أو MnPB-A488-ANG2. شطف الخلايا مع PBS 3 × لإزالة unbouالنانوية الثانية.
    3. عكس بعناية غطاء زجاجي (التي تحتوي على الخلايا والجسيمات النانوية) على شريحة المجهر، وضمان عدم وجود أي فقاعات الهواء المحاصرين. ختم الحافة بين الزجاج غطاء وشريحة المجهر عن طريق تطبيق بعناية طلاء الأظافر واضحة. صورة الخلايا باستخدام متحد البؤر مجهر المسح بالليزر.

7. وضع العلامات الفلورية من الخلايا المستهدفة باستخدام الجسيمات النانوية - التدفق الخلوي

النانوية (PB مصادر القدرة النووية، GdPB، وMnPB) يمكن استخدامها لتسمية fluorescently السكان من الخلايا المستهدفة (رصدتها التدفق الخلوي) على النحو التالي:

  1. إعداد تعليق من الخلايا استهدافهم في برنامج تلفزيوني. للدراسات ثقافة نقية، تتألف تعليق من نوع خلية واحدة (على سبيل المثال BSG D10)؛ و resuspend بيليه خلية من خلايا D10 BSG في برنامج تلفزيوني في 100،000 خلية / مل (10 مل المجموع). للدراسات ثقافة مختلطة، تتكون من معلقات من اثنين على الاقل من أنواع الخلايا (مثل موسوعة الحياة-1 وOE21)؛ على غرار BSG D10، والكريات الخلايا في resuspend من موسوعة الحياة-1 وOE21 في برنامج تلفزيوني في 100،000 خلية / مل لكل منهما (ما مجموعه 10 مل).
    1. إعداد نسب متفاوتة من موسوعة الحياة-1: OE21 1: 0 (2 مل موسوعة الحياة-1)، 3: 1 (1.5 مل موسوعة الحياة-1، و 0.5 مل OE21)، 1: 1 (1 مل لكل من موسوعة الحياة-1 وOE21)، 1: 3 (0.5 مل موسوعة الحياة-1، 1.5 مل OE21)، 0: 1 (2 مل OE21).
  2. منع الخلايا (تعليق النقية والمختلطة) استهدافهم من قبل النانوية مع 2 مل من 5٪ BSA للحد غير محددة وملزمة.
  3. إضافة 1 مل (1 ملغ / مل) الجسيمات النانوية إلى الخلايا واحتضان لمدة 1 ساعة. لBSG D10، واحتضان الخلايا مع MnPB-A488، A488-MnPB-ABC (مراقبة الأجسام المضادة)، أو MnPB-A488-ANG2). لمخاليط من موسوعة الحياة-1 وOE21، احتضان خليط مع كمية محددة من GdPB-A488-Eot3.
  4. شطف الخلايا خالية من الجسيمات النانوية غير منضم من قبل الغزل أسفل العينات عند 1،000 × ز لمدة 5 دقائق 3 × على الأقل لإزالة جزيئات غير منضم. Resuspend الخلايا في 1 مل PBS والإصلاح مع 10٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. الخلايا التي تفرخ وصمة عار مع 10 ميكروغرام / مل7-D Aminoactinomytcin في برنامج تلفزيوني على الجليد لمدة 30 دقيقة. شطف مع PBS، ثم تحليل 10،000 خلايا بوابات من كل عينة باستخدام تدفق عداد الكريات.

8. توليد MRI التباين على الخلايا المستهدفة باستخدام الجسيمات النانوية

النانوية (PB مصادر القدرة النووية، GdPB، وMnPB) يمكن استخدامها لتوليد MRI النقيض من ذلك (في كل من T 1 - وT 2 -weighted متواليات) في السكان من الخلايا المستهدفة على النحو التالي:

  1. إعداد فانتوم
    1. تنمو الخلايا (مثل BSG D10) في قوارير T75 حتى ~ 80٪ التقاء. استخدام متوسط ​​النمو المناسب والظروف. لBSG D10، وتنمو الخلايا في DMEM + 10٪ FBS + 1 × القلم بكتيريا في 37 ° C وCO 2 5٪.
    2. شطف الخلايا الحرة متوسطة مع 5 مل PBS ومنع الخلايا مع 5 مل 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة لتقليل غير محددة وملزمة. إضافة 5 مل (0.5 ملغ / مل) الجسيمات النانوية إلى الخلايا. لBSG D10، واحتضان الخلايا مع MnPB-A488، A488-MnPB-ABC (مراقبة الأجسام المضادة)، وحركة الأشخاص الطبيعيينB-A488-ANG2 لمدة 1 ساعة.
    3. شطف الخلايا 3 × مع 5 مل PBS لإزالة الجسيمات النانوية غير منضم. يعرض للتريبسين الخلايا التي تفرخ الخلايا مع 2 مل التربسين EDTA الحل 0.25٪ 1 × لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لفصل لهم من القارورة لإعداد الوهمية. إضافة 8 مل من DMEM لإخماد trypsinization من الخلايا.
    4. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي لهم في 1،000 × ز لمدة 5 دقائق. نضح من طاف. Resuspend الخلايا في 1 مل PBS وإضافة 1 مل 10٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لإصلاح الخلايا. إضافة 100 ميكرولتر من كل عينة لبئر منفصل من لوحة 96-جيدا.
    5. إضافة 100 ميكرولتر من المنصهر 1٪ محلول الاغاروز في الماء DI في كل بئر ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. السماح للهلام ليصلب في 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
      ملاحظة: هذا ينتج الوهمية التي تحتوي على الخلايا مع النانوية المرفقة في الاغاروز طدت.
    6. وضع الوهمية في الأفقي 3 T المغناطيس السريري بجوار كتلة صلبة من 2٪ أجار (150 سم 3). تأمين الوهمية وكتلة من أجار داخل المركز من 8 قنوات HD لفائف الدماغ. قياس الأوقات الاسترخاء باستخدام 0.5 ملم شرائح سميكة الاكليلية في منتصف الارتفاع من لوحة 96-جيدا 11.
  2. T 1 - وT 2 -Weighted المتتاليات
    استخدام الإعدادات التالية للحصول على تسلسل في التصوير بالرنين المغناطيسي المغناطيس السريري:
    1. الحصول على صور T1W MR باستخدام التالية تدور صدى التسلسل: صدى القطار (ET) = 1، والوقت التكرار (TR) = 650 ميللي ثانية، والوقت صدى (TE) = 11 ميللي ثانية، وحجم مصفوفة = 320 × 256، مجال الرؤية (فوف) = 10 × 10 سم 2.
    2. الحصول على صور T2W MR باستخدام تسلسل FRFSE التالية: ET = 28؛ TR = 3،000 مللي ثانية. TE = 101 مللي ثانية. حجم المصفوفة = 384 X 288. FOV = 10 × 10 سم 2.
  3. تجهيز ما بعد الاستحواذ
    1. لتسهيل القراءة، وتحويل الأصلي حجم الصور الرمادية في صورة نطاق اللون باستخدام يماغيج: اختر صورة> نوع> 8 بت، لتحويل الصورة إلى اللون الرمادي الحجم.
    2. حساب كثافة تطبيع لكل عينة بعد طرح مساهمة إشارة من الحل الاغاروز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام نظام التوليف وعاء واحد، والجسيمات النانوية من PB مصادر القدرة النووية (يعني قطرها 78.8 نانومتر، ومؤشر التشتت المتعدد (PDI) = 0.230 و تحسب من قبل الديناميكي أداة تشتت الضوء)، GdPB (يعني قطرها 164.2 نانومتر، PDI = 0.102)، أو MnPB ( يعني قطرها 122.4 نانومتر، PDI = 0.124) التي هي monodisperse (مقاس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد قدمت هذه المقالة الطرق لتركيب فئة جديدة من متعدد الوسائط، وكلاء التصوير الجزيئي على أساس biofunctionalized النانوية الزرقاء البروسية. طرائق التصوير الجزيئي دمجها في النانوية هي التصوير مضان وMRI الجزيئي، نظرا لخصائصها التكميلية. النانوية الزرقاء البروسية biofunctionalized لديه...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O)Sigma-AldrichP9387
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)Sigma-Aldrich221279
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O)Sigma-Aldrich211591
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)Sigma-Aldrich236489
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate AntibodyMilliporeAB5320
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3Peprotech500-P156GBT
Neuro-2a Cell LineATCCCCL-131
BSG D10 Cell LineLab stock---
OE21 Cell LineSigma-Aldrich96062201
SUDIPG1 NeurospheresLab stock---
Eol-1 Cell LineSigma-Aldrich94042252
Poly(L-lysine) hydrobromideSigma-AldrichP1399
FormaldehydeSigma-AldrichF8775
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
Aminoactinomycin DSigma-AldrichA9400
Triton X-100Sigma-AldrichX100
CellTrace Calcein Red-Orange, AMLife TechnologiesC34851
Avidin-Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21370
CentrifugeEppendorf5424
Peristaltic PumpInstechP270
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600
SonicatorQSonicaQ125
Hot Plate/Magnetic StirrerVWR97042-642
Ultra Clean Aluminum FoilVWR89107-732
Vortex MixerVWR58816-121
1.7 ml conical microcentrifuge tubesVWR87003-295
15 ml conical centrifuge tubesVWR21008-918
Tube holdersVWR82024-342
Disposable plastic cuvettesVWR7000-590 (/586)
Zetasizer capillary cellVWRDTS1070
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin columnVWR82031-356
96-well cell culture trayVWR29442-056
Trypsin EDTA 0.25% solution 1xJR Scientific82702
Cell Culture Grade PBS (1x)Life Technologies10010023
XTT Cell Proliferation Assay KitTrevigen4891-025-K
T75 Flask89092-700VWR
Dulbecco's Modified Eagle's MediumBiowhitaker12-604Q
Fetal Bovine SerumLife Technologies10437-010
Pen-Strep 1xLife Technologies15070063
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning MicroscopeOlympusFV1200
Chambered Microscope SlidesThermo Scientific154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5VWR48366-227
Microscope SlidesVWR16004-368
RPMISigma-AldrichR8758 
AgaroseSigma-AldrichA9539 
FACSCalibur Flow CytometerBD Biosciences
3 T Clinical MRI MagnetGE Healthcare
100 ml round-bottom flask

References

  1. Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
  2. Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
  3. James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
  4. Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
  5. Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
  6. Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , National Center for Biotechnology Information. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330 (2004).
  7. Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
  8. Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
  9. Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do's and don't's. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
  10. Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
  11. Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
  12. Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
  13. Information on Gadolinium-Based Contrast Agents. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm (2013).
  14. Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
  15. Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
  16. Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
  17. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).
  18. Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
  19. Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. Duke Review of MRI Principles. 304, Mosby. Philadelphia, PA. 304(2012).
  20. Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
  21. Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

98

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved