Biofunctionalized普鲁士蓝纳米粒子多式联运分子成像应用

摘要

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

摘要

多峰的，分子成像允许在使用多个互补的成像技术的蜂窝，亚细胞和分子水平的分辨率的生物过程的可视化。这些显像剂促进途径和机制在体内 ，这对提高诊断和治疗功效的实时评估。本文介绍的协议biofunctionalized普鲁士蓝纳米颗粒的合成（PB NPS） - 一类新的药物用于在多峰分子成像应用。在纳米颗粒，荧光成像和磁共振成像（MRI）掺入所述成像模态，具有互补的特性。该PB纳米粒具有一个核-壳的设计，其中钆和锰离子在PB晶格的间隙空间内掺入产生MRI对比，二者T中₁和T ₂ -加权序列。该PB纳米粒涂覆有荧光抗生物素蛋白使用静电自如sembly，使荧光成像。该抗生物素蛋白涂覆的纳米颗粒修饰赋予分子的定位功能，以纳米颗粒的生物素化配体。纳米粒子的稳定性和毒性测定，以及它们的核磁共振驰豫。这些biofunctionalized PB纳米颗粒的多，分子成像能力，然后利用他们为荧光成像和体外分子MRI表现。

引言

分子成像是生物过程在细胞，亚细胞和分子水平¹的非侵入性的和有针对性的可视化。分子成像允许样品保持其天然的微环境，而其内源性途径和机制实时进行评估。通常情况下，分子成像涉及小分子，大分子，或纳米粒子可视化，目标，和跟踪有关的生理过程的形式的外源成像剂被研究²的管理。已探索了在分子成像的各种成像方式包括MRI，CT，PET，SPECT，超声，光声学，拉曼光谱，生物发光，荧光和活体显微镜^3。多峰成像是两种或多种成像模态，其中所述组合增强可视化和表征的各种生物过程和事件⁴的能力相结合。 Multimoda升成像利用的各个成像技术的优势，同时补偿其个人的局限性^3。

本文介绍的协议biofunctionalized普鲁士蓝纳米颗粒的合成（PB NPS） - 一类新的多峰分子成像剂。该PB纳米颗粒被用于荧光成像和分子MRI。 PB是颜料由交替铁（II）和铁（III）中的原子面心立方网络（ 图1）。该PB晶格是由在铁^二线性氰化物配体- CN -铁^三连杆并入阳离子来平衡其三维网络⁵内的收费。 PB的掺入阳离子成其晶格的能力是由分别装入钆和锰离子进入该PB纳米粒为MRI造影利用。

对于追求纳米设计的MRI造影的基本原理是因为优点这种设....

研究方案

1.合成PB纳米粒子，GdPB和MnPB的

的纳米颗粒（纳米颗粒的PB，GdPB或MnPB）的合成是使用一釜合成方案通过执行下面详述的步骤来实现的：

1. 制备溶液“A”含有在去离子（DI）水加入5ml的5mM亚铁氰化钾（II）中。取决于纳米颗粒的类型被合成 - PB纳米粒，GdPB或MnPB，制备溶液“B”，如下所示：
   1. 为 PB纳米粒：制备10ml含有2.5mM的铁（III），氯化在去离子水中的溶液。
   2. 对于GdPB纳米粒：制备10ml含有2.5mM的每种钆（Ⅲ）硝酸盐，铁（III），氯化在DI水中的溶液
   3. 对于MnPB纳米粒：制备10ml含有2.5mM的每种锰（II），氯化铁（III），氯化在DI水中的溶液。
2. 溶液“B”添加到一个圆底烧瓶中，并在室温下搅拌该烧瓶内容物（RT）和1000转。添加解决方案'A'逐滴成圆底含液瓶'B'。控制流速通过蠕动泵设置为分配约10毫升/ hr的加入溶液“A”至“B”。
3. 继续以1,000rpm在室温加入溶液“A”到“B”之后搅拌另外的30分钟，就完成了。停止搅拌，收集混合物。
4. 转移混合物的等分试样到微量离心管中以冲洗游离的未反应成分的纳米颗粒。添加5M的氯化钠（0.2毫升氯化钠/毫升反应混合物）至每个等分试样离心，以协助粒子集合。

结果

使用一锅合成方案中，纳米粒子的PB纳米粒（平均直径78.8纳米，多分散性指数（PDI）= 0.230;通过动态光散射仪器来计算），GdPB（平均直径164.2纳米，PDI = 0.102），或MnPB（平均直径122.4纳米，PDI = 0.124），它们是单分散（如通过DLS测得的）可以被一致地合成（ 图2A）。合成纳米颗粒的测得的ζ电位小于-30毫伏（ 图2B），这表明基于它们的表面电荷的粒子的适度稳定性。合成的?.......

讨论

本文提出的方法为一类新的基于biofunctionalized普鲁士蓝纳米颗粒的多峰分子成像剂的合成。掺入纳米颗粒中的分子成像模式是荧光成像和分子MRI检查，由于它们的互补特征。该biofunctionalized普鲁士蓝纳米粒子具有核 - 壳设计。在这些纳米颗粒的合成中的关键步骤是：1）一釜合成这产生了被包括普鲁士蓝纳米颗粒的核心（PB NPS），含钆普鲁士蓝纳米颗粒（GdPB），或含锰普鲁士蓝纳米颗粒（MnPB），2?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6 · 3H2O)	Sigma-Aldrich	P9387
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2 · 4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3 · 6H2O)	Sigma-Aldrich	211591
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3 · 6H2O)	Sigma-Aldrich	236489
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody	Millipore	AB5320
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3	Peprotech	500-P156GBT
Neuro-2a Cell Line	ATCC	CCL-131
BSG D10 Cell Line	Lab stock	---
OE21 Cell Line	Sigma-Aldrich	96062201
SUDIPG1 Neurospheres	Lab stock	---
Eol-1 Cell Line	Sigma-Aldrich	94042252
Poly(L-lysine) hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1399
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Aminoactinomycin D	Sigma-Aldrich	A9400
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
CellTrace Calcein Red-Orange, AM	Life Technologies	C34851
Avidin-Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21370
Centrifuge	Eppendorf	5424
Peristaltic Pump	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonicator	QSonica	Q125
Hot Plate/Magnetic Stirrer	VWR	97042-642
Ultra Clean Aluminum Foil	VWR	89107-732
Vortex Mixer	VWR	58816-121
1.7 mL conical microcentrifuge tubes	VWR	87003-295
15 mL conical centrifuge tubes	VWR	21008-918
Tube holders	VWR	82024-342
Disposable plastic cuvettes	VWR	7000-590 (/586)
Zetasizer capillary cell	VWR	DTS1070
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column	VWR	82031-356
96-well cell culture tray	VWR	29442-056
Trypsin EDTA 0.25% solution 1X	JR Scientific	82702
Cell Culture Grade PBS (1X)	Life Technologies	10010023
XTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4891-025-K
T75 Flask	89092-700	VWR
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10437-010
Pen-Strep 1X	Life Technologies	15070063
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus	FV1200
Chambered Microscope Slides	Thermo Scientific	154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5	VWR	48366-227
Microscope Slides	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
FACSCalibur Flow Cytometer	BD Biosciences
3 T Clinical MRI Magnet	GE Healthcare
100 mL round-bottom flask