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Resumen

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Resumen

Multimodal, la imagen molecular permite la visualización de los procesos biológicos a resoluciones celulares, subcelulares, ya nivel molecular utilizando múltiples técnicas de imagen complementarias. Estos agentes de formación de imágenes facilitan la evaluación en tiempo real de las vías y mecanismos in vivo, que mejoran tanto la eficacia diagnóstica y terapéutica. En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis de nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas (PB PN) - una nueva clase de agentes para su uso en aplicaciones de imágenes multimodales, molecular. Las técnicas de imagen incorporados en el nanopartículas, imágenes de fluorescencia y la resonancia magnética (MRI), tienen características complementarias. Los PN PB poseen un diseño de núcleo-corteza donde gadolinio y iones de manganeso incorporados dentro de los espacios intersticiales de la red PB generan contraste MRI, tanto en T1 y T2 y secuencias. Los PN PB están recubiertas con avidina fluorescente usando electrostática auto comoblea, que permite imágenes de fluorescencia. Las nanopartículas recubiertas con avidina se modifican con ligandos biotinilados que confieren posibilidades de marketing moleculares a las nanopartículas. La estabilidad y la toxicidad de las nanopartículas se miden, así como sus capacidades de relajación de MRI. Las capacidades de imágenes multimodales, moleculares de estas biofuncionalizadas PN PB luego se demostraron utilizándolos para imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular in vitro.

Introducción

La imagen molecular es la visualización no invasiva y precisa de los procesos biológicos a nivel celular, subcelular, y los niveles moleculares 1. La imagen molecular permite un espécimen a permanecer en su microambiente nativo mientras que sus vías y mecanismos endógenos son evaluados en tiempo real. Típicamente, la imagen molecular implica la administración de un agente de imagen exógeno en forma de una pequeña molécula, macromolécula, o nanopartículas para visualizar, objetivo, y trazar procesos fisiológicos pertinentes se está estudiando 2. Las diversas modalidades de imagen que se han explorado en imagen molecular incluyen MRI, CT, PET, SPECT, ultrasonido, photoacoustics, espectroscopia Raman, la bioluminiscencia, la fluorescencia y microscopía intravital 3. Multimodal de imágenes es la combinación de dos o más modalidades de imagen donde la combinación mejora la capacidad de visualizar y caracterizar diversos procesos y eventos 4 biológicos. Multimodal de imágenes explota las ventajas de las técnicas de formación de imágenes individuales, mientras que la compensación de sus limitaciones individuales 3.

En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis de nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas (PB PN) - una nueva clase de agentes de imágenes multimodales, molecular. Los PN PB se utilizan para obtener imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular. PB es un pigmento que consiste de la alternancia de hierro (II) y hierro (III) átomos en una red cúbica centrada en las caras (Figura 1). La celosía PB se compone de ligandos cianuro lineales en una Fe II - CN - vinculación Fe III que incorpora cationes para equilibrar las cargas dentro de su red tridimensional 5. La capacidad de PB incorporar cationes en su celosía se explota mediante la carga por separado gadolinio y iones de manganeso en los PN PB para el contraste de resonancia magnética.

La razón fundamental para la consecución de un diseño de nanopartículas para el contraste RM es debidolas ventajas de este diseño ofrece en relación con los agentes de contraste MRI actuales. La gran mayoría de agentes de contraste MRI aprobados por la FDA de Estados Unidos son quelatos de gadolinio que son paramagnéticos en la naturaleza y proporcionan contraste positivo por el mecanismo de relajación 6,7,8-spin celosía. En comparación con un solo gadolinio-quelato que proporciona baja intensidad de señal por sí mismo, la incorporación de múltiples iones de gadolinio dentro de la red PB de las nanopartículas proporciona una mayor intensidad de la señal (contraste positivo) 3,9. Además, la presencia de múltiples iones de gadolinio dentro de la red PB aumenta la densidad de espín general y la magnitud de paramagnetismo de las nanopartículas, que perturba el campo magnético local en su vecindad, generando de ese modo contraste negativo por el mecanismo de relajación espín-espín. Así, las nanopartículas que contienen gadolinio funcionar tanto como T 1 (positivo) y T 2 agentes de contraste (negativo) 10,11.

En un subgrupo de pacientes con insuficiencia renal, la administración de agentes de contraste con gadolinio se ha relacionado con el desarrollo de fibrosis sistémica nefrogénica 8,12, 13. Esta observación ha llevado a investigaciones sobre el uso de iones paramagnéticos alternativos como agentes de contraste para MRI. Por lo tanto, el diseño versátil de las nanopartículas está adaptado para incorporar iones de manganeso dentro de la red PB. Similar a gadolinio quelatos, manganeso quelatos también son paramagnéticos y se utilizan normalmente para proporcionar una intensidad de señal positiva en la RM 7,14. Al igual que con gadolinio PB PN, las PB PN contienen manganeso también funcionan como T 1 (positivo) y T 2 agentes de contraste (negativo).

Para incorporar capacidades de formación de imágenes de fluorescencia, la nanopartícula "núcleos" se recubren con una cáscara "biofuncional" que consiste en la avidina marcada con fluorescencia-glicoproteína (Figura 1). Avidina no sólo permite imágenes de fluorescencia, sino que también sirve como una plataforma de acoplamiento para ligandos biotinilados que se dirigen a las células y tejidos específicos. La unión de avidina-biotina es una de las más fuertes enlaces conocidos, no covalentes caracterizadas por extremadamente fuerte afinidad de unión entre avidina y biotina 15. La unión de ligandos biotinilados a la avidina-revestido PB PN confiere posibilidades de marketing moleculares a los PN PB.

La motivación para la búsqueda de imágenes de fluorescencia y MR usando PB PN se debe a que estas técnicas de imagen poseen características complementarias. Imágenes de fluorescencia es una de las técnicas de imagen molecular óptica más utilizado, y permite la visualización simultánea de múltiples objetos a altas sensibilidades 1,16,17. Imágenes de fluorescencia es una modalidad segura, no invasiva, pero se asocia con bajas profundidades de penetración y resoluciones espaciales 1,3,16. Por otro lado, MRI genera un alto temporald resolución espacial de forma no invasiva y sin necesidad de radiación ionizante 1,3,16. Sin embargo MRI sufre de baja sensibilidad. Por lo tanto, imágenes de fluorescencia y la RM fueron seleccionadas como las técnicas de imagen molecular, debido a sus características complementarias de penetración de profundidad, sensibilidad y resolución espacial.

En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis y biofuncionalización de los PN PB, PB PN (GdPB), y que contiene gadolinio-PB PN (MnPB) 10,11 que contiene manganeso. Los siguientes métodos se describen: 1) medición del tamaño, la carga y la estabilidad temporal de las nanopartículas, 2) Evaluación de la citotoxicidad de las nanopartículas, 3) de medición de relaxividades MRI, y 4) la utilización de las nanopartículas para la fluorescencia y la RM molecular de una población de células diana in vitro. Estos resultados demuestran el potencial de los NPs para uso como agentes de formación de imágenes multimodales, moleculares in vivo.

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Protocolo

1. Síntesis de PB PN, GdPB y MnPB

Síntesis de las nanopartículas (PB PN, GdPB o MnPB) se consigue utilizando un esquema de síntesis en un solo recipiente realizando los pasos que se detallan a continuación:

  1. Prepare la solución de 'A' que contiene 5 ml de 5 hexacianoferrato de potasio mM (II) en agua desionizada (DI). Dependiendo del tipo de nanopartícula se sintetizaron - PB PN, GdPB o MnPB, prepare una solución "B" de la siguiente manera:
    1. Para PB NPs: Preparar 10 ml de una solución que contiene 2,5 mM de hierro (III) cloruro en agua DI.
    2. Para GdPB NPs: preparar 10 ml de una solución que contiene 2,5 mM de cada uno de gadolinio (III) nitrato y hierro (III) cloruro en agua DI
    3. Para MnPB NPs: preparar 10 ml de una solución que contiene 2,5 mM de cada uno de manganeso (II) cloruro y hierro (III) cloruro en agua DI.
  2. Añadir solución "B" a un matraz de fondo redondo, y revolver el contenido del matraz a temperatura ambiente (RT) y1000 rpm. Añadir solución 'A' gota a gota en el fondo redondo frasco que contiene la solución 'B'. Controlar el caudal de la adición de la solución 'A' a 'B' por una bomba peristáltica establecido para dispensar aproximadamente 10 ml / h.
  3. Continuar agitación a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 30 minutos después de la adición de solución de 'A' a 'B' se ha completado. Detener la agitación y recoger la mezcla.
  4. Transferir alícuotas de la mezcla en tubos de microcentrífuga para enjuagar las nanopartículas libre de componentes que no han reaccionado. Añadir NaCl 5 M (0,2 ml de NaCl mezcla de reacción / ml) a cada alícuota para ayudar en la recogida de partículas por centrifugación.
  5. Centrífuga de cada alícuota de nanopartículas durante al menos 10 minutos a 20.000 x g. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante.
  6. Resuspender cada pastilla de nanopartículas en agua DI 1 ml a través de ultrasonidos utilizando una micropunta (pulso de ultrasonidos on / off = 1.1 seg, amplitud = 50%, duración =5 seg, potencia de ultrasonidos calificación = 125 W) para romper la pastilla.
  7. Repetir los pasos 1.4 a 1.6 al menos 3 × para asegurar que las nanopartículas están libres de componentes de los subproductos de reacción y de reacción inicial. Después de la centrifugación final, resuspender las partículas en agua DI 1 ml.

2. Biofuncionalización de PB PN, GdPB y MnPB

Biofuncionalización de las nanopartículas consiste en el revestimiento de las nanopartículas "núcleos" con avidina y la adición de ligandos biotinilados como se describe a continuación:

  1. Recubrimiento de las nanopartículas con avidina fluorescente
    Recubrimiento de las nanopartículas con avidina fluorescente se consigue utilizando auto-ensamblaje electrostática donde cargado positivamente avidina (pI ~ 10.5) está revestida en al cargado negativamente nanopartículas de la siguiente manera 18:
    1. Preparar suspensiones de los PN PB, GdPB o MnPB en agua DI 1 ml. Filtra Alexa Fluor 488-etiquetados avidina (A488; reconstituido en agua DI)a través de un filtro de nylon de microcentrífuga de 0,2 micras, con 14.000 × g durante 10 min. Añadir ≤0.2 mg avidina / mg nanopartículas. Añadir los líquidos filtrados de A488 por separado a las alícuotas de PB PN, GdPB o MnPB.
    2. Póngase en contacto con las nanopartículas con A488 durante 2-4 horas con agitación suave o rotación a 4 ° C. Proteja las muestras de la luz utilizando papel de aluminio.
      NOTA: Este A488 rendimientos paso recubierto PB PN (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), y MnPB (MnPB-A488).
  2. La unión de anticuerpos con biotina
    La unión de los anticuerpos dirigidos biotina en el nanopartículas recubiertas con avidina se logra mediante interacciones avidina-biotina de la siguiente manera:
    1. Preparar suspensiones de los avidina recubierto las nanopartículas - PB-A488, GdPB-A488, y MnPB-A488 en agua DI 1 ml. Filtra anticuerpo biotinilado (suministrada por el fabricante) a través de un filtro de microcentrífuga de 0,2 micras nylon a 14.000 × g durante 10 min.
      NOTA: En este sentido, el presente estudio utiliza biotinylated anti-neurona-glía antígeno 2 (ANG2) que se dirige a NG2 sobreexpresa en las células y tejidos del sistema nervioso central y biotinilado eotaxina-3 anti-humana (Eot3) que se dirige a los receptores sobreexpresados ​​en los eosinófilos o líneas de células eosinófilas.
    2. Añadir cada alícuota filtrada de anticuerpo biotinilado por separado a las alícuotas de las nanopartículas recubiertas con avidina. Añadir ≤0.05 mg nanopartículas de anticuerpos / mg de avidina-revestido biotinilado. Póngase en contacto con las nanopartículas recubiertas con avidina con los anticuerpos con biotina (Ang2 o Eot3) para 2-4 horas con agitación suave o rotación a 4 ° C. Proteja las muestras de la luz utilizando papel de aluminio.
      NOTA: Este anticuerpo rendimientos paso nanopartículas recubiertas (por ejemplo GdPB-A488-Eot3 y MnPB-A488-Ang2).

3. Dimensionamiento, Potencial Zeta, y Temporal de estabilidad de las nanopartículas

La distribución de tamaño, carga, y la estabilidad de las nanopartículas se miden utilizando dinámicamétodos de dispersión de luz (DLS) como se describe a continuación:

  1. Dimensionamiento de las nanopartículas
    Dimensionamiento de las nanopartículas se consigue utilizando dispersión dinámica de luz como sigue:
    1. Añadir 10 l de la muestra de nanopartículas (1 mg / ml) a 990 l de agua DI en una cubeta de plástico desechable.
      NOTA: Este es el valor representativo para una buena señal de DLS.
    2. Tapar la cubeta y agitar para mezclar bien. Colocar la cubeta en un sistema utilizado para analizar el tamaño de partícula con el fin de medir el tamaño de las nanopartículas. Realizar análisis de tamaño de partícula en un ángulo de medición de 173 °.
  2. Potencial Zeta de las nanopartículas
    Zeta potencial de las nanopartículas se mide usando el análisis de fase de dispersión de luz como sigue:
    1. Añadir 100 l de la muestra de nanopartículas (1 mg / ml) a 900 l de agua DI en una célula capilar de plástico desechable. Este valor es representativo para una buena medición del potencial zeta.
    2. Coloque el capilary celular en un sistema utilizado para analizar el potencial zeta con el fin de medir el potencial zeta de las nanopartículas utilizando los parámetros por defecto a 25 ° C.
  3. Estabilidad temporal de las nanopartículas
    La estabilidad temporal de las nanopartículas se mide utilizando dispersión dinámica de luz como sigue:
    1. Evaluar la estabilidad de las nanopartículas mediante la medición de los tamaños de las nanopartículas en agua DI, así como medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) como se describe en el apartado 3.1.
    2. Repetir las mediciones de tamaño en el agua DI y DMEM una vez / día durante un período de 5 días.

4. La citotoxicidad de las nanopartículas

La citotoxicidad de las nanopartículas se mide usando un ensayo de proliferación celular XTT como sigue:

  1. Semilla 10.000-15.000 células / pocillo de cada tipo de células estudiadas (Neuro2a, BSG D10, EoL-1, y OE21) en una placa de 96 pocillos. Asegúrese de que el volumen total de células sembradas no EXceed 0,2 ml / pocillo. Incubar las células sembradas toda la noche a 37 ° C y 5% de CO 2.
  2. Ponerse en contacto con las nanopartículas con las células:
    1. Se incuban las células con concentraciones variables de nanopartículas (0,01-0,5 mg / ml). Consulte la Tabla 1 como una mesa representativa que se describen las cantidades de las nanopartículas (de 50 l) a las células después de la eliminación de 50 l de medio / pocillo.
      1. Para tener en cuenta cualquier absorbancia interferir de las nanopartículas en el ensayo, agregar un espacio en blanco que consiste en la concentración adecuada de nanopartículas (0-0,5 mg / ml, en equivalencia a los importes añadidos a las células) a medio sin células.
    2. Se incuban las células con nanopartículas durante la noche a 37 ° C y 5% de CO 2. Aspirar los medios de comunicación de cada bien y enjuague con tampón de tinción compuesto por suero bovino fetal al 5% (FBS) en solución amortiguadora de fosfato (PBS). Añadir 100 l de medio sin rojo de fenol y se incuba a CO 2 37 ° C y 5%de 16 a 18 h.
  3. Preparar la solución de trabajo Ensayo de proliferación XTT de la célula mediante la mezcla de los componentes del kit de reactivos XTT (XTT y activador) según las especificaciones del fabricante. Aspirar los medios de comunicación de los pocillos y añadir 100 l de RPMI (RPMI w / o fenol 10% de SFB rojos + + 1 × Pen-Strep) o medio apropiado para el tipo de células estudiado. Añadir 50 l de solución de trabajo de XTT a cada pocillo e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2-2,5 h.
  4. Medir la absorbancia a 490 nm, con una longitud de onda de referencia de 630 nm para corregir las huellas o manchas. Calcular la absorbancia corregida para cada pozo (A 490-A 630) y promedio de las lecturas de repeticiones.
  5. Restar las lecturas en blanco de cada valor bien para calcular los valores de absorbancia corregidos finales. Calcular el porcentaje de supervivencia para cada muestra por la normalización de la absorbancia final corregido a la de las células no tratadas y sin nanopartículas. Terreno Doporcentaje rvival como una función de la concentración de nanopartículas.

5. MRI capacidades de relajación de los PN PB, GdPB y MnPB

MRI de relajación se mide usando T 1 - y la secuencia T2 y por la preparación de un "fantasma" MRI utilizando una placa de 96 pocillos que contiene nanopartículas como se describe a continuación:

  1. Preparación Phantom
    1. Preparar una placa de 96 pocillos conteniendo cada pocillo 100 nanopartículas mu l (PB PN, GdPB o MnPB) a la concentración adecuada. Comenzando con una concentración de 0,4 mM para cada tipo de nanopartícula, en serie diluir las nanopartículas 2 × usando agua DI hasta una concentración de 2,4 × 10 -5 M se alcanza (esto requiere 14 diluciones y 15 pozos).
    2. Añadir 100 l de solución de agarosa fundida al 1% en agua DI en cada pocillo y mezclar bien. Deje que el gel solidifique a 4 ° C durante 12 h.
      NOTA: Esto produce un fantasma que contiene diluciones en serie delas nanopartículas en agarosa solidificada.
    3. Coloque el fantasma en una horizontal 3 T imán clínica bajo un bloque sólido de 2% de agar (150 cm 3). Asegurar el fantasma y el bloque de agar en el centro de una bobina de cerebro HD de 8 canales. Medir los tiempos de relajación utilizando 0,5 mm de espesor cortes coronales en la mitad de la altura de la placa de 96 pocillos 11.
  2. T 1 - y la secuencia T2
    Utilice los siguientes valores representativos para la adquisición de las secuencias en el imán clínica.
    NOTA: Estos valores están optimizados para las nanopartículas utilizadas en el presente estudio:
    1. Adquirir T 1 ponderadas imágenes (T1W) MR usando la siguiente recuperación de fluido inversión atenuada (FLAIR) secuencia: Echo de tren (ET) = 8, el tiempo de repetición (TR) = 2300 ms, tiempo de eco (TE) = 24,4 ms, el tamaño de la matriz = 512 x 224, campo de visión (FOV) = 16 x 16 cm 2.
    2. Adquirir T 2 ponderadas imágenes (T2W) MR usando la siguiente relaxa rápidorápida secuencia de la spin eco (FRFSE): ET = 21; TR = 3500 ms; TE = 104 mseg; Tamaño de la matriz = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm 2.
    3. Adquirir T1W y T2W MR imágenes a 127 MHz (3 T) en los siguientes horarios de inversión: 50, 177, 432, 942, 1.961 y 4.000 ms.
  3. Medir las capacidades de relajación MRI
    1. Después de adquirir T1W y T2W imágenes usando las secuencias descritas en la sección 5.2, medir la intensidad de la señal para cada pozo usando ImageJ, en adelante designada como la región de interés (ROI) mediante la selección de cada ROI usando el botón ovalado cultivo se encuentra en la barra de herramientas principal, a continuación, seleccionando Análisis> Medida.
      NOTA: Un pop-up debe mostrar la intensidad de la señal media de cada ROI bajo la columna "Media".
    2. Para cada ROI, trazar la intensidad de la señal medida en contra de su inversión de tiempo específico. Si es necesario, los puntos invertidos (lecturas) que generan una "burbuja" inicial o valores atípicos en el comienzo de la trama (inversión más bajaveces).
      NOTA: Estas lecturas se generan a veces bajas de inversión porque MRI mide el valor de magnitud o absoluta de imágenes en lugar de su valor real (negativo), que debe tenerse en cuenta / corregido para 19.
    3. Preparar un ajuste exponencial para cada parcela de intensidad de la señal para el rendimiento de la inversión (SI) vs. tiempos de inversión (T I) como se describe en el apartado 5.2. Parcela T I en el eje x, SI en el eje y; ɑ y Δ son constantes determinadas por regresión, y T 1 o T 2 es la variable que hay que resolver:
      figure-protocol-13725
      donde t = T 1, T 2.
    4. Resuelve para T 1 o T 2 usando la ecuación anterior y trazar la inversa de los valores calculados (1 / T 1 y 1 / T 2) contra las concentraciones de las nanopartículas utilizadas en cada ROI.
    5. Calcular la pendiente de la gráfica lineal quelos rendimientos de las capacidades de relajación R1 y R2.
      NOTA: La siguiente sección del protocolo describe la aplicación de las nanopartículas para el marcaje fluorescente y la generación de contraste de RMN en las células diana.

6. El etiquetado fluorescente de células dirigidas Utilizando el Nanopartículas - Microscopía Confocal

NOTA: Las nanopartículas (NP PB, GdPB, y MnPB) se puede utilizar para etiquetar fluorescentemente una población de células diana (monitorizada por microscopía confocal) como sigue:

  1. Síntesis de la fluorescente Nanopartículas
    1. Sintetizar GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 para el marcaje fluorescente de una población de células diana siguiendo los pasos que se detallan en los apartados 1 y 2.
  2. Preparación de las células para Fluorescencia Orientación
    1. Escudo no. 1.5 micro cubreobjetos sumergiéndolos en una solución de 0,002% de poli (L-lisina) bromhidrato de 90 min. Retire las cubiertas de vidrio de la solución y dejar que se sequen durante 24 horas.
    2. Las semillas de las células (por ejemplo EoL-1, D10 BSG, SUDIPG1) en las cubiertas de vidrio recubiertos colocados en una placa de 6 pocillos e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante al menos 16 horas. Enjuagar las células con una solución de 1 × PBS y (opcional) fijar con 10% de formaldehído en solución tampón neutro durante 15 min. Las células se tiñen con tinte rojo-naranja 5 mM de células permeant en PBS a 37 ° C durante 30 minutos. Posteriormente, lavar las células con PBS.
  3. > Marcaje fluorescente de células diana
    1. Añadir 1% de albúmina de suero bovino (BSA; en agua DI) a las células para minimizar la unión no específica en las células, y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
    2. Se incuban las células con las nanopartículas en 1% de BSA durante 1 hora. Para EoL-1: incubar con 0,2 mg / ml GdPB-A488 o GdPB-A488-Eot3; Para BSG D10 y SUDIPG1: incubar con 0,2 mg / ml MnPB-A488 o MnPB-A488-ANG2. Enjuague las células con PBS 3 x para eliminar unbounanopartículas nd.
    3. Invertir con cuidado la cubierta de vidrio (que contiene células y nanopartículas) en un portaobjetos de microscopio, asegurándose de que no haya burbujas de aire atrapadas. Selle el borde entre la cubierta de vidrio y portaobjetos de microscopio aplicando cuidadosamente esmalte de uñas transparente. Imagen de las células utilizando un microscopio láser confocal de barrido.

7. Etiquetado fluorescente de células dirigidas Utilizando el Nanopartículas - Citometría de Flujo

Las nanopartículas (PB NPs, GdPB, y MnPB) se pueden utilizar para la etiqueta fluorescente una población de células diana (monitorizada por citometría de flujo) como sigue:

  1. Preparar suspensiones de las células en la mira en PBS. Para estudios de cultivos puros, las suspensiones constan de un solo tipo de células (por ejemplo, BSG D10); resuspender un sedimento celular de las células D10 BSG en PBS a 100.000 células / ml (10 ml en total). Para los estudios de cultivo mixto, las suspensiones constan de al menos dos tipos de células (por ejemplo EoL-1 y OE21); similar a D10 BSG, sedimentos celulares resuspender de EoL-1 y OE21 en PBS a 100.000 células / ml cada una (10 ml en total).
    1. Preparar relaciones variables de EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml cada uno de EoL-1 y OE21), 1: 3 (0,5 ml EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
  2. Bloquee las células (suspensiones puras y mixtas) en la mira de las nanopartículas con 2 ml de BSA al 5% para minimizar la unión no específica.
  3. Añadir 1 ml (1 mg / ml) nanopartículas a las células y se incuba durante 1 hr. Para BSG D10, incubar las células con MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticuerpo de control), o MnPB-A488-ANG2). Para las mezclas de EoL-1 y OE21, incubar las mezclas con una cantidad fija de GdPB-A488-Eot3.
  4. Enjuagar las células libres de nanopartículas no unidos desacelerándose las muestras a 1000 × g durante 5 min al menos 3 × para eliminar las partículas no unidas. Resuspender las células en 1 ml de PBS y fijar con 10% de formaldehído en PBS. Células de tinción por incubación con 10 mg / ml7-Aminoactinomytcin D en PBS en hielo durante 30 min. Enjuagar con PBS, a continuación, analizar 10.000 células cerradas de cada muestra utilizando un citómetro de flujo.

8. Generación de resonancia magnética de contraste sobre las células que se hayan empleado las nanopartículas

Las nanopartículas (NP PB, GdPB, y MnPB) se pueden utilizar para generar contraste MRI (en ambos T 1 - y la secuencia T2) en una población de células diana de la siguiente manera:

  1. Preparación Phantom
    1. Se cultivan las células (por ejemplo BSG D10) en matraces T75 hasta ~ 80% de confluencia. Utilice medio y condiciones de cultivo adecuado. Para BSG D10, crecer las células en DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep a 37 ° C y 5% de CO 2.
    2. Enjuague libre de medio de células con 5 ml de PBS y bloquear las células con 5 ml 1% de BSA en PBS durante 1 hr para minimizar la unión no específica. Añadir 5 ml (0,5 mg / ml) nanopartículas a las células. Para BSG D10, incubar las células con MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticuerpo de control), y MnPB-A488-ANG2 durante 1 hora.
    3. Enjuague las células 3 veces con 5 ml de PBS para eliminar las nanopartículas no consolidados. Tripsinizar las células por incubación de las células con 2 ml de tripsina EDTA solución de 0,25% 1 × para 5 min a 37 ° C y 5% de CO 2 para separarlas del matraz para la preparación fantasma. Añadir 8 ml de DMEM para saciar el tratamiento con tripsina de las células.
    4. Recoger las células por centrifugación ellos en 1000 × g durante 5 min; Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de PBS y se añade 1 ml de formaldehído al 10% en PBS para fijar las células. Añadir 100 l de cada muestra a un pocillo separado de una placa de 96 pocillos.
    5. Añadir 100 l de solución de agarosa fundida al 1% en agua DI en cada pocillo y mezclar bien pipeteando arriba y abajo. Deje que el gel solidifique a 4 ° C durante 12 h.
      NOTA: Esto produce un fantasma que contiene células con nanopartículas adjuntos en agarosa solidificada.
    6. Coloque el fantasma en una horizontal 3 T imán clínica al lado de un bloque sólido de 2% de agar (150 cm 3). Asegurar el fantasma y el bloque de agar en el centro de una bobina de cerebro HD de 8 canales. Medir los tiempos de relajación utilizando 0,5 mm de espesor cortes coronales a media altura de la placa de 96 pocillos 11.
  2. T 1 - y la secuencia T2
    Utilice los siguientes parámetros para la adquisición de las secuencias en la clínica MRI imán:
    1. Adquirir imágenes T1W MR mediante la siguiente secuencia de eco de espín: Echo de tren (ET) = 1, tiempo de repetición (TR) = 650 ms, tiempo de eco (TE) = 11 ms, el tamaño de la matriz = 320 x 256, Campo de visión (FOV) = 10 x 10 cm 2.
    2. Adquirir imágenes T2W MR utilizando la siguiente secuencia FRFSE: ET = 28; TR = 3000 ms; TE = 101 mseg; Tamaño de la matriz = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm 2.
  3. Procesamiento posterior a la adquisición
    1. Para facilitar la lectura, convertir las imágenes originales de escala de grises de una imagen en escala de color utilizando ImageJ en: Seleccione Imagen> Tipo> 8-Bit, para convertir la imagen a escala de grises.
    2. Calcular la intensidad normalizada para cada muestra después de restar la contribución de la señal de la solución de agarosa.

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Resultados

Usando el esquema de síntesis en un solo recipiente, las nanopartículas de Pb NPs (diámetro medio de 78,8 nm, índice de polidispersidad (PDI) = 0,230; calculada por el instrumento de dispersión de luz dinámica), GdPB, o MnPB (diámetro de 164,2 nm, PDI = 0,102 significa) ( diámetro medio 122,4 nm, PDI = 0,124) que son monodispersas (medido por DLS) se puede sintetizar constantemente (Figura 2A). Los potenciales zeta medidos de las nanopartículas sintetizadas están a menos de -30 mV (Fig...

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Discusión

Este artículo ha presentado los métodos para la síntesis de una nueva clase de agentes formadores de imágenes multimodales, moleculares basados ​​en nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas. Las técnicas de imagen molecular incorporados en las nanopartículas son imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular, debido a sus características complementarias. Las nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas tienen un diseño de núcleo-corteza. Los pasos clave en la síntesis de estas n...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O)Sigma-AldrichP9387
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)Sigma-Aldrich221279
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O)Sigma-Aldrich211591
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)Sigma-Aldrich236489
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate AntibodyMilliporeAB5320
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3Peprotech500-P156GBT
Neuro-2a Cell LineATCCCCL-131
BSG D10 Cell LineLab stock---
OE21 Cell LineSigma-Aldrich96062201
SUDIPG1 NeurospheresLab stock---
Eol-1 Cell LineSigma-Aldrich94042252
Poly(L-lysine) hydrobromideSigma-AldrichP1399
FormaldehydeSigma-AldrichF8775
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
Aminoactinomycin DSigma-AldrichA9400
Triton X-100Sigma-AldrichX100
CellTrace Calcein Red-Orange, AMLife TechnologiesC34851
Avidin-Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21370
CentrifugeEppendorf5424
Peristaltic PumpInstechP270
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600
SonicatorQSonicaQ125
Hot Plate/Magnetic StirrerVWR97042-642
Ultra Clean Aluminum FoilVWR89107-732
Vortex MixerVWR58816-121
1.7 ml conical microcentrifuge tubesVWR87003-295
15 ml conical centrifuge tubesVWR21008-918
Tube holdersVWR82024-342
Disposable plastic cuvettesVWR7000-590 (/586)
Zetasizer capillary cellVWRDTS1070
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin columnVWR82031-356
96-well cell culture trayVWR29442-056
Trypsin EDTA 0.25% solution 1xJR Scientific82702
Cell Culture Grade PBS (1x)Life Technologies10010023
XTT Cell Proliferation Assay KitTrevigen4891-025-K
T75 Flask89092-700VWR
Dulbecco's Modified Eagle's MediumBiowhitaker12-604Q
Fetal Bovine SerumLife Technologies10437-010
Pen-Strep 1xLife Technologies15070063
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning MicroscopeOlympusFV1200
Chambered Microscope SlidesThermo Scientific154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5VWR48366-227
Microscope SlidesVWR16004-368
RPMISigma-AldrichR8758 
AgaroseSigma-AldrichA9539 
FACSCalibur Flow CytometerBD Biosciences
3 T Clinical MRI MagnetGE Healthcare
100 ml round-bottom flask

Referencias

  1. Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
  2. Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
  3. James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
  4. Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
  5. Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
  6. Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , National Center for Biotechnology Information. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330 (2004).
  7. Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
  8. Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
  9. Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do's and don't's. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
  10. Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
  11. Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
  12. Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
  13. Information on Gadolinium-Based Contrast Agents. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm (2013).
  14. Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
  15. Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
  16. Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
  17. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).
  18. Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
  19. Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. Duke Review of MRI Principles. 304, Mosby. Philadelphia, PA. 304(2012).
  20. Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
  21. Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).

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