Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

Summary

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Abstract

Multimodal, הדמיה מולקולרית מאפשרת ההדמיה של תהליכים ביולוגיים ברזולוציות סלולריות, subcellular, ורמה-המולקולרית תוך שימוש בטכניקות הדמיה מרובות, משלימים. סוכני הדמיה אלה להקל על ההערכה של מסלולים ומנגנוני in vivo, אשר משפרים את יעילות שני האבחון וטיפול בזמן אמת. מאמר זה מציג את הפרוטוקול לסינתזה של חלקיקים כחולים פרוסים biofunctionalized (NPS PB) - כיתת רומן של סוכנים לשימוש ביישומי ההדמיה multimodal, מולקולריים. יש שיטות ההדמיה התאגדו בחלקיקים, ההדמיה הקרינה והדמיה בתהודה מגנטית (MRI), תכונות משלימות. הצירופים וPB יש עיצוב ליבה-פגז שבי גדוליניום ויונים מנגן שולבו בתוך חללי ביניים של סריג PB ליצור ניגוד MRI, שניהם בT ₁ ו- T _{2-משוקלל} רצפים. הצירופים וPB מצופים בavidin ניאון באמצעות אלקטרוסטטי עצמית כsembly, המאפשר הדמיה הקרינה. חלקיקים מצופים avidin משתנים עם ligands biotinylated שמקנה יכולות מיקוד מולקולריות לחלקיקים. היציבות והרעילות של חלקיקים נמדדות, כמו גם relaxivities MRI שלהם. יכולות multimodal, מולקולרי ההדמיה של הצירופים וPB biofunctionalized אלה לאחר מכן הפגינו באמצעות אותם לקרינת הדמיה ו- MRI המולקולרי במבחנה.

Introduction

הדמיה מולקולרית היא ההדמיה לא פולשנית וממוקדת של תהליכים ביולוגיים בסלולרי, subcellular, ורמות מולקולריות ^1. הדמיה מולקולרית מאפשרת דגימה להישאר במייקרו-הסביבה המקורית שלו בזמן שמסלולי אנדוגני ומנגנונים מוערכים בזמן אמת. בדרך כלל, הדמיה מולקולרית כרוכה ממשל סוכן הדמיה אקסוגניים בצורה של מולקולה, מקרומולקולה, או ננו-חלקיקים קטנים כדי להמחיש, יעד, ואת עקבות תהליכים פיסיולוגיים רלוונטיים של נחקרים ^2. שיטות ההדמיה השונות שנחקרו בהדמיה מולקולרית כוללות MRI, CT, PET, SPECT, אולטרסאונד, photoacoustics, ספקטרוסקופיית ראמאן, פליטת אור, הקרינה, ומיקרוסקופיה intravital ^3. ההדמיה Multimodal היא השילוב של שתיים או יותר שיטות הדמיה שבו השילוב משפר את היכולת לדמיין ולאפיין תהליכים ביולוגיים ואירועים שונים ^4. Multimodaההדמיה l מנצלת את נקודות החוזק של טכניקות הדמיה פרט, תוך מתן פיצוי בגין המגבלות האישיות שלהם ^3.

מאמר זה מציג את הפרוטוקול לסינתזה של חלקיקים כחולים פרוסים biofunctionalized (NPS PB) - כיתת רומן של סוכני הדמיה multimodal, מולקולריים. הצירופים וPB משמשים להדמית הקרינה וMRI המולקולרי. PB הוא פיגמנט הכולל לסירוגין ברזל (II) וברזל (III) אטומים ברשת מעוקב במרכז הפנים (איור 1). סריג PB מורכב מligands ציאניד ליניארי בFe ^II - CN - הצמדת Fe ^III המשלבת קטיונים לאזן חיובים בתוך הרשת תלת-ממדית שלה ^5. היכולת של PB לשלב קטיונים לתוך הסריג שלו מנוצלת על ידי בנפרד טעינת גדוליניום ויונים מנגן לצירופים וPB לניגוד MRI.

הרציונל לרודף עיצוב ננו-חלקיקים לניגוד MRI בגלליתרונות עיצוב זה מציע ביחס לסוכנים בניגוד MRI הנוכחיים. רובם המכריע של סוכנים בניגוד MRI אישרו ה- FDA האמריקאי הם chelates גדוליניום שפאראמגנטיים בטבע ומספק ניגוד חיובי על ידי ^6,7,8 מנגנון ההרפיה הספין-סריג. בהשוואה לגדוליניום-chelate יחיד המספק עוצמת אות נמוכה בכוחות עצמו, השילוב של גדוליניום יונים מרובים בסריג PB של חלקיקים מספק משופר עוצמת אות (בניגוד חיובי) ^3,9. יתר על כן, הנוכחות של יוני גדוליניום מרובים בתוך סריג PB מגדילה את צפיפות הספין הכוללת וסדר הגודל של פרא-מגנטיויות של חלקיקים, אשר מפריע לשדה המגנטי המקומי בסביבתו, ובכך לייצר ניגוד שלילי על ידי מנגנון ההרפיה ספין-ספין. כך חלקיקים המכיל גדוליניום לתפקד גם כT ₁ (חיובי) ו- T ₂ סוכנים בניגוד (שלילי) ^10,11.

בתת-קבוצה של חולים עם הפרעות בתפקוד הכליתי, הממשל של סוכנים בניגוד מבוסס גדוליניום נקשר להתפתחות של סיסטיק nephrogenic המערכתי ^{8,12, 13.} תצפית זו גרמה חקירות השימוש ביוני פאראמגנטיים חלופיים כסוכנים בניגוד ל MRI. לכן, עיצוב הרב-תכליתי של חלקיקים מותאם לשלב יונים מנגן בתוך סריג PB. בדומה לגדוליניום-chelates, מנגן-chelates גם פאראמגנטיים ומשמשים בדרך כלל כדי לספק עוצמת אות חיובית בMRI ^7,14. כמו בצירופים וPB המכיל גדוליניום, הצירופים וPB המכיל מנגן גם לתפקד כT ₁ (חיובי) ו- T ₂ סוכנים בניגוד (שלילי).

לשלב יכולות הדמיה הקרינה, "הליבות" ננו-החלקיקים מצופות בקליפה "biofunctional" בהיקף של avidin גליקופרוטאין fluorescently שכותרתו (איור 1). Avidin לא רק מאפשר הדמיה הקרינה, אך משמש גם כפלטפורמת עגינה לligands biotinylated כי יעד תאים ורקמות ספציפיים. אג"ח avidin ביוטין הוא אחד מהקשרים החזקים ביותר הידועים, שאינם קוולנטיים המאופיין בזיקה מחייבת חזקה מאוד בין avidin וביוטין ^15. הקובץ המצורף של ligands biotinylated למצופי avidin PB הצירופים ומקנה יכולות מיקוד מולקולריות לצירופים וPB.

המוטיבציה לרודף ההדמיה הקרינה וMR באמצעות PB צירופים ובגלל שיטות ההדמיה האלה יש תכונות משלימות. הדמיה הקרינה היא אחת טכניקות ההדמיה הנפוצות ביותר האופטית מולקולריות, ומאפשרת ההדמיה בו זמנית של מספר אובייקטים ברגישויות גבוהות ^1,16,17. הדמיה הקרינה היא שיטה בטוחה, לא פולשנית, אך קשורה למעמקים נמוכים של חדירה והחלטות מרחביות ^1,3,16. מצד השני, MRI מייצר זמני גבוההרזולוציה מרחבית ד הלא פולשני וללא צורך בקרינה מייננת ^1,3,16. עם זאת MRI סובל מרגישות נמוכה. לכן הדמיה הקרינה וMRI נבחרו כטכניקות הדמיה מולקולריות בשל התכונות המשלימות שלהם חדיר לעומק, רגישות, ורזולוציה מרחבית.

מאמר זה מציג את הפרוטוקול לסינתזה וbiofunctionalization של הצירופים וPB, PB צירופים ו( GdPB), ומכיל גדוליניום PB צירופים ו( MnPB) ^10,11 המכיל מנגן. השיטות הבאות מתוארות: 1) מדידה של גודל, אחראי, ויציבות זמנית של חלקיקים, 2) הערכה של cytotoxicity של חלקיקים, 3) מדידת relaxivities MRI, ו- 4) שימוש בננו-חלקיקים לקרינה והדמיה מולקולרית MR אוכלוסייה של תאים ממוקדים במבחנה. תוצאות אלו מראות את הפוטנציאל של הצירופים ולשימוש כסוכני multimodal, מולקולרי הדמיה in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. סינתזה של PB צירופים ו, ​​GdPB, וMnPB

סינתזה של ננו-החלקיקים (PB צירופים ו, ​​GdPB, או MnPB) מושגת באמצעות ערכת סינתזה בסיר אחד על ידי ביצוע הצעדים המפורטים להלן:

1. הכן את הפתרון '' המכיל 5 מיליליטר של 5 hexacyanoferrate אשלגן מ"מ (II) במים ללא יונים (DI). בהתאם לסוג של ננו-חלקיקים שמסונתזים - צירופים וPB, GdPB, או MnPB, להכין פתרון 'B' כדלקמן:
   1. ל PB צירופים ו: להכין 10 מיליליטר של תמיסה המכילה 2.5 מ"מ ברזל כלוריד (III) במי DI.
   2. לGdPB צירופים ו: להכין 10 מיליליטר של תמיסה המכילה 2.5 מ"מ כל אחד מגדוליניום (III) חנקתי וברזל (III) כלוריד במי DI
   3. לMnPB צירופים ו: להכין 10 מיליליטר של תמיסה המכילה 2.5 מ"מ כל אחד ממנגן כלוריד וברזל כלוריד (II) (III) במי DI.
2. הוסף 'B' פתרון לבקבוק מסביב לתחתית, ומערבבים את תכולת הבקבוק בטמפרטורת חדר (RT) ו1,000 סל"ד. הוסף פתרון '' טיפה חכמה ל'B 'הבקבוק המכיל פתרון מסביב לתחתית. לשלוט על קצב הזרימה לתוספת של פתרון '' ל 'ב' על ידי משאבת peristaltic להגדיר לוותר כ 10 מיליליטר / שעה.
3. ממשיך לבחוש ב 1000 סל"ד ב RT עבור 30 דקות נוספות לאחר התוספת של פתרון '' ל 'B' הוא מלא. תפסיק לבחוש ולאסוף את התערובת.
4. העבר את aliquots של התערובת לתוך צינורות microcentrifuge כדי לשטוף את חלקיקים חופשיים של רכיבי unreacted. הוסף 5 M NaCl (0.2 מיליליטר NaCl / תערובת תגובת מיליליטר) לכל aliquot לסייע באיסוף חלקיקים על ידי צנטריפוגה.
5. צנטריפוגה כל aliquot של חלקיקים במשך לפחות 10 דקות ב20,000 × g. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את supernatant.
6. Resuspend כל גלולה ננו-חלקיקים במי DI 1 מיליליטר באמצעות sonication באמצעות microtip (דופק sonication / כיבוי = 1/1 שניות, 50% = משרעת, משך =5 שניות, דירוג = 125 W כוח sonicator) כדי לשבור את גלולה.
7. חזור על שלבים 1.4-1.6 לפחות 3 × כדי להבטיח שהחלקיקים חופשיים של רכיבים של תוצרי לוואי תגובה ותגובה הראשוניים. לאחר צנטריפוגה הסופית, resuspend חלקיקים במי DI 1 מיליליטר.

2. Biofunctionalization של PB צירופים ו, ​​GdPB, וMnPB

Biofunctionalization של חלקיקים כרוכים ציפוי של "ליבות" ננו-חלקיקים עם avidin והוספת ligands biotinylated כמפורט להלן:

1. ציפוי של החלקיקים עם פלורסנט avidin
   ציפוי של חלקיקים עם avidin הניאון מושגת באמצעות הרכבה עצמית אלקטרוסטטי בי מטען חשמלי חיובי avidin (PI ~ 10.5) מצופה לחלקיקים טעונים שלילי כדלקמן ^18:
   1. הכן השעיות של הצירופים וPB, GdPB, או MnPB במי DI 1 מיליליטר. סנן אלקסה פלואוריד 488 שכותרתו avidin (A488; מחדש במי DI)דרך מסנן microcentrifuge ניילון 0.2 מיקרומטר ב× גרם 14,000 למשך 10 דקות. להוסיף ≤0.2 מ"ג חלקיקי avidin / מ"ג. הוסף כל aliquot המסונן של A488 בנפרד לaliquots של PB צירופים ו, ​​GdPB, או MnPB.
   2. צור חלקיקים עם A488 עבור שעות 2-4 עם רעד או סיבוב עדין על 4 מעלות צלזיוס. להגן על הדגימות מן האור באמצעות רדיד אלומיניום.
      הערה: A488 תשואות שלב זה מצופה PB צירופים ו( PB-A488), GdPB (GdPB-A488), וMnPB (MnPB-A488).
2. קובץ מצורף של הנוגדנים Biotinylated
   קובץ מצורף של biotinylated נוגדני מיקוד על חלקיקים מצופים avidin מושגת באמצעות אינטראקציות avidin ביוטין כדלקמן:
   1. הכן השעיות של חלקיקי avidin מצופה - PB-A488, GdPB-A488, וMnPB-A488 במי DI 1 מיליליטר. סנן נוגדן biotinylated (כפי שסופק על ידי היצרן) דרך מסנן microcentrifuge 0.2 מיקרומטר ניילון ב 14,000 × גרם במשך 10 דקות.
      הערה: הנה, המחקר הנוכחי משתמש בביוinylated אנטי-נוירון, גליה אנטיגן 2 (ANG2) שמכוון NG2 ביטוי יתר בתאים ורקמות של מערכת העצבים המרכזית וbiotinylated eotaxin-3 אנטי-אנושי (Eot3) שמכוון קולטנים ביטוי יתר על אאוזינופילים או שורות תאי eosinophilic.
   2. הוסף כל aliquot המסונן של נוגדן biotinylated בנפרד לaliquots של חלקיקים מצופים avidin. הוספת חלקיקי נוגדן מצופה avidin / מ"ג biotinylated ≤0.05 מ"ג. צור חלקיקים מצופים avidin עם נוגדני biotinylated (ANG2 או Eot3) במשך 2-4 שעות עם רעד עדין או סיבוב על 4 מעלות צלזיוס. להגן על הדגימות מן האור באמצעות רדיד אלומיניום.
      הערה: נוגדן תשואות שלב זה חלקיקים מצופים (למשל GdPB-A488-Eot3 וMnPB-A488-ANG2).

3. מדידות, פוטנציאל זטה, וTemporal יציבות של החלקיקים

התפלגות הגודל, האחראי, והיציבות של חלקיקים נמדדו באמצעות דינמיפיזור אור שיטות (DLS) כמפורט להלן:

1. שינוי הגודל של החלקיקים
   שינוי הגודל של חלקיקים מושגת באמצעות פיזור אור דינאמי כדלקמן:
   1. הוסף 10 μl של מדגם ננו-החלקיקים (1 מ"ג / מיליליטר) עד 990 μl מים DI בקובט פלסטיק חד פעמי.
      שים לב: זה ערך נציג לאות DLS טוב.
   2. מכסה את קובט ומערבולת לערבב היטב. מניחים את קובט במערכת המשמשת לניתוח גודל חלקיקים על מנת למדוד את גודל חלקיקים. לבצע ניתוח גודל חלקיקים בזווית מדידה של 173 מעלות.
2. פוטנציאל זטה של ​​החלקיקים
   פוטנציאל זטה של ​​חלקיקים נמדד באמצעות פיזור ניתוח שלב אור כדלקמן:
   1. הוספה של מדגם ננו-החלקיקים (1 מ"ג / מיליליטר) עד 900 μl מים DI 100 μl בתא נימי פלסטיק חד פעמי. ערך זה הוא נציג למדידת פוטנציאל זטה טובה.
   2. הנח את קַפִּילָארתא y במערכת המשמשת לניתוח פוטנציאל זטה כדי למדוד את פוטנציאל זטה של ​​חלקיקים באמצעות פרמטרים של ברירת מחדל של 25 מעלות צלזיוס.
3. יציבות זמנית של החלקיקים
   יציבות זמנית של חלקיקים נמדדה באמצעות פיזור אור דינאמי כדלקמן:
   1. להעריך את היציבות של חלקיקים על ידי מדידת הגדלים של חלקיקים במי DI כמו גם בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) כמפורט בסעיף 3.1.
   2. חזור על מדידות גודל במי DI וDMEM פעם / יום על פני תקופה של 5 ימים.

4. Cytotoxicity של החלקיקים

Cytotoxicity של חלקיקים נמדד באמצעות assay התפשטות תאי XTT כדלקמן:

1. תאי זרע 10,000-15,000 / טוב של כל סוג תא למדו (Neuro2a, BSG D10, EoL-1, וOE21) בצלחת 96-היטב. ודא שהנפח הכולל של תאי זרע אינו דוארXceed 0.2 מיליליטר / טוב. דגירה תאי זרע הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. יצירת קשר עם חלקיקים עם התאים:
   1. דגירה התאים עם ריכוזים שונים של ננו-חלקיקים (0.01-0.5 מ"ג / מיליליטר). עיין בטבלת 1 כטבלת נציג המתארת ​​את הכמויות של חלקיקים (50 μl) הוסיף לתאים לאחר הסרת 50 μl של מדיום / טוב.
      1. כדי להסביר את כל ספיגת להתערב של חלקיקים בתוך assay, להוסיף ריק בהיקף של הריכוז המתאים של חלקיקים (0-.5 מ"ג / מיליליטר; בשקילות לסכומים נוספים לתאים) לבינוניים ללא תאים.
   2. דגירה תאים עם חלקיקי הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. תקשורת לשאוב מכל טוב ולשטוף עם החיץ מכתים המורכב של 5% בסרום שור עוברי (FBS) בפתרון פוספט שנאגרו (PBS). הוספה של תקשורת 100 μl ללא פנול אדום ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ל16-18 שעות.
3. הכן את הפתרון למניעת הפצת הנשק Assay הנייד XTT עובד על ידי ערבוב מרכיבי ערכה (XTT מגיב וXTT Activator) לפי המפרט של היצרן. לשאוב את התקשורת מהבארות ולהוסיף של RPMI 100 μl (RPMI w / o פנול FBS האדום + 10% + 1 × פן-דלקת) או בינוני מתאימה לסוג התא למד. הוסף 50 μl של פתרון עובד XTT היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ל2-2.5 שעות.
4. מדוד את הספיגה ב 490 ננומטר, עם אורך גל של 630 ננומטר התייחסות לתיקון לטביעות אצבעות או כתמים. לחשב את הספיגה המתוקנת לכל טוב ₍₄₉₀ -A ₆₃₀₎ וממוצע הקריאות למשכפל.
5. הפחת את הקריאות ריקות מכל ערך ולחשב את ערכי הספיגה המתוקנות הסופיים. לחשב את אחוז ההישרדות לכל דגימה על ידי נרמול הספיגה המתוקנת הסופית לזה של תאים שלא טופלו ללא חלקיקים. העלילה suאחוז rvival כפונקציה של ריכוז ננו-חלקיקים.

5. MRI Relaxivities של הצירופים וPB, GdPB, וMnPB

relaxivity MRI נמדד באמצעות T ₁ - וT _{2-משוקלל} רצפים על ידי הכנת "פנטום" באמצעות ה- MRI צלחת 96-היטב המכילה חלקיקים כמפורט להלן:

1. פנטום הכנה
   1. הכן צלחת 96-היטב עם כל חלקיקים המכילים גם 100 μl (PB צירופים ו, ​​GdPB, או MnPB) בריכוז המתאים. החל בריכוז של 0.4 מ"מ לכל סוג של ננו-חלקיקים, סדרנו לדלל את חלקיקי 2 × שימוש במי DI עד ריכוז של 2.4 × 10 ^-5 M הוא הגיע (זה דורש 14 דילולים ו -15 בארות).
   2. הוספה של 1% פתרון agarose מותך במי DI 100 μl היטב לתוך כל אחד ומערבבים היטב. לאפשר ג'ל לבסס על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 12.
      הערה: זה מניב פנטום מכיל דילולים סדרתי שלחלקיקים בagarose הקרושה.
   3. הנח את הפנטום במגנט קליני T אופקי 3 תחת גוש מוצק של אגר 2% (150 סנטימטר ^3). אבטח את הפנטום ובלוק של אגר בתוך מרכז סליל מוח ערוץ 8-HD. למדוד פעמים הרפיה באמצעות פרוסות עבות העטרה 0.5 מ"מ באמצע הגובה-של הצלחת 96-היטב ^11.
2. ₁ T - וT ₂ רצפים משוקללים
   השתמש בהגדרות הנציג הבאות לרכישת הרצפים במגנט הקליני.
   הערה: ערכים אלה מותאמים לחלקיקים המשמשים במחקר הנוכחי:
   1. לרכוש T ₁ משוקלל תמונות (T1W) MR באמצעות ההתאוששות הבאה נוזל היפוך מוחלש (פלייר) רצף: Echo רכבת (ET) = 8, זמן החזרה (TR) = 2,300 אלפיות שנייה, זמן הד (TE) = 24.4 msec, גודל מטריקס = 512 x 224, שדה ראייה (FOV) = 16 x 16 סנטימטר ^2.
   2. לרכוש T _{2-משוקלל} תמונות (T2W) MR באמצעות relaxa המהיר הבארצף tion מהיר הד ספין (FRFSE): ET = 21; TR = 3500 אלפיות שניים; TE = 104 אלפיות שני; מטריקס גודל = 512 x 224; FOV = 16 x 16 סנטימטר ^2.
   3. לרכוש תמונות T1W וT2W MR ב 127 MHz (3 T) במועדי ההיפוך הבאים: 50, 177, 432, 942, 1,961, ו4,000 אלפיות שניים.
3. מדידת Relaxivities MRI
   1. לאחר רכישת תמונות T1W וT2W באמצעות הרצפים שתוארו בסעיף 5.2, למדוד את עוצמת האות עבור כל ImageJ באמצעות כן, מעתה ואילך יועדה כאזור של עניין (ROI) על ידי בחירת כל ROI באמצעות לחצן יבול הסגלגל הממוקם בסרגל הכלים הראשיים, ולאחר מכן בחירה לנתח> מדוד.
      הערה: מוקפץ צריך להציג את עוצמת האות הממוצעת של כל ROI תחת העמודה שכותרתה "Mean".
   2. לכל החזר על השקעה, עלילה עוצמת האות נמדדת נגד זמן ההיפוך הספציפי שלה. במידת צורך, נקודות היפוך (קריאה) שיוצר "בועה" ראשונית או חריגים בתחילת העלילה (היפוך נמוךפעמים).
      הערה: קריאות אלה שנוצרו בזמנים היפוך נמוכים בגלל MRI מודד את ערך הגודל או מוחלט של תמונות ולא את ערכם האמיתי (השלילי), אשר צריך להיות מטופלות / תיקן במשך ^19.
   3. הכן לנכון מעריכי עבור כל עלילה של עוצמת אות לROIs (SI) לעומת פעמים היפוך (T _I) כמפורט בסעיף 5.2. עלילת T _אני על ציר x, SI על ציר y; ɑ וΔ הם קבועים שנקבעו על ידי רגרסיה, וT ₁ או T ₂ הוא משתנה שיש לפתור:
      
      כאשר t = T _1, T _2.
   4. לפתור עבור T ₁ או T ₂ באמצעות המשוואה לעיל ולתכנן את ההופכי של הערכים מחושבים (1 / T ₁ ו 1 / T ₂₎ נגד הריכוזים של חלקיקים המשמשים בכל ROI.
   5. חשב את השיפוע של הגרף ליניארי שתשואות relaxivities r ₁ ו- R _2.
      הערה: החלק מהפרוטוקול הבא מתארת ​​את היישום של ננו-החלקיקים לתיוג ניאון וניגוד MRI יצירה בתאים ממוקדים.

6. תיוג פלורסנט של תאים ממוקדים באמצעות החלקיקים - Confocal מיקרוסקופית

הערה: חלקיקים (PB הצירופים ו, ​​GdPB, וMnPB) יכולה לשמש כדי לתייג אוכלוסייה של תאים ממוקדים (פיקוח על ידי מיקרוסקופ confocal) כדלקמן fluorescently:

1. סינתזה של חלקיקי פלורסנט
   1. לסנתז GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 לתיוג ניאון של אוכלוסייה של תאים ממוקדים על ידי ביצוע הפעולות מפורטות בסעיפי 1 ו -2.
2. הכנת תאים לקרינת מיקוד
   1. מעיל לא. 1.5 כוסות כיסוי מיקרו על ידי טבילתם בפתרון של פולי 0.002% (L ליזין) hydrobromide למשך 90 דקות. הסר את המשקפיים כיסוי מהפתרון ולאפשר להם להתייבש במשך 24 שעות.
   2. זרעי התאים (למשל EoL-1, D10 BSG, SUDIPG1) על המשקפיים הכיסוי מצופים הונחו בצלחת 6-היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ לפחות 16 שעות. יש לשטוף את התאים עם פתרון ו1 × PBS (אופציונאלי) לתקן עם פורמלדהיד 10% בפתרון חיץ ניטראלי במשך 15 דקות. תאי כתם עם צבע 5 מיקרומטר כתום-אדום תא-permeant בPBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בהמשך לכך, לשטוף תאים עם PBS.
3. > תיוג פלורסנט של תאים ממוקדים
   1. הוסף 1% אלבומין בסרום שור (BSA; במי DI) לתאים כדי למזער את הלא ספציפי מחייב את התאים, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
   2. דגירה תאים עם חלקיקים בBSA 1% עבור שעה 1. לEoL-1: דגירה עם 0.2 מ"ג / מיליליטר GdPB-A488 או GdPB-A488-Eot3; לD10 BSG וSUDIPG1: דגירה עם 0.2 מ"ג / מיליליטר MnPB-A488 או MnPB-A488-ANG2. יש לשטוף את התאים עם PBS 3 × להסיר unbouחלקיקי nd.
   3. להפוך בזהירות את מכסה הזכוכית (המכילה תאים וחלקיקים) בשקופית מיקרוסקופ, על מנת להבטיח שאין בועות אוויר שנלכדו. לאטום את הקצה שבין מכסה הזכוכית ושקופיות מיקרוסקופ על ידי היישום ברור לק בזהירות. תמונת התאים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal.

7. תיוג פלורסנט של תאים ממוקדים באמצעות החלקיקים - cytometry הזרימה

חלקיקים (PB צירופים ו, ​​GdPB, וMnPB) יכולים לשמש לתווית fluorescently אוכלוסייה של תאים ממוקדים (פיקוח על ידי הזרימה cytometry) כדלקמן:

1. השעיות להכין של התאים להיות ממוקדות בPBS. ללימודי תרבות טהורים, ההשעיות מורכבות מסוג תא בודד (D10 BSG למשל); resuspend תא גלולה של תאי D10 BSG PBS ב 100,000 תאים / מיליליטר (10 מיליליטר סה"כ). ללימודי תרבות מעורבים, ההשעיות יכללו לפחות שני סוגי תאים (למשל EoL-1 וOE21); בדומה לD10 BSG, כדורי תא גלול של EoL-1 וOE21 PBS ב 100,000 תאים / מיליליטר כל אחת (10 מיליליטר סה"כ).
   1. הכן יחסים משתנים של EoL-1: OE21 1: 0 (2 מיליליטר EoL-1), 3: 1 (1.5 מיליליטר EoL-1, 0.5 מיליליטר OE21), 1: 1 (1 מיליליטר כל אחד מEoL-1 וOE21), 1: 3 (0.5 מיליליטר EoL-1, 1.5 מיליליטר OE21), 0: 1 (2 מיליליטר OE21).
2. חסום את התאים (השעיות טהורות ומעורבות) על כוונת של חלקיקים עם 2 מיליליטר של BSA 5% כדי למזער הלא ספציפי מחייב.
3. הוסף 1 מיליליטר (1 מ"ג / מיליליטר) חלקיקים לתאי דגירה עבור שעה 1. לD10 BSG, דגירה תאים עם MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (נוגדן שליטה), או MnPB-A488-ANG2). לתערובות של EoL-1 וOE21, דגירה התערובות עם סכום קבוע של GdPB-A488-Eot3.
4. יש לשטוף את התאים חופשיים של חלקיקים מאוגד על ידי ספינינג את הדגימות ב 1000 × גרם במשך 5 דקות לפחות 3 × להסיר חלקיקים מאוגד. Resuspend תאי 1 מיליליטר PBS ולתקן עם פורמלדהיד 10% ב- PBS. תאי כתם על ידי דוגרים עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר7-Aminoactinomytcin D בPBS על קרח למשך 30 דקות. לשטוף עם PBS, ולאחר מכן לנתח 10,000 תאים מגודר מכל מדגם באמצעות cytometer זרימה.

8. ניגודיות יצירת MRI על תאים ממוקדים באמצעות החלקיקים

חלקיקים (PB הצירופים ו, GdPB, וMnPB) יכולים לשמש כדי ליצור ניגוד MRI (בשני ₁ T - וT _{2-משוקלל} רצפים) באוכלוסייה של תאים ממוקדים באופן הבא:

1. פנטום הכנה
   1. לגדל תאים (D10 BSG למשל) בצלוחיות T75 עד ~ מפגש 80%. השתמש במדיום גידול מתאים ותנאים. לD10 BSG, לגדול התאים בDMEM + 10% FBS + 1 × פן-דלקת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   2. יש לשטוף את התאים ללא בינוני עם 5 מיליליטר PBS ולחסום את התאים עם BSA 5 מיליליטר 1% בPBS עבור שעה 1 כדי למזער הלא ספציפי מחייב. הוסף 5 מיליליטר (0.5 מ"ג / מיליליטר) חלקיקים לתאים. לD10 BSG, דגירה התאים עם MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (נוגדן שליטה), וMNPB-A488-ANG2 עבור שעה 1.
   3. יש לשטוף את תאים 3 × 5 מיליליטר עם PBS להסיר חלקיקים מאוגד. Trypsinize התאים על ידי דוגרים התאים עם 2 מיליליטר פתרון 0.25% טריפסין EDTA 1 × במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ לנתק אותם מהבקבוק להכנת פנטום. הוסף 8 מיליליטר של DMEM כדי להרוות את trypsinization של תאים.
   4. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב× גרם 1,000 למשך 5 דקות; לשאוב את supernatant. Resuspend תאי 1 מיליליטר PBS ולהוסיף פורמלדהיד 1 מיליליטר של 10% ב- PBS לתקן את התאים. הוספה של כל דגימה 100 μl ולנפרד של צלחת 96-היטב.
   5. הוספה של 1% פתרון agarose מותך במי DI 100 μl היטב לתוך כל אחד ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה. לאפשר ג'ל לבסס על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 12.
      הערה: זה מניב פנטום המכיל תאים עם חלקיקים מצורפים בagarose הקרושה.
   6. הנח את הפנטום במגנט קליני T אופקי 3 בסמוך לגוש מוצק של אגר 2% (150 סנטימטרים ^{3). אבטח את הפנטום ובלוק של אגר בתוך מרכז סליל מוח ערוץ 8-HD. למדוד פעמים הרפיה באמצעות פרוסות עבות העטרה 0.5 מ"מ באמצע גובה-של צלחת 96-היטב 11.}
2. ₁ T - וT ₂ רצפים משוקללים
   השתמש בהגדרות הבאות לרכישת הרצפים במגנט MRI הקליני:
   1. לרכוש תמונות T1W MR באמצעות הרצף הבא ספין הד: הד הרכבת (ET) = 1, זמן החזרה (TR) = 650 אלפיות שנייה, זמן הד (TE) = 11 אלפיות שניות, גודל מטריקס = 320 x 256, שדה ראייה (FOV) = 10 x 10 סנטימטר ^2.
   2. לרכוש תמונות T2W MR באמצעות רצף FRFSE הבא: ET = 28; TR = 3000 אלפיות שניים; TE = 101 אלפיות שני; מטריקס גודל = 384 x 288; FOV = 10 x 10 סנטימטר ^2.
3. עיבוד פוסט-רכישה
   1. לקריאה קלה יותר, להמיר תמונות הגוניות האפורות המקוריות לתמונת סולם צבעים באמצעות ImageJ: תמונה> סוג> 8-Bit בחר, כדי להמיר את התמונה לאפור בקנה מידה.
   2. לחשב את עוצמת המנורמלת עבור כל דגימה לאחר הפחתת תרומת האות מפתרון agarose.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שימוש בערכת הסינתזה בסיר אחד, חלקיקים של PB צירופים ו( ממוצעי ננומטר 78.8 קוטר, מדד polydispersity (PDI) = 0.230; מחושבים על ידי מכשיר פיזור אור דינאמי), GdPB (כלומר קוטר 164.2 nm, PDI = 0.102), או MnPB ( אומר קוטר 122.4 nm, PDI = 0.124), כי הם monodisperse (כפי שנמדד על ידי DLS) יכול להיות מסונתז באופן עקבי (איור 2 א)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מאמר זה הציג שיטות לסינתזה של כיתת רומן של סוכני multimodal, מולקולריים הדמיה המבוססים על ננו-חלקיקים הכחולים הפרוסים biofunctionalized. שיטות ההדמיה מולקולריות שולבו בחלקיקי הקרינה הדמיה ו- MRI המולקולרי, בשל התכונות המשלימות שלהם. יש לי חלקיקים הכחולים הפרוסים biofunctionalized עיצוב לי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O)	Sigma-Aldrich	P9387
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O)	Sigma-Aldrich	211591
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Sigma-Aldrich	236489
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody	Millipore	AB5320
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3	Peprotech	500-P156GBT
Neuro-2a Cell Line	ATCC	CCL-131
BSG D10 Cell Line	Lab stock	---
OE21 Cell Line	Sigma-Aldrich	96062201
SUDIPG1 Neurospheres	Lab stock	---
Eol-1 Cell Line	Sigma-Aldrich	94042252
Poly(L-lysine) hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1399
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Aminoactinomycin D	Sigma-Aldrich	A9400
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
CellTrace Calcein Red-Orange, AM	Life Technologies	C34851
Avidin-Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21370
Centrifuge	Eppendorf	5424
Peristaltic Pump	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonicator	QSonica	Q125
Hot Plate/Magnetic Stirrer	VWR	97042-642
Ultra Clean Aluminum Foil	VWR	89107-732
Vortex Mixer	VWR	58816-121
1.7 ml conical microcentrifuge tubes	VWR	87003-295
15 ml conical centrifuge tubes	VWR	21008-918
Tube holders	VWR	82024-342
Disposable plastic cuvettes	VWR	7000-590 (/586)
Zetasizer capillary cell	VWR	DTS1070
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column	VWR	82031-356
96-well cell culture tray	VWR	29442-056
Trypsin EDTA 0.25% solution 1x	JR Scientific	82702
Cell Culture Grade PBS (1x)	Life Technologies	10010023
XTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4891-025-K
T75 Flask	89092-700	VWR
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10437-010
Pen-Strep 1x	Life Technologies	15070063
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus	FV1200
Chambered Microscope Slides	Thermo Scientific	154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5	VWR	48366-227
Microscope Slides	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
FACSCalibur Flow Cytometer	BD Biosciences
3 T Clinical MRI Magnet	GE Healthcare
100 ml round-bottom flask