Biofunktionalisierten Prussian Blue Nanopartikel für Molekulare Bildgebung Multimodale Anwendungen

Zusammenfassung

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Zusammenfassung

Multimodale, ermöglicht die molekulare Bildgebung die Visualisierung biologischer Prozesse auf zellulärer, subzellulärer und molekularer Ebene mit mehreren Auflösungen, ergänzende bildgebende Verfahren. Diese bildgebenden Mittel erleichtern die Echtzeit-Beurteilung von Wegen und Mechanismen in vivo, die sowohl diagnostische als auch therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen. Dieser Artikel stellt das Protokoll für die Synthese von biofunktionalisierte Berliner Blau-Nanopartikel (NPs PB) - eine neue Klasse von Mitteln zur Verwendung in multimodale, molekulare Bildgebung Anwendungen. Die bildgebenden Verfahren in der Nanopartikel, Fluoreszenzbildgebung und Magnetresonanztomographie (MRI) eingebaut ist, komplementäre Funktionen. Die PB-Nanopartikel besitzen eine Kern-Schale-Design, bei dem Gadolinium und Manganionen in den Zwischenräumen des PB Gitter eingebaut erzeugen MRI Kontrast sowohl in T ₁ und T ₂ -gewichteten Sequenzen. Die PB-Nanopartikel mit fluoreszierenden Avidin beschichtete mit elektrostatische Selbst alsMontage, die Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht. Die Avidin-beschichteten Nanopartikel mit biotinyliertem Liganden, die molekulare Targeting-Fähigkeiten an die Nanopartikel zu verleihen modifiziert. Die Stabilität und Toxizität der Nanopartikel werden gemessen, sowie deren MRI Relaxivitäten. Die multimodale, molekulare Bildgebung Fähigkeiten dieser biofunktionalisierte PB-Nanopartikel werden dann durch sie für Fluoreszenz-Bildgebung und molekularer MRT in vitro nachgewiesen.

Einleitung

Molekulare Bildgebung ist die nicht-invasive und gezielte Visualisierung biologischer Prozesse auf zellulärer, subzellulären und molekularer Ebene ^1. Die molekulare Bildgebung ermöglicht eine Probe in seiner nativen Mikroumgebung zu bleiben, während seine endogene Wege und Mechanismen werden in Echtzeit ausgewertet. Typischerweise beinhaltet die molekulare Bildgebung die Verabreichung eines exogenen Kontrastmittel in der Form eines kleinen Moleküls, Makromolekül, oder Nanopartikel zu visualisieren, Ziel und Spuren relevanten physiologischen Prozesse untersucht ^2. Die verschiedenen Bildgebungsmodalitäten, die in der molekularen Bildgebung untersucht worden sind, umfassen MRI, CT, PET, SPECT, Ultraschall, Photoakustik, Raman-Spektroskopie, Biolumineszenz, Fluoreszenz und Intravitalmikroskopie ^3. Multimodal-Bildgebung ist die Kombination von zwei oder mehr bildgebende Verfahren, wo die Kombination erhöht die Fähigkeit, zu visualisieren und zu charakterisieren verschiedenen biologischen Prozessen und Ereignissen ^4. Multimodal Bildgebung nutzt die Stärken der einzelnen Abbildungstechniken, unter Kompensation der individuellen Grenzen ^3.

Dieser Artikel stellt das Protokoll für die Synthese von biofunktionalisierte Berliner Blau-Nanopartikel (NPs PB) - eine neue Klasse von multimodalen, molekulare Bildgebung Agenten. Die PB-Nanopartikel sind für die Fluoreszenz-Bildgebung und molekularer MRT eingesetzt. PB ist ein Pigment, das aus alternierenden Eisen (II) und Eisen (III) -Atome in einer flächenzentrierten kubischen Netzes (Abbildung 1). CN - - Fe ^III Gestänge, die Kationen enthält, um Ladungen in ihrem dreidimensionalen Netzwerk ⁵ Ausgleichen der PB Gitter linearer Cyanidliganden in einer Fe ^II besteht. Die Fähigkeit von PB um Kationen in die Gitter einbauen wird separat Laden Gadolinium und Mangan-Ionen in die PB-Nanopartikel für MRT-Kontrast ausgebeutet.

Der Grund für die Verfolgung einer Nanopartikel-Design für MRT-Kontrast ist wegenDie Vorteile dieser Konstruktion bietet gegenüber aktuellen MRI-Kontrastmittel. Die große Mehrheit der US-FDA-zugelassenen MRI-Kontrastmittel sind Gadoliniumchelaten, die paramagnetischen in der Natur sind und eine positive Kontrast durch die Spin-Gitter-Relaxationszeit Mechanismus ^6.7.8. Im Vergleich zu einem einzigen Gadolinium-Chelat, das niedrige Signalintensität bietet auf seine eigene, bietet der Einbau von mehreren Gadoliniumionen im PB Gitter der Nanopartikel verbesserte Signalintensität (positiver Kontrast) ^3,9. Weiterhin kann die Anwesenheit von mehreren Gadoliniumionen im PB Gitter erhöht die Gesamtspindichte und das Ausmaß der Paramagnetismus der Nanopartikel, die das lokale Magnetfeld in ihrer Umgebung stört, wodurch Negativkontrast durch die Spin-Spin-Relaxationszeit Mechanismus erzeugt wird. Somit funktionieren die Gadolinium enthaltenden Nanopartikel sowohl als T ₁ (positiv) und T ₂ (negative) Kontrastmittel ^10,11.

In einer Untergruppe von Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion ist die Verwaltung der Gadolinium-Kontrastmitteln für die Entwicklung von nephrogener systemischer Fibrose ^{8,12, 13} in Verbindung gebracht. Diese Beobachtung hat Untersuchungen zum Einsatz alternativer paramagnetische Ionen als Kontrastmittel für aufgefordert MRI. Daher wird die vielseitige Konstruktion der Nanopartikel ausgelegt ist, Manganionen in dem PB Gitter einbauen. Ähnlich wie Gadolinium-Chelaten sind Mangan-Chelate auch paramagnetisch und werden typischerweise verwendet, um positive Signalintensität bei MRI ^7,14 bereitzustellen. Wie bei gadoliniumhaltigen PB NPs, die Mangan enthaltende PB NPs auch als T ₁ (positiv) und T ₂ (negative) Kontrastmitteln.

Um Fluoreszenz-Imaging-Funktionen zu integrieren, werden die Nanopartikel "Kerne" mit einem "biofunktionellen" Schale, bestehend aus dem fluoreszenzmarkierten Glykoprotein Avidin (Abbildung 1 beschichtet). Avidin ermöglicht nicht nur die Fluoreszenz-Bildgebung, sondern dient auch als eine Dockingplattform biotinylierten Liganden, die bestimmte Zellen und Gewebe zielen. Die Avidin-Biotin-Bindung ist eine der stärksten bekannten, nicht-kovalente Bindungen, gekennzeichnet durch extrem starke Affinität zwischen Avidin und Biotin ^15. Die Befestigung des biotinylierten Liganden an das Avidin-beschichtete PB NPs verleiht molekulare Targeting-Fähigkeiten für die PB-Nanopartikeln.

Die Motivation für die Verfolgung Fluoreszenz- und MR-Bildgebung mit PB-Nanopartikel ist, weil diese bildgebenden Verfahren besitzen komplementäre Funktionen. Fluoreszenzabbildung ist eine der am häufigsten verwendeten optischen molekularen Bildgebung, und ermöglicht die gleichzeitige Darstellung mehrerer Objekte mit hohen Empfindlichkeiten ^1,16,17. Fluoreszenz-Imaging ist eine sichere, nicht-invasive Modalität ist jedoch mit geringen Eindringtiefen und räumlichen Auflösungen ^1,3,16 verbunden. Andererseits erzeugt MRI hoher zeitlicher eind räumliche Auflösung nicht-invasiv und ohne eine Notwendigkeit für ionisierende Strahlung ^1,3,16. Allerdings MRI leidet unter geringer Empfindlichkeit. Daher Fluoreszenz-Bildgebung und MRT wurden als die molekularen Bildgebung aufgrund ihrer komplementären Merkmale der Eindringtiefe, Empfindlichkeit und Ortsauflösung gewählt.

Dieser Artikel stellt das Protokoll für die Synthese und Biofunktionalisierung der PB-Nanopartikel, gadoliniumhaltigen PB-Nanopartikel (GdPB) und manganhaltigen Nanopartikeln PB (MnPB) ^10,11. Die folgenden Methoden werden beschrieben: 1) Messung der Größe, Ladung und zeitliche Stabilität der Nanopartikel, 2) die Bewertung der Zytotoxizität der Nanopartikel, 3) Messung der MRI Relaxivitäten und 4) Nutzung der Nanopartikel für Fluoreszenz- und molekulare MR-Bildgebung einer Population von Zielzellen in vitro. Diese Ergebnisse zeigen das Potenzial der nationalen Parlamente für die Verwendung als multimodale, molekulare Kontrastmittel in vivo.

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Protokoll

1. Synthese von PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB

Synthese der Nanopartikel (PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB) unter Verwendung einer Eintopfsynthese Schema indem Sie die Schritte unten detailliert erreicht:

1. Bereiten Lösung "A", das 5 ml 5 mM Kaliumhexacyanoferrat (II) in deionisiertem (DI) Wasser. Je nach Art des Nanopartikels, das synthetisiert wird - PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB, bereiten Lösung "B" wie folgt:
   1. Für PB-Nanopartikel: Vorbereitung 10 ml einer Lösung, die 2,5 mM Eisen (III) -chlorid in DI-Wasser.
   2. Für GdPB NPs: Herstellung von 10 ml einer Lösung, die 2,5 mM jedes der Gadolinium (III) nitrat und Eisen (III) -chlorid in DI-Wasser
   3. Für MnPB NPs: Herstellung von 10 ml einer Lösung, die 2,5 mM jedes der Mangan (II) -chlorid und Eisen (III) -chlorid in DI-Wasser.
2. Hinzufügen Lösung "B" in einen Rundkolben gegeben, und der Inhalt des Kolbens bei Raumtemperatur (RT) rühren und1000 Upm. In Lösung "A" tropfenweise in den Rundkolben haltigen Lösung "B". Kontrollieren Sie die Durchflussmenge für die Zugabe von Lösung "A" bis "B" durch eine peristaltische Pumpe eingestellt auf etwa 10 ml / h zu verzichten.
3. Weiterhin Rühren mit 1000 rpm bei Raumtemperatur für weitere 30 min nach der Zugabe der Lösung "A" bis "B" ist abgeschlossen. Stoppen Rühren und sammeln Sie die Mischung.
4. Übertragen Aliquots der Mischung in Mikrozentrifugenröhrchen, die Nanopartikel frei von nicht umgesetzten Komponenten zu spülen. In 5 M NaCl (0,2 ml NaCl / ml Reaktionsmischung) zu jedem Aliquot in Partikelsammlung durch Zentrifugation zu unterstützen.
5. Zentrifuge jedes Aliquot von Nanopartikeln für mindestens 10 min bei 20.000 × g. Nach dem Zentrifugieren vorsichtig den Überstand.
6. Resuspendieren jedes Nanopartikel-Pellet in 1 ml DI-Wasser durch Ultraschallbehandlung mit einer Mikrospitze (Beschallung Impuls an / aus = 1/1 sec, Amplitude = 50%, Laufzeit =5 s, Beschallungsgerät Leistung = 125 W) zum Aufbrechen der Tablette.
7. Die Schritte 1,4-1,6 mindestens 3 × um sicherzustellen, dass die Nanopartikel sind frei von Komponenten der anfänglichen Reaktion und Reaktionsnebenprodukte. Nach der letzten Zentrifugation, Resuspension Partikel in 1 ml DI-Wasser.

2. Biofunktionalisierung von PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB

Biofunktionalisierung der Nanopartikel umfasst Beschichtung der Nanopartikel "Kerne", die mit Avidin und Hinzufügen biotinylierten Liganden, wie unten beschrieben:

1. Die Beschichtung der Nanopartikel mit fluoreszierenden Avidin
   Beschichtung der Nanopartikel mit fluoreszierendem Avidin unter Verwendung elektrostatischer Selbstorganisation erreicht, wo positiv geladene Avidin (pI ~ 10,5) als Beschichtung auf den negativ geladenen Nanoteilchen wie folgt ^18:
   1. Bereiten Suspensionen der PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB in 1 ml DI-Wasser. Filter Alexa Fluor 488-markiertem Avidin (A488; in DI Wasser wiederhergestellt)durch ein 0,2 um Nylon-Mikrofilter bei 14.000 × g für 10 min. Fügen ≤0.2 mg Avidin / mg Nanopartikel. Fügen Sie jede gefilterte Aliquot A488 separat auf die Teilmengen von PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB.
   2. Kontaktieren der Nanopartikel mit A488 für 2-4 h unter leichtem Schütteln oder Rotation bei 4 ° C. Schützen Sie die Proben vor Licht mit Aluminiumfolie.
      HINWEIS: Dieser Schritt Erträge A488 beschichtet PB-Nanopartikel (PB-A488), GdPB (GdPB-A488) und MnPB (MnPB-A488).
2. Befestigung von biotinylierter Antikörper
   Befestigung von biotinyliertem Targeting-Antikörper auf die Avidin-beschichteten Nanopartikel erfolgt mittels Avidin-Biotin-Wechselwirkungen, wie folgt:
   1. Bereiten Suspensionen der Avidin beschichtete Nanopartikel - PB-A488, GdPB-A488 und MnPB-A488 in 1 ml DI-Wasser. Filtern biotinylierten Antikörper (vom Hersteller geliefert) durch ein 0,2 um Nylon-Mikrofilter bei 14.000 × g für 10 min.
      HINWEIS: Hier verwendet die vorliegende Studie biotinylated anti-Neuron-Glia-Antigen 2 (ANG2) die NG2 in Zellen und Gewebe des zentralen Nervensystems und überexprimiert zielt biotinylierten Anti-Mensch-Eotaxin-3 (Eot3), die Rezeptoren an Eosinophilen oder eosinophilen Zellinien überexprimiert abzielt.
   2. Fügen jedes gefilterte Aliquot von biotinylierten Antikörper getrennt mit den Aliquots der Avidin-beschichteten Nanopartikel. Fügen ≤0.05 mg biotinyliertem Antikörper / mg Avidin-beschichteten Nanopartikel. Kontaktieren der Avidin-beschichteten Nanopartikel mit den biotinylierten Antikörper (ANG2 oder Eot3) für 2-4 h unter leichtem Schütteln oder Rotation bei 4 ° C. Schützen Sie die Proben vor Licht mit Aluminiumfolie.
      HINWEIS: Dieser Schritt Erträge Antikörper beschichteten Nanopartikel (zB GdPB-A488-Eot3 und MnPB-A488-ANG2).

3. Sizing, Zeta-Potential, und die zeitliche Stabilität der Nanoteilchen

Die Größenverteilung, Ladung, und die Stabilität der Nanopartikel mit dynamischen MessLichtstreuung (DLS) Verfahren wie nachstehend beschrieben:

1. Dimensionierung der Nanopartikel
   Dimensionierung der Nanopartikel mit dynamischer Lichtstreuung wie folgt erreicht:
   1. Zugabe von 10 ul des Nanopartikels Probe (1 mg / ml) zu 990 & mgr; l DI-Wasser in einem wegwerfbaren Kunststoff Küvette.
      Hinweis: Dies ist repräsentativer Wert für eine gute DLS-Signal.
   2. Verschließen Sie die Küvette und Vortex gut mischen. Setzen Sie die Küvette in einem System verwendet werden, um Partikelgröße, um die Größe der Nanopartikel messen analysieren. Führen Sie die Partikelgrößenanalyse bei einem Messwinkel von 173 °.
2. Zeta-Potential der Nanopartikel
   Zeta-Potential der Nanopartikel wird wie folgt gemessen unter Verwendung einer Phasenanalyselichtstreuung:
   1. 100 l des Nanopartikels Probe (1 mg / ml) zu 900 & mgr; l DI-Wasser in einem wegwerfbaren Kunststoff Kapillarzelle. Dieser Wert ist repräsentativ für einen guten Zetapotentialmessung.
   2. Legen Sie die Kapillary Zelle in einem System verwendet werden, um Zetapotential um die Zetapotential der Nanopartikel unter Verwendung der Standardparameter bei 25 ° C zu messen analysieren.
3. Zeitliche Stabilität der Nanopartikel
   Zeitliche Stabilität der Nanopartikel wird unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung bestimmt, wie folgt:
   1. Bewertung der Stabilität von Nanopartikeln durch die Messung der Größe der Nanopartikel in DI-Wasser sowie Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), wie in Abschnitt 3.1 beschrieben.
   2. Wiederholen Sie die Größenmessungen in DI-Wasser und DMEM einmal / Tag über einen Zeitraum von 5 Tagen.

4. Die Zytotoxizität der Nanoteilchen

Zytotoxizität der Nanopartikel wird wie folgt gemessen unter Verwendung eines XTT-Zellproliferationstest:

1. Seed 10.000-15.000 Zellen / Vertiefung von jedem Zelltyp untersucht (Neuro2a, BSG D10, EoL-1 und OE21) in einer 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen der ausgesäten Zellen nicht eXceed 0,2 ml / Vertiefung. Siedelten Zellen beimpft und über Nacht bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Inkontaktbringen Nanopartikel mit Zellen:
   1. Inkubieren der Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Nanopartikel (0,01 bis 0,5 mg / ml). Siehe Tabelle 1 als Vertreter Tabelle, die die Mengen der Nanopartikel beschrieben (in 50 ul) zugesetzt, um die Zellen nach der Entfernung 50 ul Medium / Vertiefung.
      1. Um für jede störende Absorption der Nanopartikel in der Assay-Konto, fügen Sie eine leere, bestehend aus der entsprechenden Konzentration von Nanopartikeln (0-0,5 mg / ml; in Äquivalenz mit den Mengen zu den Zellen gegeben) auf Medium ohne Zellen.
   2. Inkubieren Zellen mit Nanopartikeln über Nacht bei 37 ° C und 5% CO _2. Absaugen Medien aus jeder Vertiefung und spülen Sie mit Färbepuffer von 5% fötalem Rinderserum (FBS) in phosphatgepufferter Lösung (PBS) zusammen. Füge 100 ul Medium ohne Phenolrot und bei 37 ° C und 5% CO ₂16-18 Std.
3. Bereiten Sie die XTT-Zellproliferationstest Arbeitslösung hergestellt, indem die Komponenten des Kits (XTT-Reagenz und XTT Activator) nach den Angaben des Herstellers. Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen und fügen Sie 100 ul RPMI (RPMI w / o Phenolrot + 10% FBS + 1 x Pen-Strep) oder geeigneten Medium für die Zelltyp untersucht. In 50 ul XTT Arbeitslösung in jede Vertiefung und bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 2 bis 2,5 Stunden.
4. Die Absorption bei 490 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm, um Fingerabdrücke oder Flecken zu korrigieren. Berechnen Sie die korrigierte Extinktion für jede Vertiefung (A ₄₉₀ -A ₆₃₀₎ und der Mittelwert der Messwerte für Wiederholungen.
5. Subtrahieren Sie die Leerwerte aus jeder Vertiefung Wert, um die endgültigen korrigierten Absorptionswerte zu berechnen. Der prozentuale Überleben für jede Probe durch Normalisieren der endgültigen korrigierten Absorption der von unbehandelten Zellen ohne Nanoteilchen. Plot survival Prozentsatz als Funktion der Nanopartikelkonzentration.

5. MRT Relaxivitäten der PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB

MRI Relaxivität gemessen wird unter Verwendung von T ₁ - und T ₂ -gewichteten Sequenzen durch Herstellung eines MRI "Phantom" unter Verwendung eines 96-Well-Platte, die Nanopartikel enthalten, wie unten beschrieben:

1. Phantom Vorbereitung
   1. Bereiten Sie eine Platte mit 96 Vertiefungen mit jeweils gut, das 100 & mgr; Nanopartikel (PB-Nanopartikel, GdPB oder MnPB) in der entsprechenden Konzentration. Beginnend mit einer Konzentration von 0,4 mM für jeden Typ von Nanopartikeln, seriell verdünnt den Nanopartikeln 2 x mit DI-Wasser bis zu einer Konzentration von 2,4 × 10 ^-5 M erreicht wird (dies erfordert 14 Verdünnungen und 15 Vertiefungen).
   2. 100 l Schmelze 1% igen Lösung in VE-Wasser in jedes Well geben und gut mischen. Sollte das Gel bei 4 ° C für 12 Stunden zu verfestigen.
      HINWEIS: Dies ergibt eine Phantom enthalten Verdünnungsreihendie Nanopartikel in Agarose verfestigte.
   3. Legen Sie die Phantom in horizontaler 3 T klinischen Magnet unter einem massiven Block aus 2% Agar (150 cm ^3). Sichern Sie die Phantom und Block von Agar in der Mitte eines 8-Kanal HD Gehirn Spule. Messen Relaxationszeiten Verwendung von 0,5 mm dicken koronale Schnitte auf halber Höhe der Platte mit 96 Vertiefungen ^11.
2. T ₁ - und T ₂ -gewichteten Sequenzen
   Verwenden Sie die folgenden repräsentativen Einstellungen für den Erwerb der Sequenzen, die in der klinischen Magnet.
   ANMERKUNG: Diese Werte werden für die in der vorliegenden Studie verwendeten Nanopartikel optimiert:
   1. Erwerben T ₁ -gewichteten (T1W) MR-Bilder mit dem folgenden Flüssigkeit gedämpfte Inversion-Recovery (FLAIR) Reihenfolge: Echo Zug (ET) = 8, Wiederholzeit (TR) = 2.300 ms, Echozeit (TE) = 24,4 ms, Matrix Größe = 512 x 224, Sichtfeld (FOV) = 16 x 16 cm ^2.
   2. Erwerben T ₂ -gewichteten (T2W) MR-Bilder mit dem folgenden schnellen relaxation schnelle Spin-Echo (FRFSE) Reihenfolge: ET = 21; TR = 3500 ms; TE = 104 ms; Matrix size = 512 x 224; FOV = 16 × 16 cm ^2.
   3. Erwerben T1W und T2W MR-Bilder bei 127 MHz (3 T) bei den folgenden Inversionszeiten: 50, 177, 432, 942, 1.961 und 4.000 ms.
3. Die Messung der MRI Relaxivitäten
   1. Nach der Übernahme T1W und T2W Bilder mit den in Abschnitt 5.2 beschriebenen Sequenzen, messen Sie die Signalstärke für jede Vertiefung mit ImageJ, fortan als Region of Interest (ROI), indem Sie jede ROI mit dem ovalen Frucht Schaltfläche in der Werkzeugleiste befindet bezeichnet, dann Auswählen Analysieren> Messen.
      HINWEIS: Ein Pop-up sollte die mittlere Signalintensität jedes ROI unter der Spalte mit der Bezeichnung "Mean" anzuzeigen.
   2. Für jede ROI, zeichnen Sie die gemessenen Signalintensität gegen seine spezifische Umkehrzeit. Bei Bedarf invertieren Punkte (Messwerte), die eine anfängliche "Blase" oder Ausreißer zu Beginn der Handlung erzeugen (untere Umkehrmal).
      ANMERKUNG: Diese Werte werden bei geringer Inversionszeiten erzeugt, weil MRT misst den Betrag oder Absolutwert der Bilder anstatt ihre tatsächliche (negative) Wert, der berücksichtigt werden muss / ¹⁹ korrigiert.
   3. Bereiten Sie eine exponentielle Anpassung für jede Handlung des Signalintensität für die ROIs (SI) vs. Umkehrzeiten (T _I), wie in Abschnitt 5.2 beschrieben. Plot T _I auf der x-Achse, SI auf der y-Achse; ɑ und Δ Konstanten durch Regression bestimmt wird, und T ₁ oder T ₂ ist die Variable zu lösen:
      
      wobei t = T _1, T _2.
   4. Auflösen nach T ₁ oder T ₂ unter Verwendung der obigen Gleichung und Plotten der inversen der berechneten Werte (1 / _T1 und 1 / T ₂₎ gegen die Konzentration der in jedem ROI verwendeten Nanopartikel.
   5. Berechnen der Steigung des linearen Graph,ergibt die Relaxivitäten R ₁ und R _2.
      HINWEIS: Der folgende Abschnitt des Protokolls beschreibt die Anwendung der Nanopartikel zur Fluoreszenzmarkierung und die Erzeugung von MRI-Kontrast in Zielzellen.

6. Fluoreszenzmarkierung von Zielzellen Mit der Nanopartikel - konfokale Mikroskopie

HINWEIS: Die Nanopartikel (PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB) können verwendet werden, um Fluoreszenz zu kennzeichnen eine Population von Zielzellen (durch konfokale Mikroskopie überwacht) wie folgt:

1. Synthese des fluoreszierenden Nanopartikeln
   1. Synthetisieren GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 zur Fluoreszenzmarkierung von einer Population von Zielzellen indem Sie die Schritte in den Abschnitten 1 und 2 aufgeführt.
2. Vorbereitung der Zellen für die Fluoreszenz-Targeting
   1. Coat-Nr. 1,5 Mikrodeckgläser durch Eintauchen in eine Lösung von 0,002% Poly (L-Lysin) Hydrobromid für 90 min. Entfernen Sie die Deckgläser aus der Lösung und lassen Sie sie für 24 Stunden trocknen lassen.
   2. Samen die Zellen (zB EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) auf den beschichteten Deckgläsern in einer 6-Well-Platte gelegt und bei 37 ° C und 5% CO ₂ für mindestens 16 Std. Mit einer 1 × PBS-Lösung und spülen Sie die Zellen (optional) befestigen mit 10% Formaldehyd in neutraler Pufferlösung für 15 min. Stain Zellen mit 5 & mgr; M rot-orange zelldurchdringenden Farbstoff in PBS bei 37 ° C für 30 min. Anschließend spülen Zellen mit PBS.
3. > Fluoreszenzmarkierung von Zielzellen
   1. 1% Rinderserumalbumin (BSA; in entionisiertem Wasser) auf die Zellen, um eine unspezifische Bindung zu minimieren, auf die Zellen, und bei 37 ° C für 1 Stunde.
   2. Inkubieren Zellen mit den Nanopartikeln in 1% BSA für 1 Std. Für EoL-1: Inkubation mit 0,2 mg / ml GdPB-A488 oder GdPB-A488-Eot3; Für BSG D10 und SUDIPG1: Inkubation mit 0,2 mg / ml MnPB-A488 oder MnPB-A488-ANG2. Spülen Sie die Zellen mit PBS 3 x zu entfernen unbound Nanopartikel.
   3. Vorsichtiges Umdrehen des Deckglases (die Zellen und Nanopartikel) auf einem Objektträger, um sicherzustellen, dass es keine Luftbläschen. Verschließen Sie die Kante zwischen dem Deckglas und Objektträger durch eine sorgfältige Anwendung von klaren Nagellack. Bild die Zellen mit einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop.

7. Fluoreszenzmarkierung von Zielzellen Mit der Nanopartikel - Durchflusszytometrie

Die Nanopartikel (PB-Nanopartikel, GdPB und MnPB) auf Fluoreszenz-Label verwendet werden, eine Population von Zielzellen (mittels Durchflusszytometrie überwacht) wie folgt:

1. Bereiten Suspensionen der Zellen in PBS abgezielt. Für reine Kulturstudien, die Suspensionen bestehen aus einem Zelltyp (zB BSG D10); Resuspension eines Zellpellets von BSG D10-Zellen in PBS mit 100.000 Zellen / ml (10 ml insgesamt). Für Mischkultur-Studien, die Suspensionen bestehen aus mindestens zwei Zelltypen (zB EoL-1 und OE21); ähnlich wie BSG D10, resuspendieren Zellpellets der EoL-1 und OE21 in PBS bei 100.000 Zellen / ml je (10 ml insgesamt).
   1. Planen verschiedener Verhältnisse des EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: (jede EoL-1 und OE21 1 ml) 1, 1: 3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
2. Blockieren die Zellen (reine und gemischte Suspensionen) durch Nanopartikel mit 2 ml 5% BSA, zu minimieren unspezifischen Bindung ausgerichtet.
3. 1 ml (1 mg / ml) Nanopartikel zu den Zellen und inkubiere für 1 Stunde. Für BSG D10, Inkubation Zellen mit MnPB-A488, MnPB-A488-AbC (Kontrollantikörper), oder MnPB-A488-ANG2). Für Mischungen von EoL-1 und OE21, brüten die Mischungen mit einem Betrag von GdPB-A488-Eot3.
4. Spüle die Zellen von ungebundenem Nanopartikel durch Abzentrifugieren der Proben bei 1000 × g für 5 min bei mindestens 3 × um ungebundene Partikel zu entfernen. Die Zellen in 1 ml PBS und fixieren mit 10% Formaldehyd in PBS. Fleckzellen durch Inkubation mit 10 & mgr; g / ml7-Aminoactinomytcin D in PBS auf Eis für 30 min. Spülen mit PBS, dann analysieren 10.000 Wohnzellen aus jeder Probe mit einem Durchflusszytometer.

8. Generieren von MRI-Kontrast auf Zielzellen Mit der Nanopartikel

Die Nanopartikel (PB NPs GdPB und MnPB) kann verwendet werden, um MRI-Kontrast (in beiden T ₁ - und T ₂ -gewichteten Sequenzen) zu erzeugen, wie folgt, in einer Population von Zielzellen:

1. Phantom Vorbereitung
   1. Wachsen Zellen (zB BSG D10) in T75-Kolben, bis ~ 80% Konfluenz. Verwenden Sie geeignete Wachstumsmedium Bedingungen. BSG D10, wachsen die Zellen in DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep bei 37 ° C und 5% CO _2.
   2. Spülen Zellen frei von Medium, das mit 5 ml PBS und Blockieren der Zellen mit 5 ml 1% BSA in PBS für 1 h zur Minimierung unspezifischer Bindung. 5 ml (0,5 mg / ml) Nanopartikel an die Zellen. Für BSG D10, Inkubation der Zellen mit MnPB-A488, MnPB-A488-AbC (Kontrollantikörper) und MnPB-A488-ANG2 1 Stunde.
   3. Spülen Zellen 3x mit 5 ml PBS, um ungebundene Nanopartikel zu entfernen. Trypsinieren der Zellen durch Inkubation der Zellen mit 2 ml Trypsin-EDTA 0,25% ige Lösung 1 x für 5 min bei 37 ° C und 5% CO _2, um sie von dem Kolben für Phantom Herstellung lösen. 8 ml DMEM, das Trypsinisierung der Zellen zu löschen.
   4. Sammle die Zellen durch Zentrifugieren bei 1.000 × g für 5 min; saugen Sie den Überstand. Resuspendieren der Zellen in 1 ml PBS und 1 ml 10% Formaldehyd in PBS, um die Zellen zu fixieren. Füge 100 & mgr; l von jeder Probe in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte.
   5. 100 l Schmelze 1% igen Lösung in VE-Wasser in jedes Well geben und gut mischen durch Auf-und Abpipettieren. Sollte das Gel bei 4 ° C für 12 Stunden zu verfestigen.
      HINWEIS: Dies ergibt eine Phantom enthaltenden Zellen mit angeschlossenem Nanopartikeln in erstarrten Agarose.
   6. Legen Sie die Phantom in horizontaler 3 T klinischen Magnet neben einem massiven Block aus 2% Agar (150 cm ^{3). Sichern Sie die Phantom und Block von Agar in der Mitte eines 8-Kanal HD Gehirn Spule. Messen Relaxationszeiten Verwendung von 0,5-mm dicke koronale Schnitte auf halber Höhe der 96-Well-Platte 11.}
2. T ₁ - und T ₂ -gewichteten Sequenzen
   Verwenden Sie folgende Einstellungen für den Erwerb der Sequenzen, die in der klinischen MRI-Magneten:
   1. Erwerben T1W MR-Bilder mit dem folgenden Spinecho-Sequenz: Echo Zug (ET) = 1, Wiederholzeit (TR) = 650 ms, Echozeit (TE) = 11 ms, Matrix size = 320 x 256, Sichtfeld (FOV) = 10 x 10 cm ^2.
   2. Erwerben T2W MR-Bilder mit dem folgenden FRFSE Reihenfolge: ET = 28; TR = 3000 ms; TE = 101 ms; Matrix size = 384 x 288; FOV = 10 × 10 cm ^2.
3. Post-Akquisitionsverarbeitung
   1. Zur besseren Ablesbarkeit, wandeln die ursprüngliche Graustufenbilder in einer Farbskala Bild mit ImageJ: Wählen Sie Bild> Typ> 8-Bit, um das Bild zu konvertieren in Graustufen.
   2. Berechnen Sie die normierte Intensität für jede Probe nach Abzug der Signalbeitrag aus dem Agarose-Lösung.

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Ergebnisse

Mit der Eintopfsynthese Schema, Nanopartikel aus PB-Nanopartikel (mittlerer Durchmesser 78,8 nm, Polydispersitätsindex (PDI) = 0,230; durch die dynamische Lichtstreuung Instrument berechnet), GdPB (mittlerer Durchmesser 164,2 nm, PDI = 0,102) oder MnPB ( mittlerer Durchmesser 122,4 nm, PDI = 0,124), die monodisperse (wie von DLS gemessen sind) konsequent synthetisiert werden (Abbildung 2A). Die gemessenen Zetapotentiale der synthetisierten Nanopartikel sind kleiner als -30 mV (2B), was...

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Diskussion

Dieser Artikel wurde die Methoden für die Synthese einer neuen Klasse von multimodalen, molekulare Bildgebung Mittel auf Basis von biofunktionalisierte Berliner Blau Nanopartikel vorgestellt. Die molekularen Bildgebungsmodalitäten in die Nanopartikel aufgenommen sind Fluoreszenzabbildung und molekularen MRI aufgrund ihrer komplementären Funktionen. Die biofunktionalisierte Berliner Blau Nanopartikel eine Kern-Schale-Design. Die wichtigsten Schritte bei der Synthese dieser Nanopartikel sind: 1) Eintopfsynthese, die di...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O)	Sigma-Aldrich	P9387
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O)	Sigma-Aldrich	211591
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Sigma-Aldrich	236489
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody	Millipore	AB5320
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3	Peprotech	500-P156GBT
Neuro-2a Cell Line	ATCC	CCL-131
BSG D10 Cell Line	Lab stock	---
OE21 Cell Line	Sigma-Aldrich	96062201
SUDIPG1 Neurospheres	Lab stock	---
Eol-1 Cell Line	Sigma-Aldrich	94042252
Poly(L-lysine) hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1399
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Aminoactinomycin D	Sigma-Aldrich	A9400
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
CellTrace Calcein Red-Orange, AM	Life Technologies	C34851
Avidin-Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21370
Centrifuge	Eppendorf	5424
Peristaltic Pump	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonicator	QSonica	Q125
Hot Plate/Magnetic Stirrer	VWR	97042-642
Ultra Clean Aluminum Foil	VWR	89107-732
Vortex Mixer	VWR	58816-121
1.7 ml conical microcentrifuge tubes	VWR	87003-295
15 ml conical centrifuge tubes	VWR	21008-918
Tube holders	VWR	82024-342
Disposable plastic cuvettes	VWR	7000-590 (/586)
Zetasizer capillary cell	VWR	DTS1070
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column	VWR	82031-356
96-well cell culture tray	VWR	29442-056
Trypsin EDTA 0.25% solution 1x	JR Scientific	82702
Cell Culture Grade PBS (1x)	Life Technologies	10010023
XTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4891-025-K
T75 Flask	89092-700	VWR
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10437-010
Pen-Strep 1x	Life Technologies	15070063
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus	FV1200
Chambered Microscope Slides	Thermo Scientific	154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5	VWR	48366-227
Microscope Slides	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
FACSCalibur Flow Cytometer	BD Biosciences
3 T Clinical MRI Magnet	GE Healthcare
100 ml round-bottom flask