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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Abstract

Multimodale, imaging molecolare permette la visualizzazione dei processi biologici a risoluzioni cellulare, subcellulare, e a livello molecolare che utilizzano più tecniche di imaging complementari,. Questi agenti di imaging facilitano la valutazione in tempo reale dei percorsi e meccanismi in vivo, che migliorano sia efficacia diagnostica e terapeutica. Questo articolo presenta il protocollo per la sintesi di nanoparticelle biofunctionalized Prussia blu (PB NP) - una nuova classe di agenti per l'uso in applicazioni di imaging multimodali, molecolare. Le modalità di imaging incorporati nel nanoparticelle, imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica (MRI), hanno caratteristiche complementari. Le PB NP possiedono un design core-shell in cui gadolinio e ioni manganese incorporati negli spazi interstiziali del reticolo PB generano MRI contrasto, sia in T 1 e T 2 pesate sequenze. Le PB NP sono rivestiti con avidina fluorescente utilizzando elettrostatico auto-astaggio, che permette l'imaging di fluorescenza. Le nanoparticelle avidina rivestite vengono modificati con leganti biotinilati che conferiscono capacità di targeting molecolare ai nanoparticelle. La stabilità e la tossicità delle nanoparticelle sono misurati, così come i loro relassività MRI. I multimodali, capacità di imaging molecolare di questi biofunctionalized PB NP sono poi dimostrate utilizzandoli per imaging di fluorescenza e MRI molecolare in vitro.

Introduzione

L'imaging molecolare è la visualizzazione non invasiva e mirata dei processi biologici a livello cellulare, subcellulare e livello molecolare 1. L'imaging molecolare permette un esemplare di rimanere nel suo microambiente nativa mentre i percorsi ei meccanismi endogeni sono valutati in tempo reale. Tipicamente, imaging molecolare prevede la somministrazione di un agente di imaging esogeno sotto forma di una piccola molecola, macromolecola, o nanoparticelle di visualizzare, destinazione, e tracciare processi fisiologici relativi allo studio 2. Le varie modalità di imaging che sono state esplorate in imaging molecolare includono MRI, CT, PET, SPECT, ultrasuoni, fotoacustica, spettroscopia Raman, bioluminescenza, fluorescenza e microscopia intravitale 3. Imaging multimodale è la combinazione di due o più modalità di imaging in cui la combinazione migliora la capacità di visualizzare e caratterizzare vari processi e 4 eventi biologici. Multimodal di imaging sfrutta i punti di forza delle singole tecniche di imaging, mentre compensando i loro limiti individuali 3.

Questo articolo presenta il protocollo per la sintesi di nanoparticelle biofunctionalized Prussia blu (PB NP) - una nuova classe di agenti di imaging multimodali, molecolare. Le PB PN sono utilizzati per imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica molecolare. PB è un pigmento costituito da un alternarsi di ferro (II) e ferro (III) atomi in un reticolo cubico a facce centrate (Figura 1). Il reticolo PB comprende ligandi cianuro lineari in un Fe II - CN - Fe III linkage che incorpora cationi per bilanciare oneri all'interno della rete tridimensionale 5. La capacità di PB di incorporare cationi nel suo reticolo viene sfruttata caricando separatamente gadolinio e gli ioni di manganese nelle PN PB per MRI contrasto.

Il razionale per perseguire un progetto di nanoparticelle per MRI contrasto è a causa dii vantaggi questo disegno offre rispetto a mezzi di contrasto MRI attuali. La stragrande maggioranza degli agenti di contrasto MRI US FDA ha approvato sono chelati di gadolinio che sono paramagnetica in natura e forniscono contrasto positivo dal meccanismo relax 6,7,8 spin-reticolo. Rispetto ad un singolo gadolinio chelato che fornisce bassa intensità di segnale propria, l'incorporazione di molteplici ioni gadolinio all'interno del reticolo PB delle nanoparticelle fornisce una maggiore intensità di segnale (contrasto positivo) 3,9. Inoltre, la presenza di più ioni gadolinio all'interno del reticolo PB aumenta la densità di spin complessiva e la grandezza paramagnetismo delle nanoparticelle, che disturba il campo magnetico locale nelle sue vicinanze, generando contrasto negativo dal meccanismo di rilassamento spin-spin. Così le nanoparticelle contenenti gadolinio funzionano sia come T 1 (positivo) e T 2 agenti (negativo) contrasto 10,11.

In un sottogruppo di pazienti con funzione renale compromessa, la somministrazione di mezzi di contrasto a base di gadolinio è stato collegato allo sviluppo di fibrosi sistemica nefrogenica 8,12, 13. Questa osservazione ha spinto indagini l'uso di ioni paramagnetici alternativi come agenti di contrasto per MRI. Pertanto, il design versatile delle nanoparticelle è adattato per incorporare ioni manganese all'interno del reticolo PB. Simile al gadolinio-chelati, manganese chelati sono anche paramagnetica e sono tipicamente utilizzati per fornire intensità del segnale positivo in MRI 7,14. Come con gadolinio contenenti PB PN, i-manganese contenenti PB NP funzionano anche come T 1 (positivo) e T 2 agenti (negativo) di contrasto.

Per incorporare funzionalità di imaging di fluorescenza, le nanoparticelle "core" sono rivestite con un guscio "biofunzionale" costituito dalla avidina fluorescenza marcata glicoproteina (Figura 1). Avidina consente non solo di imaging di fluorescenza, ma serve anche come piattaforma di attracco per ligandi biotinilati che colpiscono le cellule e tessuti specifici. Il legame avidina-biotina è uno dei più forti legami noti, non covalenti caratterizzati da estremamente forte affinità di legame tra avidina e biotina 15. L'attaccamento di ligandi biotinilati al avidina rivestite PB NP conferisce capacità di targeting molecolare ai NP PB.

La motivazione per il perseguimento di fluorescenza e RM con PB NP è perché queste modalità di imaging possiedono caratteristiche complementari. Imaging di fluorescenza è una delle tecniche di imaging molecolare ottici più diffusi, e consente la visualizzazione simultanea di più oggetti ad alte sensibilità 1,16,17. Imaging di fluorescenza è una cassetta di sicurezza, modalità non invasiva, ma è associato a basse profondità di penetrazione e risoluzioni spaziali 1,3,16. D'altra parte, un MRI genera alta temporaled risoluzione spaziale in modo non invasivo e senza la necessità di radiazioni ionizzanti 1,3,16. Tuttavia MRI soffre di bassa sensibilità. Pertanto imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica sono stati selezionati come le tecniche di imaging molecolare per le loro caratteristiche complementari di penetrazione di profondità, sensibilità e risoluzione spaziale.

Questo articolo presenta il protocollo per la sintesi e biofunzionalizzazione delle NP PB, contenente gadolinio PB NP (GdPB), e contenente manganese PB NP (MnPB) 10,11. I seguenti metodi sono descritti: 1) la misura di dimensioni, carica, e la stabilità temporale delle nanoparticelle, 2) valutazione della citotossicità delle nanoparticelle, 3) di misura della relassività MRI, e 4) utilizzazione delle nanoparticelle per fluorescenza e RM molecolare di una popolazione di cellule bersaglio in vitro. Questi risultati dimostrano il potenziale delle NP per l'uso come agenti di imaging multimodali, molecolari in vivo.

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Protocollo

1. Sintesi di PB NP, GdPB, e MnPB

Sintesi delle nanoparticelle (PB NP, GdPB o MnPB) si ottiene utilizzando uno schema di sintesi one-pot eseguendo i passaggi di seguito indicati:

  1. Preparare la soluzione 'A' contenente 5 ml di 5 esacianoferrato di potassio mm (II) in acqua deionizzata (DI) di acqua. A seconda del tipo di nanoparticelle essere sintetizzato - PB PN, GdPB o MnPB, preparare la soluzione 'B' come segue:
    1. Per PB NP: preparare 10 ml di una soluzione contenente 2,5 mM di ferro (III) cloruro in acqua deionizzata.
    2. Per GdPB NP: preparare 10 ml di una soluzione contenente 2,5 mm ciascuno di gadolinio (III) nitrato e ferro (III) cloruro in acqua deionizzata
    3. Per MnPB NP: preparare 10 ml di una soluzione contenente 2,5 mM ciascuno di manganese (II) cloruro e ferro (III) cloruro in acqua deionizzata.
  2. Aggiungere la soluzione 'B' a un pallone da, e mescolare il contenuto della beuta a temperatura ambiente (RT) e1.000 rpm. Aggiungere la soluzione 'A' goccia a goccia nel round-bottom pallone contenente la soluzione 'B'. Controllare la portata per l'aggiunta di soluzione 'A' a 'B' da una pompa peristaltica impostato per erogare circa 10 ml / h.
  3. Continuare agitazione a 1000 rpm a temperatura ambiente per altri 30 minuti dopo l'aggiunta della soluzione di 'A' a 'B' è completa. Smettere di mescolare e raccogliere il composto.
  4. Trasferire aliquote della miscela in tubi microcentrifuga per sciacquare le nanoparticelle libere di componenti che non hanno reagito. Aggiungere 5 M NaCl (0,2 ml NaCl miscela di reazione / ml) per ogni aliquota per facilitare la raccolta di particelle mediante centrifugazione.
  5. Centrifugare ciascuna aliquota di nanoparticelle per almeno 10 min a 20.000 × g. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il surnatante.
  6. Risospendere ogni pellet di nanoparticelle in acqua DI 1 ml tramite ultrasuoni utilizzando un microtip (impulso sonicazione on / off = 1/1 sec, ampiezza = 50%, la durata =5 sec, potere sonicator rating = 125 W) per rompere il pellet.
  7. Ripetere i passaggi 1,4-1,6 almeno 3 × per garantire che le nanoparticelle sono privi di componenti dei sottoprodotti di reazione e di reazione iniziali. Dopo la centrifugazione finale, risospendere le particelle in acqua DI 1 ml.

2. biofunzionalizzazione di PB NP, GdPB, e MnPB

Biofunzionalizzazione delle nanoparticelle comporta rivestimento delle nanoparticelle "core" con avidina e aggiungendo ligandi biotinilati come descritto di seguito:

  1. Rivestimento delle nanoparticelle con fluorescente Avidin
    Rivestimento delle nanoparticelle con avidina fluorescente viene ottenuta utilizzando elettrostatica autoassemblaggio dove caricata positivamente avidina (pI ~ 10.5) è rivestito a carica negativa nanoparticelle come segue 18:
    1. Preparare sospensioni dei PN PB, GdPB o MnPB in acqua DI 1 ml. Filtro Alexa Fluor 488-marcato avidina (A488, ricostituito in acqua deionizzata)attraverso un filtro di nylon microcentrifuga 0,2 micron a 14.000 xg per 10 min. Aggiungi ≤0.2 mg avidina / mg nanoparticelle. Aggiungi ciascuna aliquota filtrato di A488 separatamente alle aliquote di PB NP, GdPB, o MnPB.
    2. Contattate le nanoparticelle con A488 per 2-4 ore con un leggero scuotimento o la rotazione a 4 ° C. Proteggere i campioni dalla luce con un foglio di alluminio.
      NOTA: Questo A488 rese passo rivestito PB NP (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), e MnPB (MnPB-A488).
  2. Allegato di Biotinylated Anticorpi
    Allegato di anticorpi rivolti biotinilati sul nanoparticelle avidina rivestite ha luogo con interazioni avidina-biotina come segue:
    1. Preparare sospensioni dei avidina rivestito nanoparticelle - PB-A488, GdPB-A488, e MnPB-A488 in acqua DI 1 ml. Filtro anticorpo biotinilato (come fornito dal costruttore) attraverso un filtro microcentrifuga 0,2 micron nylon a 14.000 xg per 10 min.
      NOTA: Qui, il presente studio utilizza biotinylated anti-neurone-gliali antigene 2 (ANG2) che gli obiettivi di NG2 overexpressed all'interno delle cellule e tessuti del sistema nervoso centrale e biotinilato eotaxina-3 anti-umano (Eot3) che gli obiettivi di recettori sovraespressi su eosinofili o linee cellulari eosinofili.
    2. Aggiungere ciascuna aliquota filtrato di anticorpo biotinilato separatamente alle aliquote delle nanoparticelle rivestite con avidina. Aggiungi ≤0.05 mg biotinilati nanoparticelle anticorpali / mg avidina rivestite. Contattate le nanoparticelle avidina rivestite con gli anticorpi biotinilati (ANG2 o Eot3) per 2-4 ore con agitando delicatamente o rotazione a 4 ° C. Proteggere i campioni dalla luce con un foglio di alluminio.
      NOTA: Questo anticorpo rendimenti passo nanoparticelle rivestite (ad esempio GdPB-A488-Eot3 e MnPB-A488-ANG2).

3. Dimensionamento, Zeta potenziale, e temporale stabilità delle nanoparticelle

La distribuzione delle dimensioni, carica, e la stabilità delle nanoparticelle sono misurati usando dinamicadispersione della luce (DLS) metodi come descritto di seguito:

  1. Dimensionamento delle nanoparticelle
    Il dimensionamento delle nanoparticelle è ottenuta utilizzando light scattering dinamico come segue:
    1. Aggiungere 10 ml di campione nanoparticelle (1 mg / ml) a 990 ml di acqua deionizzata in una cuvetta di plastica monouso.
      NOTA: Questo è il valore rappresentativo per un buon segnale DLS.
    2. Tappare la cuvetta e vortex per amalgamare bene. Posizionare la cuvetta in un sistema utilizzato per analizzare la dimensione delle particelle al fine di misurare le dimensioni delle nanoparticelle. Effettuare analisi granulometrica in un angolo di misura di 173 °.
  2. Potenziale Zeta delle nanoparticelle
    Potenziale zeta delle nanoparticelle è misurata utilizzando dispersione analisi fase leggera come segue:
    1. Aggiungere 100 pl di campione nanoparticelle (1 mg / ml) a 900 ml di acqua deionizzata in una cella di plastica monouso capillare. Questo valore è rappresentativo di una buona misura di potenziale zeta.
    2. Posizionare il capillarey cella in un sistema utilizzato per analizzare il potenziale zeta per misurare il potenziale zeta delle nanoparticelle utilizzando parametri di default a 25 ° C.
  3. Temporale stabilità delle nanoparticelle
    Stabilità temporale delle nanoparticelle è misurata utilizzando light scattering dinamico come segue:
    1. Valutare la stabilità di nanoparticelle misurando le dimensioni delle nanoparticelle in acqua DI nonché Modified Dulbecco Piano di Eagle (DMEM) come descritto nella sezione 3.1.
    2. Ripetere le misure di formato in acqua deionizzata e DMEM / die per un periodo di 5 giorni.

4. citotossicità delle nanoparticelle

La citotossicità delle nanoparticelle è misurata utilizzando un saggio di proliferazione cellulare XTT come segue:

  1. Seed 10.000-15.000 cellule / e di ogni tipo di cellula studiati (Neuro2a, BSG D10, EoL-1, e OE21) in una piastra da 96 pozzetti. Assicurarsi che il volume totale di cellule seminate non all'eXceed 0,2 ml / pozzetto. Incubare le cellule seminati durante la notte a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. Come contattare nanoparticelle con le cellule:
    1. Incubare le cellule con concentrazioni variabili di nanoparticelle (0,01-0,5 mg / ml). Fare riferimento alla Tabella 1 come tavola rappresentativo che descrive la quantità di nanoparticelle (in 50 microlitri) aggiunto alle cellule dopo aver rimosso 50 ml di mezzo / pozzetto.
      1. Per tenere conto di qualsiasi assorbanza interferenza delle nanoparticelle all'interno del dosaggio, aggiungere un bianco costituito concentrazione appropriata di nanoparticelle (0-0,5 mg / ml, in equivalenza importi aggiunti alle cellule) a mezzo senza cellule.
    2. Incubare le cellule con nanoparticelle notte a 37 ° C e 5% di CO 2. Aspirare il terreno da ogni bene e sciacquare con tampone colorazione composto da 5% di siero fetale bovino (FBS) in soluzione tampone fosfato (PBS). Aggiungere 100 pl di media senza rosso fenolo e incubare a 37 ° C e 5% CO 2per 16-18 ore.
  3. Preparare la soluzione di lavoro XTT cellulare proliferazione Assay mescolando i componenti del kit (XTT reagenti e XTT Activator) secondo le specifiche del produttore. Aspirare il supporto dai pozzetti e aggiungere 100 ml di RPMI (RPMI w / o fenolo rossi + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) o mezzo appropriato per il tipo di cella studiata. Aggiungere 50 ml di soluzione di lavoro XTT a ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 2-2,5 ore.
  4. Misurare l'assorbanza a 490 nm, con una lunghezza d'onda di riferimento di 630 nm per correggere le impronte digitali o macchie. Calcolare l'assorbanza corretta per ogni pozzetto (A 490 -A 630) e la media dei valori per i replicati.
  5. Sottrarre le letture vuote di ogni valore e per calcolare i valori finali di assorbanza corretti. Calcolare la percentuale di sopravvivenza per ogni campione normalizzando il assorbanza corretta finale a quello delle cellule non trattate senza nanoparticelle. Trama survival percentuale in funzione della concentrazione di nanoparticelle.

5. MRI relassività dei PN PB, GdPB, e MnPB

Relassività MRI è misurata con T 1 - e T 2 pesate sequenze di preparazione di un "fantasma" MRI utilizzando una piastra a 96 pozzetti contenenti nanoparticelle come descritto di seguito:

  1. Phantom Preparazione
    1. Preparare una piastra a 96 pozzetti con ogni ben contenenti nanoparticelle 100 microlitri (PB NPS GdPB o MnPB) alla concentrazione adeguata. Cominciando con una concentrazione di 0,4 mM per ogni tipo di nanoparticelle, serialmente diluire le nanoparticelle 2 × con acqua deionizzata fino a concentrazione di 2,4 × 10 -5 M è raggiunto (questo richiede 14 diluizioni e 15 pozzetti).
    2. Aggiungere 100 ml di soluzione di agarosio fuso 1% in acqua deionizzata in ogni pozzetto e mescolare bene. Lasciare il gel solidificare a 4 ° C per 12 ore.
      NOTA: Questo produce un fantasma contenente diluizioni seriali dile nanoparticelle in agarosio solidificata.
    3. Posizionare il fantasma in orizzontale 3 T magnete clinica sotto un blocco solido di 2% agar (150 cm 3). Fissare la phantom e blocco di agar nel centro di una bobina di cervello HD 8 canali. Misurare tempi di rilassamento con 0,5 millimetri di spessore fette coronali a metà altezza della piastra a 96 pozzetti 11.
  2. T 1 - e T 2 pesate Sequenze
    Utilizzare le seguenti impostazioni rappresentativi per acquisire le sequenze nel magnete clinica.
    NOTA: Questi valori sono ottimizzati per le nanoparticelle utilizzati in questo studio:
    1. Acquisire T 1 pesate immagini (T1W) MR utilizzando la seguente FLAIR (FLAIR) sequenza: Echo treno (ET) = 8, tempo di ripetizione (TR) = 2.300 msec, tempo di Echo (TE) = 24,4 msec, dimensioni Matrix = 512 x 224, Campo visivo (FOV) = 16 x 16 cm 2.
    2. Acquisire T 2 pesate immagini (T2W) MR utilizzando il seguente Relaxa velocezione rapida sequenza spin echo (FRFSE): ET = 21; TR = 3.500 msec; TE = 104 msec; Size = Matrice 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm 2.
    3. Acquisire T1W e T2W MR immagini a 127 MHz (3 T) con i seguenti orari di inversione: 50, 177, 432, 942, 1.961, e 4.000 msec.
  3. Misurare le relassività MRI
    1. Dopo aver acquisito T1W e T2w immagini utilizzando le sequenze descritte nella sezione 5.2, misurare l'intensità del segnale per ciascun pozzetto utilizzando ImageJ, d'ora in poi designata come regione di interesse (ROI) selezionando ogni ROI utilizzando il pulsante raccolto ovale trova sulla barra degli strumenti principale, quindi selezionando Analizza> Misura.
      NOTA: Un pop-up dovrebbe visualizzare l'intensità del segnale media di ciascun ROI sotto la colonna "Media".
    2. Per ogni ROI, tracciare l'intensità del segnale misurata contro il suo tempo di inversione specifico. Se necessario, i punti di inversione (letture) che generano una "bolla" iniziale o valori anomali all'inizio della trama (inversione inferiorevolte).
      NOTA: Queste letture sono generati a volte bassi inversione perché MRI misura il valore grandezza o assoluta delle immagini, piuttosto che il loro valore reale (negativo), che deve essere rappresentato / corretto per 19.
    3. Preparare una misura esponenziale per ogni appezzamento di intensità del segnale per il ROI (SI) vs. volte inversione (T I), come descritto nella sezione 5.2. Plot T I sulla asse x, SI sul y; ɑ e Δ sono costanti determinate da una regressione, e T 1 o T 2 è la variabile da risolvere:
      figure-protocol-13390
      in cui t = T 1, T 2.
    4. Risolvere per T 1 o T 2 usando l'equazione di cui sopra e tracciare l'inverso dei valori calcolati (1 / T 1 e 1 / T 2) contro le concentrazioni delle nanoparticelle utilizzati in ogni ROI.
    5. Calcolare la pendenza del grafico lineare cheproduce la relassività r 1 e r 2.
      NOTA: La seguente sezione del protocollo descrive l'applicazione delle nanoparticelle per marcatura fluorescente e generando MRI contrasto nelle cellule bersaglio.

6. Etichettatura fluorescente di cellule bersaglio Utilizzando le nanoparticelle - Microscopia confocale

NOTA: Le nanoparticelle (NP PB, GdPB, e MnPB) può essere utilizzato per etichettare fluorescente una popolazione di cellule bersaglio (monitorati mediante microscopia confocale) come segue:

  1. Sintesi del fluorescente nanoparticelle
    1. Sintetizzare GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 per l'etichettatura fluorescente di una popolazione di cellule bersaglio seguendo i passaggi descritti nelle sezioni 1 e 2.
  2. Preparazione di cellule per fluorescenza targeting
    1. Coat no. 1,5 micro vetrini coprioggetto per immersione in una soluzione di 0,002% di poli (L-lisina) bromidrato per 90 min. Rimuovere i vetrini dalla soluzione e lasciarli asciugare per 24 ore.
    2. Semi le cellule (ad es EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) sui vetrini coprioggetto rivestiti collocati in una piastra da 6 pozzetti e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per almeno 16 ore. Risciacquare le cellule con una soluzione 1 × PBS e (opzionale) fissare con 10% di formaldeide in soluzione tampone neutro per 15 min. Macchia cellule con 5 mM rosso-arancio colorante cellule permeanti in PBS a 37 ° C per 30 min. Successivamente, lavare le cellule con PBS.
  3. > Etichettatura fluorescente di cellule bersaglio
    1. Aggiungere 1% di albumina sierica bovina (BSA; in acqua DI) alle cellule per minimizzare legame non specifico sulle cellule, e incubare a 37 ° C per 1 ora.
    2. Incubare le cellule con le nanoparticelle in 1% BSA per 1 ora. Per EoL-1: incubare con 0,2 mg / ml GdPB-A488 o GdPB-A488-Eot3; Per BSG D10 e SUDIPG1: incubare con 0,2 mg / ml MnPB-A488 o MnPB-A488-ANG2. Lavare le cellule con PBS 3 × per rimuovere unbounanoparticelle nd.
    3. Invertire con cautela il vetro di copertura (contenente cellule e nanoparticelle) su un vetrino da microscopio, assicurando che non ci siano bolle d'aria intrappolate. Sigillare il bordo tra il vetro di copertura e vetrino da microscopio applicando accuratamente smalto trasparente. Immagine le cellule utilizzando un microscopio confocale a scansione laser.

7. Etichettatura fluorescente di cellule bersaglio Utilizzando le nanoparticelle - Citometria a flusso

Le nanoparticelle (PB NP, GdPB, e MnPB) possono essere utilizzati per l'etichetta fluorescente una popolazione di cellule bersaglio (monitorato mediante citometria di flusso) come segue:

  1. Preparare sospensioni delle cellule presi di mira in PBS. Per gli studi di coltura pura, le sospensioni sono costituite da un unico tipo di cellule (ad esempio BSG D10); risospendere il pellet cellulare delle cellule D10 BSG in PBS a 100.000 cellule / ml (10 ml in totale). Per gli studi di coltura mista, le sospensioni sono costituiti da almeno due tipi di cellule (ad esempio EoL-1 e OE21); simile a BSG D10, pellet cellulari risospendere di EoL-1 e OE21 in PBS a 100.000 cellule / ml ciascuna (totale 10 ml).
    1. Preparare diversi rapporti di EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml ciascuna di EoL-1 e OE21), 1: 3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
  2. Bloccare le cellule (sospensioni pure e miste) nel mirino di nanoparticelle con 2 ml di 5% BSA per ridurre al minimo legame non specifico.
  3. Aggiungere 1 ml (1 mg / ml) nanoparticelle alle cellule e incubare per 1 ora. Per BSG D10, incubare cellule con MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticorpo di controllo), o MnPB-A488-ANG2). Per le miscele di EoL-1 e OE21, incubare le miscele con un importo fisso di GdPB-A488-Eot3.
  4. Lavare le celle libere di nanoparticelle non legate riducendo la velocità dei campioni a 1.000 × g per 5 minuti almeno 3 × per rimuovere le particelle non legate. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS e fissare con il 10% di formaldeide in PBS. Cellule Macchia di incubazione con 10 mg / ml7-Aminoactinomytcin D in PBS in ghiaccio per 30 min. Risciacquare con PBS, quindi analizzare 10.000 cellule gated da ogni campione utilizzando un citofluorimetro.

8. Generazione MRI contrasto su cellule bersaglio Utilizzando le nanoparticelle

Le nanoparticelle (PB NPS GdPB e MnPB) possono essere utilizzati per generare contrasto MRI (in entrambe T 1 - e T 2 pesate sequenze) in una popolazione di cellule bersaglio come segue:

  1. Phantom Preparazione
    1. Crescere cellule (ad esempio BSG D10) in fusti T75 fino ~ 80% di confluenza. Usare appropriate medio e condizioni di crescita. Per BSG D10, crescere le cellule in DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep a 37 ° C e 5% CO 2.
    2. Risciacquare le cellule libera di media con 5 ml di PBS e bloccare le cellule con 5 ml di 1% BSA in PBS per 1 ora per minimizzare legame non specifico. Aggiungere 5 ml (0,5 mg / ml) nanoparticelle alle cellule. Per BSG D10, incubare le cellule con MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticorpo di controllo), e MnPB-A488-ANG2 per 1 ora.
    3. Lavare le cellule 3 × con 5 ml di PBS per rimuovere le nanoparticelle non legate. Trypsinize le cellule incubando le cellule con 2 ml di tripsina EDTA soluzione 0,25% 1 × per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2 per staccarle dalla muffola per la preparazione phantom. Aggiungere 8 ml di DMEM per placare la tripsinizzazione delle cellule.
    4. Raccogliere le cellule da essi centrifugazione a 1000 xg per 5 min; Aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS e aggiungere 1 ml di formaldeide al 10% in PBS per fissare le cellule. Aggiungere 100 pl di ciascun campione di un pozzo separata di una piastra a 96 pozzetti.
    5. Aggiungere 100 ml di soluzione di agarosio fuso 1% in acqua deionizzata in ogni pozzetto e mescolare bene pipettando su e giù. Lasciare il gel solidificare a 4 ° C per 12 ore.
      NOTA: Questo produce un fantasma che contiene cellule con nanoparticelle attaccate in agarosio solidificato.
    6. Posizionare il fantasma in orizzontale 3 T magnete clinica accanto a un blocco solido di 2% agar (150 cm 3). Fissare la phantom e blocco di agar nel centro di una bobina di cervello HD 8 canali. Misurare tempi di rilassamento con 0,5 mm di spessore fette coronali a metà altezza della piastra a 96 pozzetti 11.
  2. T 1 - e T 2 pesate Sequenze
    Utilizzare le seguenti impostazioni per acquisire le sequenze nel magnete MRI clinica:
    1. Acquisire le immagini T1W RM con la seguente rotazione echo: Echo treno (ET) = 1, tempo di ripetizione (TR) = 650 msec, tempo di Echo (TE) = 11 msec, dimensione Matrix = 320 x 256, Campo visivo (FOV) = 10 x 10 cm 2.
    2. Acquisire le immagini T2W RM utilizzando la seguente sequenza FRFSE: ET = 28; TR = 3.000 msec; TE = 101 msec; Size = Matrice 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm 2.
  3. Post-acquisizione Processing
    1. Per facilitare la lettura, convertire le immagini in scala di grigi originali in un'immagine scala di colori utilizzando ImageJ: Selezionare Immagine> Tipo> 8-Bit, per convertire l'immagine in scala di grigi.
    2. Calcolare l'intensità normalizzata per ciascun campione dopo aver sottratto il contributo del segnale dalla soluzione di agarosio.

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Risultati

Utilizzando lo schema di sintesi one-pot, nanoparticelle di PB NP (diametro medio 78,8 nm, indice di polidispersità (PDI) = 0,230, calcolato dallo strumento dynamic light scattering), GdPB (diametro medio 164,2 nm, PDI = 0,102), o MnPB ( diametro medio 122,4 nm, PDI = 0.124) che sono monodisperse (misurata dal DLS) può essere sintetizzato in modo coerente (Figura 2A). I potenziali zeta misurati sui nanoparticelle sintetizzati sono inferiori a -30 mV (Figura 2B), indicando moderata sta...

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Discussione

Questo articolo ha presentato i metodi per la sintesi di una nuova classe di agenti di imaging multimodali, molecolari basati su biofunctionalized Prussia nanoparticelle blu. Le modalità di imaging molecolare incorporati nelle nanoparticelle sono imaging di fluorescenza e la risonanza magnetica molecolare, a causa delle loro caratteristiche complementari. Le nanoparticelle di Prussia blu biofunctionalized hanno un design core-shell. I passaggi chiave nella sintesi di queste nanoparticelle sono: 1) one-pot sintesi che p...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O)Sigma-AldrichP9387
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)Sigma-Aldrich221279
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O)Sigma-Aldrich211591
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)Sigma-Aldrich236489
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate AntibodyMilliporeAB5320
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3Peprotech500-P156GBT
Neuro-2a Cell LineATCCCCL-131
BSG D10 Cell LineLab stock---
OE21 Cell LineSigma-Aldrich96062201
SUDIPG1 NeurospheresLab stock---
Eol-1 Cell LineSigma-Aldrich94042252
Poly(L-lysine) hydrobromideSigma-AldrichP1399
FormaldehydeSigma-AldrichF8775
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
Aminoactinomycin DSigma-AldrichA9400
Triton X-100Sigma-AldrichX100
CellTrace Calcein Red-Orange, AMLife TechnologiesC34851
Avidin-Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21370
CentrifugeEppendorf5424
Peristaltic PumpInstechP270
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600
SonicatorQSonicaQ125
Hot Plate/Magnetic StirrerVWR97042-642
Ultra Clean Aluminum FoilVWR89107-732
Vortex MixerVWR58816-121
1.7 ml conical microcentrifuge tubesVWR87003-295
15 ml conical centrifuge tubesVWR21008-918
Tube holdersVWR82024-342
Disposable plastic cuvettesVWR7000-590 (/586)
Zetasizer capillary cellVWRDTS1070
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin columnVWR82031-356
96-well cell culture trayVWR29442-056
Trypsin EDTA 0.25% solution 1xJR Scientific82702
Cell Culture Grade PBS (1x)Life Technologies10010023
XTT Cell Proliferation Assay KitTrevigen4891-025-K
T75 Flask89092-700VWR
Dulbecco's Modified Eagle's MediumBiowhitaker12-604Q
Fetal Bovine SerumLife Technologies10437-010
Pen-Strep 1xLife Technologies15070063
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning MicroscopeOlympusFV1200
Chambered Microscope SlidesThermo Scientific154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5VWR48366-227
Microscope SlidesVWR16004-368
RPMISigma-AldrichR8758 
AgaroseSigma-AldrichA9539 
FACSCalibur Flow CytometerBD Biosciences
3 T Clinical MRI MagnetGE Healthcare
100 ml round-bottom flask

Riferimenti

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  11. Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
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