Biofunctionalized bleu de Prusse nanoparticules pour l'imagerie moléculaire multimodale Applications

Résumé

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Résumé

Multimodal, l'imagerie moléculaire permet la visualisation des processus biologiques à des résolutions cellulaires, subcellulaires, et au niveau moléculaire en utilisant plusieurs techniques d'imagerie, complémentaires. Ces agents d'imagerie facilitent l'évaluation en temps réel des voies et mécanismes in vivo, qui améliorent à la fois l'efficacité diagnostique et thérapeutique. Cet article présente le protocole pour la synthèse de nanoparticules bleu de Prusse biofunctionalized (PB PN) - une nouvelle classe d'agents pour une utilisation dans des applications multimodales, d'imagerie moléculaire. Les modalités d'imagerie incorporé dans les nanoparticules, l'imagerie par fluorescence et l'imagerie par résonance magnétique (IRM), ont des caractéristiques complémentaires. Les IP PB possèdent une conception noyau-enveloppe où le gadolinium et des ions manganèse incorporés dans les espaces interstitiels du treillis PB génèrent contraste IRM, à la fois en T ₁ et T ₂ pondérées en séquences. Les IP PB sont revêtues d'avidine fluorescent à l'aide électrostatique comme auto-Assemblée, qui permet l'imagerie de fluorescence. Les nanoparticules revêtues d'avidine sont modifiés avec des ligands biotinylés qui confèrent des capacités de ciblage moléculaire aux nanoparticules. La stabilité et la toxicité des nanoparticules sont mesurées, ainsi que leurs relaxivité d'IRM. Les capacités multimodales, d'imagerie moléculaire de ces IP PB biofunctionalized sont ensuite démontrées par leur utilisation pour l'imagerie de fluorescence et l'IRM moléculaire in vitro.

Introduction

L'imagerie moléculaire est la visualisation non invasive et ciblée des processus biologiques au niveau cellulaire, subcellulaire et ^une échelle moléculaire. L'imagerie moléculaire permet un spécimen de rester dans son microenvironnement native tandis que ses voies et mécanismes endogènes sont évalués en temps réel. Typiquement, l'imagerie moléculaire implique l'administration d'un agent d'imagerie exogène sous la forme d'une petite molécule, macromolécule, ou nanoparticules de visualiser, cible, et de tracer les processus physiologiques pertinents étudié ^deux. Les différentes modalités d'imagerie qui ont été explorées en imagerie moléculaire comprennent l'IRM, CT, PET, SPECT, ultrasons, photoacoustique, la spectroscopie Raman, la bioluminescence, fluorescence et microscopie intravitale ^3. Imagerie multimodale est la combinaison de deux ou plusieurs modalités d'imagerie où la combinaison améliore la capacité de visualiser et de caractériser les différents processus et des événements biologiques ^4. Multimodal imagerie exploite les forces des techniques d'imagerie individuels, tout en compensant leurs limitations individuelles ^3.

Cet article présente le protocole pour la synthèse de nanoparticules bleu de Prusse biofunctionalized (PB PN) - une nouvelle classe d'agents d'imagerie multimodaux, moléculaires. Les IP PB sont utilisés pour l'imagerie de fluorescence et l'IRM moléculaire. PB est un pigment constitué d'une alternance de fer (II) et de fer (III) des atomes dans un réseau cubique à faces centrées (figure 1). Le treillis est composé de PB de ligands cyanure linéaires dans un Fe ^II - CN - liaison Fe ^III qui incorpore des cations pour équilibrer les charges au sein de son réseau ⁵ tridimensionnel. La capacité des PB à intégrer cations dans son réseau est exploité en chargeant séparément gadolinium et ions manganèse dans les IP PB pour le contraste IRM.

La justification de la poursuite d'une conception de nanoparticules pour le contraste IRM est à cause deles avantages de cette conception offre par rapport aux agents de contraste d'IRM actuels. La grande majorité des agents de contraste IRM approuvés par la FDA des États-Unis sont chélates de gadolinium paramagnétique qui sont dans la nature et fournissent contraste positif par le mécanisme de relaxation ^6,7,8 de spin-réseau. Par rapport à un simple-chelate de gadolinium qui fournit une faible intensité de signal lui-même, l'incorporation de plusieurs ions gadolinium dans le réseau PB des nanoparticules qui assure une meilleure intensité de signal (contraste positif) ^3,9. En outre, la présence d'ions de gadolinium multiples dans le réseau de PB augmente la densité de spins global et l'ampleur du paramagnétisme des nanoparticules, ce qui perturbe le champ magnétique local dans son voisinage, générant de ce fait contraste négatif par le mécanisme de relaxation spin-spin. Ainsi, les nanoparticules contenant du gadolinium fonctionnent à la fois comme T ₁ (positif) et T _deux agents (négative) de contraste ^10,11.

Dans un sous-ensemble de patients atteints d'insuffisance rénale, l'administration d'agents de contraste à base de gadolinium a été liée au développement de la fibrose néphrogénique systémique ^{8,12, 13.} Cette observation a conduit des enquêtes sur l'utilisation d'ions paramagnétiques alternatives comme agents de contraste pour IRM. Par conséquent, la conception souple des nanoparticules est adapté pour incorporer des ions manganèse dans le réseau de PB. Similaire à gadolinium-chélates, manganèse-chélates sont également paramagnétique et sont généralement utilisés pour fournir une intensité de signal positif en IRM ^7,14. Comme contenant du gadolinium PB IP, les contenant du manganèse PB IP fonctionnent comme T ₁ (positif) et T ₂ agences (négative) de contraste.

Pour incorporer des capacités d'imagerie de fluorescence, les «noyaux» nanoparticules sont enrobées d'une enveloppe "biofonctionnel" consistant en avidine la glycoprotéine marqué par fluorescence (Figure 1). L'avidine non seulement permet l'imagerie de fluorescence, mais également sert de plate-forme d'accueil pour des ligands biotinylés qui ciblent les cellules et les tissus spécifiques. La liaison avidine-biotine est un des plus forts liens connus, non-covalentes caractérisés par une très forte affinité de liaison entre l'avidine et de la biotine ^15. La fixation des ligands biotinylés à l'avidine revêtu PB IP confère des capacités de ciblage moléculaire au SNM PB.

La motivation pour la poursuite de la fluorescence et IRM utilisant PB IP est parce que ces modalités d'imagerie possèdent des caractéristiques complémentaires. imagerie de fluorescence est une des techniques les plus largement utilisés optiques d'imagerie moléculaire, et permet la visualisation simultanée de plusieurs objets à des sensibilités élevées ^1,16,17. imagerie de fluorescence est un coffre-fort, la modalité non-invasive, mais est associée à de faibles profondeurs de pénétration et des résolutions spatiales ^1,3,16. D'autre part, l'IRM génère une haute temporelled résolution spatiale de manière non invasive et sans la nécessité d'un rayonnement ionisant ^1,3,16. Cependant IRM souffre d'une faible sensibilité. Par conséquent imagerie de fluorescence et l'IRM ont été choisis comme les techniques d'imagerie moléculaire en raison de leurs caractéristiques complémentaires de pénétration en profondeur, la sensibilité et la résolution spatiale.

Cet article présente le protocole pour la synthèse et biofonctionnalisation des IP PB, PB IP (PIBb), et contenant du gadolinium-PB IP (MnPB) ^10,11 contenant du manganèse. Les méthodes suivantes sont décrites: 1) mesure de la taille, la charge et la stabilité temporelle des nanoparticules, 2) évaluation de la cytotoxicité des nanoparticules, 3) Mesure de la relaxivité IRM, et 4) l'utilisation des nanoparticules pour la fluorescence et l'imagerie par résonance magnétique moléculaire d'une population de cellules cibles in vitro. Ces résultats démontrent le potentiel de PN pour l'utilisation comme agents multimodal, d'imagerie moléculaire in vivo.

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Protocole

1. Synthèse de PB IP, PIBb et MnPB

Synthèse des nanoparticules (PB PN, PIBb ou MnPB) est obtenue en utilisant un schéma de synthèse one-pot en effectuant les étapes détaillées ci-dessous:

1. Préparer la solution "A" contenant 5 ml de 5 mM de l'hexacyanoferrate de potassium (II) dans désionisée (DI) de l'eau. Selon le type de nanoparticules étant synthétisé - PB IP, PIBb ou MnPB, préparer la solution «B» comme suit:
   1. Pour PB IP: préparer 10 ml d'une solution 2,5 mM contenant du fer (III) chlorure dans l'eau DI.
   2. Pour PIBb IP: préparer 10 ml d'une solution contenant 2,5 mM de chacun de gadolinium (III) et de nitrate de fer (III) chlorure dans l'eau DI
   3. Pour MnPB IP: préparer 10 ml d'une solution contenant 2,5 mM de chacun de manganèse (II) et le chlorure de fer (III) chlorure dans l'eau DI.
2. Ajouter la solution «B» à un ballon à fond rond, et mélanger le contenu du ballon à la température ambiante (RT) et1000 tours par minute. Ajouter la solution 'A' goutte à goutte dans le ballon à fond rond contenant une solution «B». Contrôler le débit pour l'ajout d'une solution 'A' à 'B' par une pompe péristaltique réglés pour distribuer environ 10 ml / h.
3. Poursuivre l'agitation à 1000 rpm à température ambiante pendant 30 minutes supplémentaires après l'addition de la solution "A" à "B" est terminée. Arrêtez de remuer et de recueillir le mélange.
4. Transfert aliquotes du mélange dans des microtubes de rincer les nanoparticules libres des composants ne ayant pas réagi. Ajouter 5 M de NaCl (0,2 ml de NaCl / mélange réactionnel ml) à chaque aliquote pour aider à la collecte de particules par centrifugation.
5. Centrifugeuse de chaque aliquote de nanoparticules pendant au moins 10 min à 20 000 x g. Après centrifugation, retirer délicatement le surnageant.
6. Reprendre chaque pastille de nanoparticules dans 1 ml d'eau DI par ultrasons en utilisant une micro-pointe (impulsion d'ultrasons on / off = 1/1 sec, amplitude = 50%, la durée =5 sec, l'énergie de sonication attribuée = 125 W) pour briser la pastille.
7. Répéter les étapes 1.4 à 1.6 au moins 3 fois pour se assurer que les nanoparticules sont exempts de composants de la réaction et des sous-produits réactionnels initiaux. Après la dernière centrifugation, les particules dans 1 ml d'eau DI remettre en suspension.

2. biofonctionnalisation de PB IP, PIBb et MnPB

Biofonctionnalisation des nanoparticules revêtement comprend des nanoparticules "noyaux" par l'avidine et l'ajout de ligands biotinylés comme décrit ci-dessous:

1. Revêtement des nanoparticules avec Fluorescent Avidin
   Revêtement des nanoparticules avec avidine fluorescent est réalisé en utilisant l'auto-assemblage électrostatique où chargé positivement avidine (pI ~ 10.5) est déposée sur des nanoparticules chargées négativement comme suit ^18:
   1. Préparer des suspensions des IP PB, PIBb ou MnPB dans 1 ml d'eau DI. Filtrez Alexa Fluor 488-avidine marquée (A488; reconstituée dans de l'eau DI)à travers un filtre en nylon de 0,2 um microcentrifugeuse à 14 000 xg pendant 10 min. Ajouter ≤0.2 mg avidine / mg de nanoparticules. Ajouter chaque aliquote filtrée A488 séparément aux aliquotes de PB IP, PIBb ou MnPB.
   2. Contactez les nanoparticules avec A488 pour 2-4 heures avec agitation douce ou de rotation à 4 ° C. Protéger les échantillons de la lumière à l'aide de papier d'aluminium.
      NOTE: Cette étape donne A488 revêtu PB IP (PB-A488), PIBb (PIBb-A488), et MnPB (MnPB-A488).
2. Fixation des anticorps biotinylés
   Fixation des anticorps ciblant biotinylés sur les nanoparticules recouvertes d'avidine est réalisé en utilisant les interactions avidine-biotine comme suit:
   1. Préparer des suspensions des avidine revêtu nanoparticules - PB-A488, A488 PIBb-et-MnPB A488 dans 1 ml d'eau DI. Filtre anticorps biotinylé (comme fourni par le fabricant) à travers un filtre de 0,2 um microcentrifugeuse à 14 000 en nylon xg pendant 10 min.
      REMARQUE: Ici, la présente étude utilise Biotinylated anti-neurone-glie antigène 2 (ANG2) qui cible NG2 surexprimé dans les cellules et les tissus du système nerveux central et l'éotaxine-3 biotinylée anti-humaine (Eot3) qui cible des récepteurs surexprimés sur les éosinophiles ou des lignées de cellules éosinophiles.
   2. Ajouter chaque aliquote filtrée d'anticorps biotinylé séparément pour les aliquotes des nanoparticules revêtues d'avidine. Ajouter ≤0.05 mg nanoparticules d'anticorps / mg avidine revêtu biotinylé. Contactez les nanoparticules recouvertes d'avidine avec les anticorps biotinylés (de ANG2 ou Eot3) pour 2-4 heures avec agitation douce ou de rotation à 4 ° C. Protéger les échantillons de la lumière à l'aide de papier d'aluminium.
      NOTE: Cet anticorps des rendements étape nanoparticules enrobées (par exemple PIBb-A488-Eot3 et MnPB-A488-ANG2).

3. Dimensionnement, Zeta potentiel et stabilité temporelle des nanoparticules

La distribution de taille, la charge, et la stabilité des nanoparticules sont mesurées à l'aide dynamiquediffusion de la lumière (DLS) méthodes décrites ci-dessous:

1. Dimensionnement des nanoparticules
   Le dimensionnement des nanoparticules est obtenue en utilisant la diffusion dynamique de la lumière comme suit:
   1. Ajouter 10 ul de l'échantillon de nanoparticules (1 mg / ml) à 990 ul d'eau DI dans une cuvette en plastique jetable.
      NOTE: Ce est valeur représentative pour un bon signal de DLS.
   2. Cap la cuvette et le vortex pour bien mélanger. Placer la cuvette dans un système utilisé pour analyser la taille des particules afin de mesurer la taille des nanoparticules. Procéder à une analyse de la taille des particules à un angle de mesure de 173 °.
2. Potentiel Zeta des nanoparticules
   Le potentiel zêta des nanoparticules est mesuré en utilisant une analyse de dispersion de phase de la lumière de la manière suivante:
   1. Ajouter 100 ul de l'échantillon de nanoparticules (1 mg / ml) à 900 ul d'eau DI dans une cellule capillaire plastique jetable. Cette valeur est représentative d'une bonne mesure du potentiel zêta.
   2. Placer le capillairey cellule dans un système utilisé pour analyser le potentiel zêta pour mesurer le potentiel zêta des nanoparticules en utilisant des paramètres par défaut à 25 ° C.
3. Stabilité temporelle des nanoparticules
   La stabilité temporelle des nanoparticules est mesuré par diffusion dynamique de la lumière comme suit:
   1. Évaluer la stabilité des nanoparticules par la mesure de la taille des nanoparticules dans l'eau désionisée ainsi que Modified Eagle Medium de Dulbecco (DMEM), comme décrit dans la section 3.1.
   2. Répétez les mesures de taille dans l'eau DI et DMEM fois / jour sur une période de cinq jours.

4. cytotoxicité des nanoparticules

La cytotoxicité des nanoparticules est mesuré en utilisant un dosage de prolifération de cellules XTT comme suit:

1. Semences 10.000-15.000 cellules / puits de chaque type cellulaire étudié (Neuro2A, BSG D10, EoL-1, et OE21) dans une plaque de 96 puits. Assurez-vous que le volume total de cellules ensemencées ne E NonXceed 0,2 ml / puits. Incuber les cellules ensemencées pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Contacter nanoparticules avec les cellules:
   1. Incuber les cellules avec diverses concentrations de nanoparticules (0,01 à 0,5 mg / ml). Reportez-vous au tableau 1 comme une table représentant qui décrit les quantités de nanoparticules (dans 50 pi) ajouté aux cellules après avoir retiré 50 pi de milieu / puits.
      1. Pour tenir compte de toute interférence absorbance des nanoparticules dans le dosage, ajouter un blanc comprenant de la concentration appropriée de nanoparticules (0-0,5 mg / ml; en équivalent aux montants ajoutés aux cellules) à milieu sans cellules.
   2. Incuber les cellules avec des nanoparticules pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO _2. Aspirer le milieu de chaque puits et rinçage avec du tampon de coloration comprenant de 5% de sérum bovin fœtal (FBS) dans une solution tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 100 ul de milieu sans rouge de phénol et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂pour les 16-18 heures.
3. Préparer la solution de travail Essai de prolifération cellulaire XTT en mélangeant les composants du kit (XTT réactifs et Activator XTT) selon les spécifications du fabricant. Aspirer les médias des puits et ajouter 100 ul de RPMI (RPMI w / o phénol rouges + 10% FBS + 1 x Pen-Strep) ou support approprié pour le type de cellule étudiée. Ajouter 50 ul de solution de travail XTT à chaque puits et incuber à 37 ° C et 5% _de CO2 pendant 2 à 2,5 heures.
4. Mesurer l'absorbance à 490 nm, avec une longueur d'onde de 630 nm de référence pour corriger les empreintes digitales ou des taches. Calculer l'absorbance corrigée pour chaque puits (A ₄₉₀ -A ₆₃₀₎ et la moyenne des lectures pour les répétitions.
5. Soustraire les lectures vierges de chaque valeur et pour calculer les valeurs finales d'absorbance corrigées. Calculer le pourcentage de survie pour chaque échantillon en normalisant la densité optique corrigée finale à celle des cellules non traitées sans nanoparticules. Terrain survival pourcentage en fonction de la concentration des nanoparticules.

5. IRM relaxivités des IP PB, PIBb et MnPB

Relaxivité est mesurée en utilisant l'IRM T ₁ - T ₂ et des séquences pondérées en en préparant un "fantôme" d'IRM en utilisant une plaque à 96 puits contenant des nanoparticules décrites ci-dessous:

1. Préparation Phantom
   1. Préparer une plaque de 96 puits par puits contenant 100 pi nanoparticules (PB PN, PIBb ou MnPB) à la concentration appropriée. A partir d'une concentration de 0,4 mM pour chaque type de nanoparticules, les nanoparticules dilué en série 2 x avec de l'eau DI jusqu'à une concentration de 2,4 × 10 ^-5 M est atteint (ce qui nécessite 14 15 puits et des dilutions).
   2. Ajouter 100 pi de solution d'agarose à 1% fondu dans l'eau DI dans chaque puits et bien mélanger. Laisser le gel se solidifier à 4 ° C pendant 12 heures.
      NOTE: Cela donne un fantôme contenant des dilutions en série deles nanoparticules dans agarose solidifié.
   3. Placez le fantôme dans un aimant horizontal 3 T clinique sous un bloc solide de 2% de gélose (150 cm ^3). Fixez le fantôme et le bloc d'agar dans le centre d'une bobine de cerveau HD 8 canaux. Mesurer les temps de relaxation en utilisant 0,5 mm d'épaisseur coupes coronales à mi-hauteur de la plaque 96 puits ^11.
2. T ₁ - T ₂ et séquences pondérées
   Utilisez les paramètres représentatifs suivants pour l'acquisition des séquences dans l'aimant clinique.
   NOTE: Ces valeurs sont optimisés pour les nanoparticules utilisées dans la présente étude:
   1. Acquérir pondération T ₁ images (T1) MR en utilisant la reprise suivante fluide d'inversion atténué (FLAIR) de séquence: Echo train (ET) = 8, temps de répétition (TR) = 2300 ms, temps d'écho (TE) = 24,4 ms, taille de la matrice = 512 x 224, Champ de vision (FOV) = 16 x 16 cm ^2.
   2. Acquérir T ₂ pondérées en images (T2) MR utilisant le relaxa rapide suivantetion rapide séquence écho de spin (FRFSE): ET = 21; TR = 3500 msec; Te = 104 ms; taille de la matrice = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm ^2.
   3. Acquérir T1 et T2 MR images à 127 MHz (3 T) aux heures d'inversion suivants: 50, 177, 432, 942, 1961, et 4000 ms.
3. Mesurer les relaxivités IRM
   1. Après l'acquisition de T1 et T2 des images en utilisant les séquences décrites à la section 5.2, mesurer l'intensité du signal pour chaque puits en utilisant ImageJ, dorénavant désignée comme la région d'intérêt (ROI) en sélectionnant chaque ROI en utilisant le bouton de culture ovale situé sur la barre d'outils principale, puis sélectionnant Analyse> Mesure.
      REMARQUE: Un pop-up devrait afficher l'intensité de chaque ROI moyen de signal dans la colonne intitulée "Moyenne".
   2. Pour chaque ROI, tracer l'intensité de signal mesurée par rapport à son temps d'inversion spécifique. Si nécessaires, des points inverses (lectures) qui génèrent une "bulle" initiale ou aberrantes au début de la parcelle (inversion inférieurefois).
      NOTE: Ces lectures sont générés à des moments faibles d'inversion parce IRM mesure la valeur de magnitude absolue ou d'images plutôt que leur valeur réelle (négatif), qui doit être pris en compte / corrigée pour ^19.
   3. Préparer un ajustement exponentiel pour chaque parcelle de l'intensité du signal pour le ROI (SI) vs temps d'inversion (T _I) tel que décrit à la section 5.2. Terrain T _I sur l'axe des x, de l'IS sur l'axe des y; ɑ et Δ sont des constantes déterminées par régression, et T ₁ ou T ₂ est la variable à résoudre:
      
      où t = T _1, T _2.
   4. Résoudre T ₁ ou T ₂ en utilisant l'équation ci-dessus et tracer l'inverse des valeurs calculées (1 / T ₁ et 1 / T ₂₎ contre les concentrations des nanoparticules utilisées dans chaque ROI.
   5. Calculer la pente du graphique linéaire quidonne le relaxivités R ₁ et R _2.
      NOTE: La section suivante du protocole décrit l'application des nanoparticules pour le marquage fluorescent et générer contraste IRM dans les cellules ciblées.

6. marquage fluorescent des cellules ciblées utilisant des nanoparticules - microscopie confocale

REMARQUE: Les nanoparticules (PB PN, PIBb, et MnPB) peut être utilisé pour marquer par fluorescence d'une population de cellules cibles (surveillées par microscopie confocale) comme suit:

1. Synthèse du nanoparticules fluorescentes
   1. Synthétiser PIBb-A488, A488-PIBb-Eot3, MnPB-A488, A488-MnPB-ANG2 pour marquage fluorescent d'une population de cellules cibles en suivant les étapes décrites dans les sections 1 et 2.
2. Préparation des cellules pour la fluorescence de ciblage
   1. Manteau pas. 1,5 micro couverture verres en les trempant dans une solution de 0,002% de poly (L-lysine) de bromhydrate de 90 min. Retirez les verres de couverture de la solution et laissez-les sécher pendant 24 heures.
   2. Graines de cellules (par exemple EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) sur les lamelles revêtues placés dans une plaque à 6 puits et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant au moins 16 heures. Rincer les cellules avec une solution PBS 1X et (en option) fixer à 10% de formaldehyde dans une solution tampon neutre pendant 15 minutes. cellules tache avec 5 uM de colorant rouge-orange de cellules infiltrant dans du PBS à 37 ° C pendant 30 min. Ensuite, rincer les cellules avec du PBS.
3. > Marquage fluorescent des cellules ciblées
   1. Ajouter 1% d'albumine de sérum bovin (BSA; dans de l'eau DI) aux cellules pour minimiser la liaison non spécifique sur les cellules, et on incube à 37 ° C pendant 1 heure.
   2. Incuber les cellules avec les nanoparticules dans 1% de BSA pendant 1 heure. Pour EoL-1: incuber avec 0,2 mg / ml PIBb-A488 ou A488-PIBb-Eot3; Pour BSG D10 et SUDIPG1: incuber avec 0,2 mg / ml MnPB A488-A488-ou-MnPB ANG2. Rincer les cellules avec du PBS 3 × pour enlever unbounanoparticules ND.
   3. Inverser délicatement le couvercle en verre (contenant des cellules et nanoparticules) sur une lame de microscope, se assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air emprisonnées. Sceller le bord entre le verre de couverture et lame de microscope en appliquant soigneusement vernis à ongles transparent. Image les cellules en utilisant un microscope confocal à balayage laser microscope.

7. marquage fluorescent des cellules ciblées utilisant des nanoparticules - cytométrie en flux

Les nanoparticules (PB IP, PIBb et MnPB) peuvent être utilisés pour marquer par fluorescence une population de cellules cibles (contrôlé par cytométrie de flux) comme suit:

1. Préparer des suspensions de cellules dans du PBS ciblés. Pour les études de culture pure, les suspensions sont constitués d'un seul type cellulaire (par exemple BSG D10); remettre en suspension un culot cellulaire de cellules D10 BSG dans du PBS à 100 000 cellules / ml (10 ml au total). Pour les études de culture mixtes, les suspensions sont constitués d'au moins deux types de cellules (par exemple EoL-1 et OE21); similaire à BSG D10, culots de cellules de remettre en suspension de EoL-1 et OE21 dans du PBS à 100 000 cellules / ml chacune (10 ml au total).
   1. Préparer des rapports variables de EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml chacun de fin de vie et OE21-1), 1: 3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
2. Bloquer les cellules (suspensions pures et mixtes) ciblé par les nanoparticules avec 2 ml de 5% de BSA pour minimiser la liaison non spécifique.
3. Ajouter 1 ml (1 mg / ml) des nanoparticules aux cellules et incuber pendant 1 heure. Pour BSG D10, incuber les cellules avec MnPB-A488, A488-MnPB-ABC (anticorps de contrôle), ou MnPB-A488-ANG2). Pour les mélanges de EoL-1 et OE21, incuber les mélanges avec un montant fixe de PIBb-A488-Eot3.
4. Rincer les cellules libres de nanoparticules non liées par filage bas les échantillons à 1000 g pendant 5 min au moins 3 × pour éliminer les particules non liées. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de PBS et fixer avec 10% de formaldéhyde dans du PBS. cellules tache en incubation avec 10 pg / ml7 D-Aminoactinomytcin dans du PBS sur de la glace pendant 30 min. Rincer avec du PBS, puis d'analyser 10 000 cellules gated de chaque échantillon en utilisant un cytomètre de flux.

8. Génération IRM contraste sur les cellules ciblées utilisant des nanoparticules

Les nanoparticules (PB PN, PIBb et MnPB) peuvent être utilisés pour générer contraste IRM (dans les deux T ₁ - T ₂ et weighted séquences) dans une population de cellules ciblées comme suit:

1. Préparation Phantom
   1. Cultiver des cellules (par exemple BSG D10) dans des flacons T75 jusqu'à ~ 80% de confluence. Utiliser le milieu et les conditions de croissance approprié. Pour BSG D10, cultiver les cellules dans du DMEM + 10% FBS + 1 x Pen-Strep à 37 ° C et 5% de CO _2.
   2. Rincer les cellules libres de milieu avec 5 ml de PBS et de bloquer les cellules avec 5 ml 1% de BSA dans PBS pendant 1 heure pour minimiser la liaison non spécifique. Ajouter 5 ml (0,5 mg / ml) aux cellules nanoparticules. Pour BSG D10, incuber les cellules avec MnPB-A488, A488-MnPB-ABC (anticorps de contrôle), et MnPB-A488-ANG2 pendant 1 heure.
   3. Rincer les cellules trois fois avec 5 ml de PBS pour éliminer les nanoparticules non liées. Trypsiniser les cellules en incubant les cellules avec 2 ml de trypsine EDTA solution à 0,25% 1 × 5 min à 37 ° C et 5% de CO ₂ pour les détacher de la fiole pour la préparation fantôme. Ajouter 8 ml de DMEM pour étancher la trypsinisation des cellules.
   4. Recueillir les cellules en leur centrifugation à 1 000 g pendant 5 min; aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de PBS et ajouter 1 ml de 10% de formaldehyde dans du PBS pour fixer les cellules. Ajouter 100 ul de chaque échantillon dans un puits séparé d'une plaque à 96 puits.
   5. Ajouter 100 pi de solution d'agarose à 1% fondu dans l'eau DI dans chaque puits et bien mélanger par pipetage de haut en bas. Laisser le gel se solidifier à 4 ° C pendant 12 heures.
      NOTE: Cela donne un fantôme contenant des cellules avec des nanoparticules attachées dans agarose solidifié.
   6. Placez le fantôme dans un aimant horizontal 3 T clinique à côté d'un bloc solide de 2% de gélose (150 cm ^{3). Fixez le fantôme et le bloc d'agar dans le centre d'une bobine de cerveau HD 8 canaux. Mesurer les temps de relaxation en utilisant 0,5 mm d'épaisseur coupes coronales à mi-hauteur de la plaque 96 puits 11.}
2. T ₁ - T ₂ et séquences pondérées
   Utilisez les paramètres suivants pour l'acquisition des séquences dans l'aimant IRM clinique:
   1. Acquérir les images T1 MR en utilisant le spin séquence suivante écho: Echo train (ET) = 1, temps de répétition (TR) = 650 ms, temps d'écho (TE) = 11 ms, la taille de la matrice = 320 x 256, Champ de vision (FOV) = 10 x 10 cm ^2.
   2. Acquérir des images T2W MR en utilisant la séquence suivante FRFSE: ET = 28; TR = 3000 msec; Te = 101 ms; taille de la matrice = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm ^2.
3. Traitement post-acquisition
   1. Pour faciliter la lecture, convertir les images d'échelle de gris d'origine en une image à l'échelle de couleur en utilisant ImageJ: Sélectionnez Image> Type de> 8-Bit, pour convertir l'image en niveaux de gris.
   2. Calculer l'intensité normalisée pour chaque échantillon après soustraction de la contribution de signal provenant de la solution d'agarose.

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Résultats

En utilisant le schéma de synthèse d'un pot, des nanoparticules de PB IP (diamètre moyen de 78,8 nm, indice de polydispersité (PDI) = 0,230; calculé par l'instrument dynamique de diffusion de la lumière), PIBb (diamètre moyen 164,2 nm, PDI = 0,102), ou MnPB ( diamètre moyen de 122,4 nm, PDI = 0,124) qui sont monodisperse (tel que mesuré par DLS) peut être synthétisé constamment (figure 2A). Les potentiels zêta mesurées des nanoparticules synthétisées sont inférieures à -30 mV <...

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Discussion

Cet article a présenté les méthodes pour la synthèse d'une nouvelle classe de multimodales, agents d'imagerie moléculaire à base de nanoparticules bleu de Prusse biofunctionalized. Les modalités d'imagerie moléculaire incorporés dans les nanoparticules sont l'imagerie de fluorescence et l'IRM moléculaire, en raison de leurs caractéristiques complémentaires. Les nanoparticules bleu de Prusse biofunctionalized ont un design noyau-enveloppe. Les principales étapes de la synthèse de ces nan...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O)	Sigma-Aldrich	P9387
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O)	Sigma-Aldrich	211591
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Sigma-Aldrich	236489
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody	Millipore	AB5320
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3	Peprotech	500-P156GBT
Neuro-2a Cell Line	ATCC	CCL-131
BSG D10 Cell Line	Lab stock	---
OE21 Cell Line	Sigma-Aldrich	96062201
SUDIPG1 Neurospheres	Lab stock	---
Eol-1 Cell Line	Sigma-Aldrich	94042252
Poly(L-lysine) hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1399
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Aminoactinomycin D	Sigma-Aldrich	A9400
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
CellTrace Calcein Red-Orange, AM	Life Technologies	C34851
Avidin-Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21370
Centrifuge	Eppendorf	5424
Peristaltic Pump	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonicator	QSonica	Q125
Hot Plate/Magnetic Stirrer	VWR	97042-642
Ultra Clean Aluminum Foil	VWR	89107-732
Vortex Mixer	VWR	58816-121
1.7 ml conical microcentrifuge tubes	VWR	87003-295
15 ml conical centrifuge tubes	VWR	21008-918
Tube holders	VWR	82024-342
Disposable plastic cuvettes	VWR	7000-590 (/586)
Zetasizer capillary cell	VWR	DTS1070
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column	VWR	82031-356
96-well cell culture tray	VWR	29442-056
Trypsin EDTA 0.25% solution 1x	JR Scientific	82702
Cell Culture Grade PBS (1x)	Life Technologies	10010023
XTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4891-025-K
T75 Flask	89092-700	VWR
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10437-010
Pen-Strep 1x	Life Technologies	15070063
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus	FV1200
Chambered Microscope Slides	Thermo Scientific	154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5	VWR	48366-227
Microscope Slides	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
FACSCalibur Flow Cytometer	BD Biosciences
3 T Clinical MRI Magnet	GE Healthcare
100 ml round-bottom flask