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Method Article
This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.
Multimodal, la imagen molecular permite la visualización de los procesos biológicos a resoluciones celulares, subcelulares, ya nivel molecular utilizando múltiples técnicas de imagen complementarias. Estos agentes de formación de imágenes facilitan la evaluación en tiempo real de las vías y mecanismos in vivo, que mejoran tanto la eficacia diagnóstica y terapéutica. En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis de nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas (PB PN) - una nueva clase de agentes para su uso en aplicaciones de imágenes multimodales, molecular. Las técnicas de imagen incorporados en el nanopartículas, imágenes de fluorescencia y la resonancia magnética (MRI), tienen características complementarias. Los PN PB poseen un diseño de núcleo-corteza donde gadolinio y iones de manganeso incorporados dentro de los espacios intersticiales de la red PB generan contraste MRI, tanto en T1 y T2 y secuencias. Los PN PB están recubiertas con avidina fluorescente usando electrostática auto comoblea, que permite imágenes de fluorescencia. Las nanopartículas recubiertas con avidina se modifican con ligandos biotinilados que confieren posibilidades de marketing moleculares a las nanopartículas. La estabilidad y la toxicidad de las nanopartículas se miden, así como sus capacidades de relajación de MRI. Las capacidades de imágenes multimodales, moleculares de estas biofuncionalizadas PN PB luego se demostraron utilizándolos para imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular in vitro.
La imagen molecular es la visualización no invasiva y precisa de los procesos biológicos a nivel celular, subcelular, y los niveles moleculares 1. La imagen molecular permite un espécimen a permanecer en su microambiente nativo mientras que sus vías y mecanismos endógenos son evaluados en tiempo real. Típicamente, la imagen molecular implica la administración de un agente de imagen exógeno en forma de una pequeña molécula, macromolécula, o nanopartículas para visualizar, objetivo, y trazar procesos fisiológicos pertinentes se está estudiando 2. Las diversas modalidades de imagen que se han explorado en imagen molecular incluyen MRI, CT, PET, SPECT, ultrasonido, photoacoustics, espectroscopia Raman, la bioluminiscencia, la fluorescencia y microscopía intravital 3. Multimodal de imágenes es la combinación de dos o más modalidades de imagen donde la combinación mejora la capacidad de visualizar y caracterizar diversos procesos y eventos 4 biológicos. Multimodal de imágenes explota las ventajas de las técnicas de formación de imágenes individuales, mientras que la compensación de sus limitaciones individuales 3.
En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis de nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas (PB PN) - una nueva clase de agentes de imágenes multimodales, molecular. Los PN PB se utilizan para obtener imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular. PB es un pigmento que consiste de la alternancia de hierro (II) y hierro (III) átomos en una red cúbica centrada en las caras (Figura 1). La celosía PB se compone de ligandos cianuro lineales en una Fe II - CN - vinculación Fe III que incorpora cationes para equilibrar las cargas dentro de su red tridimensional 5. La capacidad de PB incorporar cationes en su celosía se explota mediante la carga por separado gadolinio y iones de manganeso en los PN PB para el contraste de resonancia magnética.
La razón fundamental para la consecución de un diseño de nanopartículas para el contraste RM es debidolas ventajas de este diseño ofrece en relación con los agentes de contraste MRI actuales. La gran mayoría de agentes de contraste MRI aprobados por la FDA de Estados Unidos son quelatos de gadolinio que son paramagnéticos en la naturaleza y proporcionan contraste positivo por el mecanismo de relajación 6,7,8-spin celosía. En comparación con un solo gadolinio-quelato que proporciona baja intensidad de señal por sí mismo, la incorporación de múltiples iones de gadolinio dentro de la red PB de las nanopartículas proporciona una mayor intensidad de la señal (contraste positivo) 3,9. Además, la presencia de múltiples iones de gadolinio dentro de la red PB aumenta la densidad de espín general y la magnitud de paramagnetismo de las nanopartículas, que perturba el campo magnético local en su vecindad, generando de ese modo contraste negativo por el mecanismo de relajación espín-espín. Así, las nanopartículas que contienen gadolinio funcionar tanto como T 1 (positivo) y T 2 agentes de contraste (negativo) 10,11.
En un subgrupo de pacientes con insuficiencia renal, la administración de agentes de contraste con gadolinio se ha relacionado con el desarrollo de fibrosis sistémica nefrogénica 8,12, 13. Esta observación ha llevado a investigaciones sobre el uso de iones paramagnéticos alternativos como agentes de contraste para MRI. Por lo tanto, el diseño versátil de las nanopartículas está adaptado para incorporar iones de manganeso dentro de la red PB. Similar a gadolinio quelatos, manganeso quelatos también son paramagnéticos y se utilizan normalmente para proporcionar una intensidad de señal positiva en la RM 7,14. Al igual que con gadolinio PB PN, las PB PN contienen manganeso también funcionan como T 1 (positivo) y T 2 agentes de contraste (negativo).
Para incorporar capacidades de formación de imágenes de fluorescencia, la nanopartícula "núcleos" se recubren con una cáscara "biofuncional" que consiste en la avidina marcada con fluorescencia-glicoproteína (Figura 1). Avidina no sólo permite imágenes de fluorescencia, sino que también sirve como una plataforma de acoplamiento para ligandos biotinilados que se dirigen a las células y tejidos específicos. La unión de avidina-biotina es una de las más fuertes enlaces conocidos, no covalentes caracterizadas por extremadamente fuerte afinidad de unión entre avidina y biotina 15. La unión de ligandos biotinilados a la avidina-revestido PB PN confiere posibilidades de marketing moleculares a los PN PB.
La motivación para la búsqueda de imágenes de fluorescencia y MR usando PB PN se debe a que estas técnicas de imagen poseen características complementarias. Imágenes de fluorescencia es una de las técnicas de imagen molecular óptica más utilizado, y permite la visualización simultánea de múltiples objetos a altas sensibilidades 1,16,17. Imágenes de fluorescencia es una modalidad segura, no invasiva, pero se asocia con bajas profundidades de penetración y resoluciones espaciales 1,3,16. Por otro lado, MRI genera un alto temporald resolución espacial de forma no invasiva y sin necesidad de radiación ionizante 1,3,16. Sin embargo MRI sufre de baja sensibilidad. Por lo tanto, imágenes de fluorescencia y la RM fueron seleccionadas como las técnicas de imagen molecular, debido a sus características complementarias de penetración de profundidad, sensibilidad y resolución espacial.
En este artículo se presenta el protocolo para la síntesis y biofuncionalización de los PN PB, PB PN (GdPB), y que contiene gadolinio-PB PN (MnPB) 10,11 que contiene manganeso. Los siguientes métodos se describen: 1) medición del tamaño, la carga y la estabilidad temporal de las nanopartículas, 2) Evaluación de la citotoxicidad de las nanopartículas, 3) de medición de relaxividades MRI, y 4) la utilización de las nanopartículas para la fluorescencia y la RM molecular de una población de células diana in vitro. Estos resultados demuestran el potencial de los NPs para uso como agentes de formación de imágenes multimodales, moleculares in vivo.
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1. Síntesis de PB PN, GdPB y MnPB
Síntesis de las nanopartículas (PB PN, GdPB o MnPB) se consigue utilizando un esquema de síntesis en un solo recipiente realizando los pasos que se detallan a continuación:
2. Biofuncionalización de PB PN, GdPB y MnPB
Biofuncionalización de las nanopartículas consiste en el revestimiento de las nanopartículas "núcleos" con avidina y la adición de ligandos biotinilados como se describe a continuación:
3. Dimensionamiento, Potencial Zeta, y Temporal de estabilidad de las nanopartículas
La distribución de tamaño, carga, y la estabilidad de las nanopartículas se miden utilizando dinámicamétodos de dispersión de luz (DLS) como se describe a continuación:
4. La citotoxicidad de las nanopartículas
La citotoxicidad de las nanopartículas se mide usando un ensayo de proliferación celular XTT como sigue:
5. MRI capacidades de relajación de los PN PB, GdPB y MnPB
MRI de relajación se mide usando T 1 - y la secuencia T2 y por la preparación de un "fantasma" MRI utilizando una placa de 96 pocillos que contiene nanopartículas como se describe a continuación:
6. El etiquetado fluorescente de células dirigidas Utilizando el Nanopartículas - Microscopía Confocal
NOTA: Las nanopartículas (NP PB, GdPB, y MnPB) se puede utilizar para etiquetar fluorescentemente una población de células diana (monitorizada por microscopía confocal) como sigue:
7. Etiquetado fluorescente de células dirigidas Utilizando el Nanopartículas - Citometría de Flujo
Las nanopartículas (PB NPs, GdPB, y MnPB) se pueden utilizar para la etiqueta fluorescente una población de células diana (monitorizada por citometría de flujo) como sigue:
8. Generación de resonancia magnética de contraste sobre las células que se hayan empleado las nanopartículas
Las nanopartículas (NP PB, GdPB, y MnPB) se pueden utilizar para generar contraste MRI (en ambos T 1 - y la secuencia T2) en una población de células diana de la siguiente manera:
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Usando el esquema de síntesis en un solo recipiente, las nanopartículas de Pb NPs (diámetro medio de 78,8 nm, índice de polidispersidad (PDI) = 0,230; calculada por el instrumento de dispersión de luz dinámica), GdPB, o MnPB (diámetro de 164,2 nm, PDI = 0,102 significa) ( diámetro medio 122,4 nm, PDI = 0,124) que son monodispersas (medido por DLS) se puede sintetizar constantemente (Figura 2A). Los potenciales zeta medidos de las nanopartículas sintetizadas están a menos de -30 mV (Fig...
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Este artículo ha presentado los métodos para la síntesis de una nueva clase de agentes formadores de imágenes multimodales, moleculares basados en nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas. Las técnicas de imagen molecular incorporados en las nanopartículas son imágenes de fluorescencia y resonancia magnética molecular, debido a sus características complementarias. Las nanopartículas azul de Prusia biofuncionalizadas tienen un diseño de núcleo-corteza. Los pasos clave en la síntesis de estas n...
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The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 and 30001489).
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
Sonicator | QSonica | Q125 | |
Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
Tube holders | VWR | 82024-342 | |
Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
100 ml round-bottom flask |
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