JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن الحمض النووي الأكسدة علامة، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo) من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية.

Abstract

ويرتبط الاكسدة مع العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، وكذلك التمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا، مما يؤدي إلى أكسدة الجزيئات الكبيرة، بما في ذلك الحمض النووي. ولذلك، كشف الفعال للأكسدة الحمض النووي مهم لمجموعة متنوعة من التخصصات البحثية، بما في ذلك الأدوية والسموم. A العلامات البيولوجية المشتركة للأضرار الحمض النووي oxidatively هو 8-أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo، غالبا ما يشار إليها باسم خطأ 8-هيدروكسي-2'-deoxyguanosine (8-OH-dGuo أو 8 -oxo-DG)). وقد وصفت عدة بروتوكولات لقياس 8 أوكسو dGuo ارتفاع ضغط اللوني السائل مع كشف الكهروكيميائية (HPLC-ED). ومع ذلك، طبقت هذه أساسا لDNA تنقية تعامل مع الموالية للتأكسد. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الاختلافات المنهجية بين المختبرات، ويرجع ذلك أساسا إلى الاختلافات في المعدات التحليلية، واعتماد أساليب نشرت للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED يتطلب التحسين دقيق من قبل كل مختبر. Aبروتوكول شامل، واصفا مثل هذه العملية الأمثل، غير متوفرة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية. فإنه يوضح كيفية إعداد عينة من الحمض النووي يمكن بسهولة وبسرعة الأمثل لتقليل أكسدة الحمض النووي غير المرغوب فيها التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات. ويظهر هذا البروتوكول كيفية اكتشاف 8 أوكسو dGuo في الخلايا المستزرعة الإنسان غدية السنخية (أي الخلايا A549) تعامل مع عامل مؤكسد KBrO 3، ومن الطحال من الفئران المعرضة للثنائي بنزو الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (صفر، ع) chrysene (DBC، المعروف سابقا باسم بنزو (أ، ل) بيرين، DalP). عموما، يوضح هذا العمل كيف منهجية HPLC-ED يمكن أن يكون الأمثل بسهولة للكشف عن 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية.

Introduction

تساهم أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، الذي مستويات ثابتة للدولة يمكن أن تزيد خلال العديد من الحالات المرضية والتمثيل الغذائي xenotoxic، إلى زيادة وتيرة الحمض النووي من التلف التأكسدي. بين عدة النووية nucleobases الممكنة منتجات الأكسدة، ويمكن أن الحمض النووي من التلف التأكسدي بسهولة أن تقاس باستخدام علامة مستقرة 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo)، التي تعد واحدة من أشكال المؤكسد من 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-أوكسو dGuo هو آفة DNA الأكثر وفرة 2، وبالتالي، وقد درس لمزيد من التفاصيل والعلامات البيولوجية أكسدة الحمض النووي على الرغم من وجود الحمض النووي عدة منتجات الأكسدة 3. في البشر، وهذا الضرر يمكن إصلاحه عن طريق قاعدة إصلاح الختان بنسبة 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. إذا تركت دون إصلاح، ويمكن 8 أوكسو dGuo المساهمة في تشكيل قاعدة الطفرات الزوج إحلال (أي G إلى T transversions) 4. الأهم من ذلك، 8 أوكسو dGuo هو علامة المنشأة FOالحمض النووي من التلف (ص) في ما يتعلق استهلال وتعزيز التسرطن 2. ولذلك التقدير الدقيق 8 أوكسو dGuo هو العلامات البيولوجية مفيدة ومرغوبة من الحمض النووي من التلف التأكسدي 5.

هناك ارتباك واسع النطاق في الأدبيات المتعلقة الأسماء الصحيحة لأشكال تلف oxidatively ل2-deoxyguanosine وعلاوة على ذلك، والاسم الصحيح للمجمع (ق) تقاس بشكل روتيني والعلامات البيولوجية من الحمض النووي من التلف التأكسدي 6. من 6،8-diketo و 6 إنول، 8-كيتوني أشكال صنواني من 8 أوكسو dGuo (كما هو موضح في الشكل رقم 1) هما tautomers أبرز مناقشتها في الأدب 5،7. شكل 6،8-diketo هو الشكل الأبرز في درجة الحموضة الفسيولوجية 7.4، و هو الأبرز أكسدة الحمض النووي المنتج 7. لذا، 8 أوكسو dGuo، بدلا من 8 هيدروكسي dGuo هو الاسم الأنسب لهذا المنتج أكسدة 6. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن 2-deoxyguanosine (dGuo)، بدلا من nucleobبورصة عمان جوانين (غواتيمالا) أو غوانوزين ريبونوكليوزيد (قوه) على التوالي، تم الكشف من قبل معظم وسائل 6.

كشف دقيق وتقدير من 8 أوكسو dGuo يمثل تحديا للأسباب التالية: أ) التباين في الهضم من عينة من الحمض النووي، والثاني) الأكسدة عرضية من dGuo إلى 8 أوكسو dGuo التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات، والثالث) الحاجة للتحقق من صحة الفعال للالتحليلي طريقة HPLC-ED 8. في هذا البروتوكول، ونحن تهدف إلى تحقيق ط) من خلال توفير الظروف المواتية لاستكمال عملية الهضم DNA والثاني) من قبل خالب إدراج المعدن وحلول المعالجة خالب وكاشف عزل DNA الخاص، في حين أن الثالث) كانت موجهة جزئيا فقط إدراج الضوابط الإيجابية، وبالتالي تنص على أن الأسلوب هو قادر على اكتشاف 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية. مزيد من التأكيد هو أبعد من نطاق هذه الورقة. ومع ذلك، فإننا واثقون من أن هذا البروتوكول سوف تساعد المحتملينالمستخدمين على تحديد المدى الذي يحتاجون إليه للتحقق من صحة رسميا البروتوكول، حسب أغراضها. وهناك قائمة من الخطوات المطلوبة للمصادقة رسمية من طريقة أخرى. خلال تطوير ونشر طريقة للكشف عن 8 أوكسو dGuo، تم استعراض أساليب نشر وتوحيدها. وبالتالي، فإن هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى جمع المعلومات من عدة مصادر منشورة التي تفتقر في كثير من الأحيان تفاصيل التجريبية مهمة بينما توفر أيضا وسيلة سريعة ومباشرة من اختبار إذا تم اعتماد أسلوب للكشف وتقدير من 8 أوكسو dGuo بنجاح. كان يعمل هذا الأسلوب تكييفها لتحليل عينات من الحمض النووي بنجاح من الخلايا المستزرعة والأنسجة الفئران. هذه المقالة الفيديو سوف تساعد مجموعات أخرى في إنشاء وسيلة فعالة للكشف عن موثوقة وتقدير من 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED.

Protocol

التأكد من أن جميع تربية الحيوانات، والإسكان، والتعامل مع والتجريب الالتزام بالقواعد واللوائح المحلية وتمت الموافقة على أن بروتوكولات التجارب قبل البدء في أي دراسة. لوصف التجارب، تمت الموافقة على رعاية الحيوان، ومعالجة، والعلاج من قبل لجنة رعاية الحيوان وزارة الصحة الكندية. راجع "الجدول الكواشف" للحصول على معلومات الموردين.

1. جمع العينات البيولوجية

  1. الخلايا أو الأنسجة الحيوانية
    1. زراعة خلايا غدية A549 السنخية الإنسان في F12-K وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 100 وحدة / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
    2. خلايا البذور على ما يقرب من 1 مليون خلية في 10 سم لوحة. لكل تجربة، استخدم مجموعة من 12 لوحات في المجموع (ثلاث لوحات في مكررة واحدة البيولوجي X أربع جرعات) لتوفير ما يكفي من الحمض النووي (80 ميكروغرام) لعملية الهضم الأنزيمي وتحليل HPLC.
    3. عندما تصبح كثافة الخلية أكبر من تقريباimately 70٪ من مساحة سطح لوحة، وإزالة وسائل الإعلام وغسل خلايا مرتين مع 4 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4.
    4. للخلايا الحيوانية مثقف، استخدم KBrO 3 كعنصر تحكم إيجابية.
      ملاحظة: وجود علاقة خطية طردية بين KBrO تركيز 3 والتردد 8-أوكسو dGuo تم الإبلاغ في الأدبيات 9.
    5. حل KBrO 3 في برنامج تلفزيوني. تأكد من أن تركيز النهائي في مستنبت الخلية أكبر من 1 ملم إلى الحصول على زيادة ذات دلالة إحصائية في 8 أوكسو dGuo بالنسبة لخلايا الامم المتحدة وعرضة للخطر. إضافة نفس التركيز من KBrO 3 إلى كل لوحة في سلسلة (على سبيل المثال، لوحات 12 10 سم).
    6. احتضان لوحات لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية. إزالة وسائل الإعلام ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    7. إضافة 1 مل من محلول التربسين (تركيز الأسهم 2.5 غرام / مل)، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    8. يغسل مع 4 مل PBS، وجمع الخلايا من كل مجموعة الى احد polystyr 50 مل المخروطيةالشم أنبوب الطرد المركزي، والطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. إزالة برنامج تلفزيوني وتخزين بيليه خلية في -80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل. أكسدة الحمض النووي الاصطناعي يمكن التقليل من جراء العزلة النووية، كما هو موضح في مكان آخر (10).
  2. الأنسجة الحيوانية
    1. الجرعة الحيوانات كما هو مطلوب. لهذا البروتوكول، والكبار (9 أسابيع من العمر) علاج الذكور مؤتة الماوس عن طريق أنبوب تغذية عن طريق الفم يوميا لثلاثة أيام متتالية مع 20 ملغ DBC / كجم من وزن الجسم يوميا المذاب في زيت الزيتون.
      ملاحظة: هذا الحيوان المعدلة وراثيا الموانئ المهندسة λ-الجراثيم وتحور الجين مراسل lacZ من E. القولونية 11 يستخدم لمكافحة القوارض المعدلة وراثيا المقايسات الطفرة 12.
    2. أداء تشريح الحيوان على سبيل المثال، تخدير الفئران يمكن أن تستخدم الأيزوفلورين ومن ثم الموت الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم يليه افتتاح تجويف الصدر. فلاش على الفور الأنسجة تجميد في النيتروجين السائل. مخزن الأنسجة في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
      ملاحظة: توقيت القتل الرحيم بعد العلاج قد يكون متغير آخر مهم (على سبيل المثال، كانت أكسدة الحمض النووي القصوى في 72 ساعة بعد التعرض للضوضاء في الدماغ الفئران والكبد 13).

2. استخراج الحمض النووي، إن الأمطار وغسل (لأنسجة الانتقال مباشرة إلى 2.2)

  1. التجانس الخلايا التي تم جمعها في 50 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي البوليسترين مع 1 مل من الحمض النووي عزل الوكيل مثل DNAzol. استخدام 1000 ميكرولتر طرف ماصة لتفريق بيليه الخلية حتى الحل هو متجانس. نقل جناسة لأنبوب جديد microcentrifuge 1.5 مل. احتضان على الجليد لمدة 10-20 دقيقة. انتقل إلى 2،3.
  2. التجانس 15-20 ملغ من الأنسجة في 1 مل يده الخالط الزجاج غير لاصقة تحتوي على 500 ميكرولتر كيل عزل الحمض النووي. بلطف رفع وخفض الخالط لمدة 1 دقيقة. سوف الأنسجة ليونة تتطلب وقتا أقل. علاج لطيف يضمن القص أقل من DNA. تخزين جناسة على الجليد لمدة حوالي 10-20 دقيقة.
  3. كريةجناسة بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 10000 x ج و 4 درجات مئوية في 1.5 مل المخروطية أنبوب microcentrifuge.
  4. نقل بعناية طاف مما أدى إلى الجديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge مع إيلاء اهتمام دقيق لتجنب الاتصال بيليه.
  5. ترسيب الحمض النووي من جناسة بإضافة 0.5 مل 100٪ ETOH لكل 1 مل من جناسة. عكس أنابيب 10 مرات لضمان عزل كاشف وETOH تختلط بما فيه الكفاية.
  6. عند هذه النقطة، راسب الحمض النووي هو لزج، بكرة وضعها على طرف ماصة بلاستيكية (على سبيل المثال، مع القدرة على الاحتفاظ أقصاها 200 ميكرولتر) ثم نقل إلى 1.5 مل جديدة المخروطية أنبوب microcentrifuge.
    ملاحظة: الطرد المركزي السريع يمكن أن تستخدم لإزالة أي المحللة المتبقية من عزل الحمض النووي.
    (غسل DNA والإذابة)
  7. إضافة 1 مل من 75٪ ETOH إلى عزل الحمض النووي. تعليق بيليه الحمض النووي بدقة من قبل قلب الأنابيب 10 مرات.
  8. صب بعناية الإيثانول من الأنبوب. ضمان عشربيليه ه DNA العصي إلى جانب الأنبوب. تخزين أنابيب عموديا لمدة 1-2 دقيقة، واستخدام ماصة لإزالة أي فائض ETOH من الجزء السفلي من الأنبوب.
  9. تكرار DNA يغسل مرة أخرى، وإما تخزين العينة في ETOH في -20 ° C (مستقر لعدة أشهر) أو الشروع فورا في عملية الهضم.
  10. حل DNA العازلة في الهضم (هو موضح أدناه) ثم تحديد باستخدام الطرق الطيفية القياسية (أي الامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام معمل NanoDrop الطيف).

3. الأنزيمية الهضم

  1. إعداد "العازلة الهضم" من خلال الجمع بين وحدات التخزين المناسبة (اعتمادا على عدد العينات التي يتم هضمها) 50 مم أحادي فوسفات الصوديوم (التي تحتوي على 2.0 ملي بوكل، 1.0 ملي desferal (DFO) و 200 ملي MgCl 2) مع 50 ملم ثنائي القاعدة نا الفوسفات (يحتوي أيضا 2.0 ملي بوكل، 1.0 ملم و 200 ملم DFO MgCl 2). يتطلب كل عينة 4.0 ميكرولتر أحادي و17،0 ميكرولتر حل فوسفات ثنائي القاعدة.
    2. <لى> إزالة أي ETOH المتبقية من الجزء السفلي من الأنبوب والهواء الجاف عينات لمدة 5 دقائق. تأكد من أن الحمض النووي لا تجف تماما.
  2. حل 80 ميكروغرام الحمض النووي المستخرج في 21.0 ميكرولتر من العازلة الهضم، إضافة 1 وحدة من الدناز I يذوب في 2.0 ميكرولتر من العازلة الهضم.
  3. دوامة برفق لتحقيق خلط دقيق واحتضان لمدة 1.5 ساعة عند 37 ° C.
  4. في نهاية فترة الحضانة، إضافة 216.4 ميكرولتر من ثنائي القاعدة 50 ملي نا حل الفوسفات التي تحتوي على 2.0 ملي بوكل، 1.0 ملم و 200 ملم DFO MgCl 2.
  5. إعداد "الهضم العازلة-2" من خلال الجمع بين مجلد واحد من العازلة الهضم مع تسعة مجلدات من ثنائي القاعدة، 50 ملي نا الفوسفات (مع 2.0 ملي بوكل، 1.0 ملم و 200 ملم DFO MgCl 2).
  6. إضافة 0.025 وحدة من فسفودايستراز (PDE) I انزيم في 16.3 ميكرولتر الهضم العازلة-2. ماصة صعودا وهبوطا لعدة ثوان، ثم دوامة برفق لتحقيق خلط دقيق واحتضان لمدة 1.5 ساعة عند 37 ° C.
  7. إضافة 00.4 وحدات من الفوسفاتيز القلوية (AP) في 8.0 ميكرولتر الهضم العازلة-2. ماصة صعودا وهبوطا لعدة ثوان، ثم دوامة برفق لتحقيق خلط دقيق واحتضان لمدة 1.5 ساعة عند 37 ° C. إضافة 33.0 ميكرولتر HPLC الصف MeOH.
  8. تشغيل عينات من الحمض النووي يهضم على HPLC، كما هو موضح أدناه، على الفور أو تخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها للحد من الأكسدة. ملاحظة: الخطوات الهضم 1.5 ساعة المقترحة هنا تقوم على الفترات اقترحت في مكان آخر 9 وعلى النتائج التي بروتوكولات مماثلة تحقيق كامل الهضم DNA 9. لذلك، كان من المفترض أن العامل المحدد الوحيد لتحقيق كان الهضم الكامل الوقت وأن تثبيط أنزيم والتجانس عينة كانت لا تكاد تذكر.

4. HPLC تشغيل: إعداد موبايل المرحلة، إعداد الأجهزة والصيانة

  1. استخدام الماء عالى النقاء لتحضير جميع المحاليل وتعامل مع السندات الراتنج عالية القوة (على سبيل المثال، Chelex 100: الستايرين divinylbeالبوليمرات nzene مع iminodiacetate أيونات المعادن التي تمر بمرحلة انتقالية كلاب مع تقارب عالية) للحد من التلوث بالمعادن وأكسدة الحمض النووي خلال إعداد العينات.
  2. إعداد 250 ملي نا العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 6.2. استخدام نسبة 1: 3.6957 للثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (FW = 177.99 جم / مول) إلى أحادي فوسفات الصوديوم (FW = 119.98 جم / مول).
    مثال: لذلك، من أجل حل الأسهم 3 L الجمع بين 70.81 غرام من أحادي القاعدة و28،43 غرام من مسحوق ثنائي القاعدة، إضافة الماء حتى على سبيل المثال، 2.8 L وتحقق من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول 6.2. ضبط درجة الحموضة مع 250 ملي أحادي أو ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم الحلول، التي أعدت بشكل منفصل وليس عن طريق الأحماض المركزة أو قواعد. إضافة 2.24 غرام من بوكل للحصول على تركيز من 10 ملي بوكل.
  3. إعداد المرحلة المتنقلة في ثلاث زجاجات، لا يقل عن 1 L لكل منهما، تحتوي على: المذيبات B - HPLC الصف الميثانول، والمذيبات - B عالى النقاء الماء، والمذيبات C - العازلة الفوسفات من الخطوة 4.2. إدراج HPLC الطور المتحرك إمدادات أنابيب في زجاجات. remainiيجب أن تراجع أنابيب نانوغرام أيضا في واحدة من الزجاجات (على سبيل المثال، حل C) وتستعد حتى لو أنها ليست مطلوبة لخلط.
  4. خلال الفترة السابقة، وخلط الحلول الطور المتحرك إلى 6٪ المذيبات A، 74٪ المذيبات B و 20٪ المذيبات C لتحقيق حل نهائي لل50 ملي العازلة فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.2) مع 2.0 ملي بوكل، و 6٪ MeOH.
  5. فصل القطب من كشف الكهروكيميائية، تفكيكة وإشارة نظيفة وأقطاب العمل مع حلول التنظيف الكهربائي وتلميع أقراص الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. شطف السطوح تنظيفها بالماء عالى النقاء، ومسح المياه قبالة بلطف وضمان كاشف جاف قبل أن يتحول النظام على.
  6. إعادة تجميع كشف وربط مرحلة مدخل المحمول إلى القطب. بدوره على تدفق والسماح للمرحلة النقالة لتملأ الكهربائي قبل ربط منفذ أنبوب المرحلة المحمول. تثبيت عمود جديد قبل بدء الأمثل. ضمان التثبيت في الاتجاه الصحيح ووOLLOWS التوصيات عن الشركة الصانعة.
  7. بدوره على الأجهزة جنة البرنامج الرفيعة المستوى قبل وقت كاف (على سبيل المثال، 1 ساعة) من عينة تحاليل للسماح للموازنة والحد من الضوضاء الأساسي. انظر الجدول رقم 1 لضبط المقترح؛ يجب وضع حد الضغط مرة أخرى إلى 3000 رطل لكل بوصة مربعة لتجنب الضرر العمود. بدوره على الغاز الراحل. المضي قدما فتيلة المضخات ووضع التدرج المذيبات.
  8. رئيس الجاف المضخات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. نفعل ذلك لترطيب خطوط عندما تم استبدال مرحلة الجوالة أو يتعرض لها مدخل أنابيب للهواء.
  9. تحديد القرص فتيلة وإدراج البلاستيك 10-15 مل حقنة هناك. تأكد من إدخال الحقنة بالكامل قبل فتح الخط. لفتح خطوط تتحول ببساطة القرص عكس اتجاه عقارب الساعة لدورة واحدة.
  10. بدء رئيس الوزراء في اختيار واجهة HPLC المناسبة. سحب بلطف حقنة لرسم السوائل في خطوط. مرة واحدة السائل يتدفق، رئيس مجلس اكتمال؛ يسمح البرنامج لالانتهاء من التشغيل. أكرر لجميع خطوط (عادة أربعة، اعتمادا على الصك).
  11. بدلا من ذلك، رئيس الرطب عندما يتم المبللة خطوط بالفعل من رئيس الجاف سابق (انظر أدناه).
    ملاحظة: عندما انقضت على كمية كبيرة من الوقت بين الاستخدامات (على سبيل المثال، 2 أسابيع أو أكثر)، وأوصى رئيس الجاف.
  12. تغيير تركيبة مكونات المذيبات الطور المتحرك إلى 25٪ لكل منهما باستخدام واجهة المستخدم HPLC. من واجهة، حدد "وظيفة مباشرة" الخيار، ثم حدد "ويت رئيس" الخيار. هذا سيقوم رئيس كل الخطوط في نفس الوقت.
  13. تأكد من أن كل الهواء من النظام من خلال مراقبة خط رئيس الرطب لأنه يدخل في حاوية النفايات. بعد البرايم جيد، وضمان أن يتم ترك أي فقاعات في الخط. إذا استمرت فقاعات، كرر فتيلة.
  14. مرة واحدة وتستعد المضخة، تبدأ في التحرك الطور المتحرك HPLC. استخدام واجهة HPLC لتغيير تكوين الطور المتحرك يدويا إلى 6٪ الميثانول (A المذيبات) و 94٪الماء (مذيب B)، وحدد معدل تدفق 0.9 مل / دقيقة. سماح 5 دقائق لمسح أي الميثانول من الخطوة التنظيف العمود.
  15. بعد 5 دقائق، تغيير التركيبة إلى 6٪ الميثانول (A المذيبات)، والمياه 74٪ (المذيبات B)، و 20٪ عازلة (المذيبات C)، وزيادة معدل التدفق إلى 1.0 مل / دقيقة. تعيين المعلمات الأخرى كما هي ملخصة في الجدول رقم 1، وتعيين الحد يعود الضغط إلى 3000 رطل لكل بوصة مربعة لتجنب الضرر العمود.
    ملاحظة: المشاكل المحتملة مع الإعداد HPLC وتشمل الانجراف خط الأساس، وذروة الانقسام وتقلص كثافة الإشارة. هذه عادة ما يمكن التغلب عليها عن طريق تنظيف العمود بعد كل استخدام، تنظيف الكهربائي المتكرر، والتأكد من أن المحاليل خالية من التلوث (على سبيل المثال، الجسيمات أو نمو الجراثيم).
  16. تشغيل المرحلة المتنقلة لحوالي 1-1.5 ساعة لتحقيق إشارة خط الأساس مستقرة.
  17. باستخدام واجهة البرنامج الصك، المعلمات مختارة كما هو مبين في الجدول رقم 1 وتعيين وقت التشغيل لمدة 15 دقيقة. حقن سامسبيل. استخدام زيادة مرات المدى للعينات معقدة (تحديد هذا تجريبيا من خلال مراقبة وجود أو عدم وجود قمم تتجاوز فترة 15 دقيقة).
    ملاحظة: أدوات البرنامج يسمح برمجة المدى الظروف عينة والإعداد لautosampling.
  18. بعد أن تم الانتهاء من تشغيل، إيقاف الخلية كشف باستخدام واجهة للكشف. فمن المهم اتباع توصيات الشركة المصنعة فيما يتعلق بانخفاض الطاقة كاشف كما مناولتها وإيقاف التشغيل يمكن أن تلحق الضرر الصك. DO NOT إيقاف الخلية عن طريق التحول الجزء الخلفي من كاشف لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الصك.
  19. تغيير التركيبة مرحلة المحمول إلى 6٪ الميثانول و 94٪ من المياه يدويا. تشغيل لمدة 5 دقائق.
  20. تخفيض يدويا معدل التدفق إلى 0.7 مل / دقيقة، وعلى الفور تغيير التركيبة إلى 50٪ MeOH و 50٪ من المياه. تشغيل لمدة 20 دقيقة على الأقل. فشل لتشغيل هذه الخطوة للمرة أوصى يمكن أن يؤدي إلى تلف العمود وكاشف. إيقاف تدفق، لد ثم إيقاف الغاز الراحل.

5. إعداد المعايير

  1. إعداد عازلة المرحلة المحمول كما هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 أعلاه. من المهم استخدام الطور المتحرك HPLC لإعداد معايير لتجنب القمم الناتجة عن اختلاط حلول متباينة بعد حقن العينة.
  2. تمييع هذا الحل احد من كل خمسة مع الماء عالى النقاء قبل استخدامها، ويجب أن يحتوي على الحل النهائي 6٪ MeOH.
  3. dGuo قياسي
    ملاحظة: إمكانية الأكسدة العالية المطلوبة للكشف عن dGuo قد تزيد من خطر التدخل قياس المركبات electroactive. هذا يمكن التحقق منها، على سبيل المثال، منحنى القياسية للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية من dGuo في 260 نانومتر، ومقارنتها منحنى القياسية التي تم إنشاؤها باستخدام الكشف EC. إذا كان كل من محاذاة بشكل جيد (على سبيل المثال، الشكل التكميلي 1) وقد اتخذت والآثار مصفوفة العينة بعين الاعتبار، يمكن للمرء أن المضي قدما في كشف dGuo بواسطة الأشعة فوق البنفسجية في 260 نانومتر، بدلا من الكشف EC.
    1. قياس 1.0 ملغ من dGuo في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 1.0 مل HPLC الصف MeOH.
    2. دوامة بسرعة عالية حتى يذوب تماما dGuo. هذا هو مخزون الابتدائي؛ تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
    3. لإنشاء dGuo الأسهم الثانوية (0.5 ملم)، وتمييع 143 ميكرولتر من الأسهم dGuo الابتدائي في 857 ميكرولتر من الطور المتحرك HPLC. تخزين على الجليد حتى استخدامها وإعداد الطازجة يوميا.
    4. تقديم مزيد من التخفيفات لخلق منحنى القياسية (على سبيل المثال، الجدول 2). مخزن الحلول على الجليد وإعداد الطازجة يوميا. معايير تشغيل في سلسلة مع العينات التجريبية.
    5. قبل تشغيل، تختلف الجهد للكشف عن استخدام أعلى تركيز للسهم للعثور على الجهد الأمثل.
  4. 8-أوكسو dGuo قياسي
    1. قياس 1.0 ملغ من 8 أوكسو dGuo في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 0.1 مل HPLC الصف MeOH. دوامة على سرعة عالية حتى 8 أوكسو dGuo يذوب تماما. هذا هو المخزون الأساسي من 8 أوكسو dGuo. تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة بغازيأسابيع األطراف.
    2. في أنبوب منفصل، والجمع بين 2.9 ميكرولتر من الأسهم الابتدائي و997.1 ميكرولتر من HPLC الطور المتحرك العازلة، دوامة. هذا هو مخزون الثانوي (10000 نانومتر).
    3. لإيجاد حل لعمل منحنى قياسي (250 نيوتن متر)، والجمع بين 24.4 ميكرولتر من الأسهم الثانوي و975.6 ميكرولتر من العازلة المرحلة المحمول.
    4. أداء المزيد من التخفيفات في تقديم الحلول المطلوبة لإنشاء منحنى القياسية (على سبيل المثال، الجدول 3). مخزن الحلول على الجليد وإعداد الطازجة يوميا. معايير تشغيل مع العينات التجريبية.
  5. تحديد الكمية
    1. دمج المنطقة تحت المنحنى لكل 8 أوكسو dGuo وdGuo باستخدام البرمجيات القياسية (كجزء من واجهة HPLC والحاسوب؛ انظر التكميلي الشكل 2A).
    2. بناء المنحنى القياسي (تركيز يعرف كل تحليلها مقابل المنطقة تحت المنحنى (التكميلي الشكل 2B). وباستخدام معادلة منحنى قياسي، وحساب نسبة ل8-أوكسو dGuo / dGuo لكل عينة.

6. الاغاروز جل الكهربائي

ملاحظة: الاغاروز الكهربائي للهلام يمكن أداؤها للتحقق من اكتمال DNA الهضم.

  1. إعداد 50X تريس، خلات-EDTA (تاي) العازلة، عن طريق إذابة 242 جم تريس قاعدة (FW = 121.14) في 750 مل ماء عالى النقاء. إضافة 57.1 مل حمض الخليك الجليدي و 100 مل من 0.5 M EDTA (8.0 درجة الحموضة، وسوف EDTA حل تماما عندما يتم ضبط درجة الحموضة الحل إلى 8.0 مع مثل هيدروكسيد الصوديوم) وإضافة الماء عالى النقاء إلى الحجم النهائي من 1 L. مخزن في RT، تمييع هذه 50X حل قبل استخدامها.
  2. تزن من 1 غرام من الاغاروز وحله في 100 مل 1X TAE العازلة، التدفئة في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة. ارتداء نظارات واقية ومعدات وقائية لتجنب الاتصال مع الاغاروز المغلي.
  3. تبريد حل لأسفل حتى ما يقرب من 50 ° C، إضافة 5 ميكرولتر إيثيديوم بروميد (تحذير: المغير) وسكبه في الاغاروز جهاز هلام التوالي. إدراج مشط.
  4. انتظر حتى يتصلب حل، صب عازلة TAE على هلام وتحميل العينات (الحجم يعتمد على حجم مشط، عادة، يتم تحميل 10-20 ميكرولتر من عينة من الحمض النووي، ويخلط مع 6X تشغيل صبغ لتصور وتسهيل التحميل).
  5. تشغيل هلام حتى يهاجر الصبغة حوالي 2/3 طول هلام (على سبيل المثال، 45 دقيقة في 150 V). تصور العصابات DNA تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

النتائج

ولوحظ dGuo أن يكون لها الوقت الاحتفاظ 4.7 دقيقة في حين كان 8 أوكسو dGuo فترة الاحتفاظ حوالي 6.4 دقيقة (الشكل 2A وباء). هناك اختلاف حول 1000 أضعاف في مرتفعات الذروة بين التحاليل اثنين، كما يظهر في الشكل 2C. تم الحصول على Voltammograms لمدة 8-أوكسو dGuo وdGuo وفقا للمعايير الت...

Discussion

على الرغم من أن 8 أوكسو dGuo تم الإبلاغ عن العلامات البيولوجية مفيدة للأكسدة الحمض النووي، يمكن تقدير لها موثوق تحديا. على الرغم من أن العديد من الطرق التي نشرت موجودة، وهناك حاجة ل، نظرة عامة وصفية شاملة للبروتوكول للسماح للباحثين لنشر الأسلوب في مختبراتهم. نحن هنا تق?...

Disclosures

No conflict of interest or competing financial interests declared.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مبادرة وزارة الصحة الكندية الجينوم بحوث والتنمية (GRDI) والاستراتيجية التنظيمية الكندية للتكنولوجيا الحيوية (CRSB). الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
8-oxo-dGuo standardCayman Chemical Company89320Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphataseSigma-AldrichP5931From E. coli
Chelex 100Sigma-AldrichC7901Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylateSigma-AldrichD9533
dGuo standardSigma-AldrichD7145
Dibasic sodium phosphateSigma-AldrichS9390
DNA from salmon spermSigma-AldrichD1626Sodium salt
DNase ISigma-AldrichD4527TypeII, from bovine pancreas
DNAzolInvitrogen10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE4884The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K mediaATCC30-2004
Foetal bovine serumATCC30-2020
Guard columnChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 0204GCProtects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Monobasic sodium phosphateSigma-AldrichS9638
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140-122
Phosphate buffered salineInvitrogen15190-250
Phosphodiesterase I enzyme Sigma-AldrichP3243Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizerThomas Scientific7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectivelyVolume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
TrypsinInvitrogen15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silicaChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 1546WT

References

  1. Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
  2. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
  3. Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
  4. Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
  5. Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
  6. Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
  7. Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
  8. Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
  9. Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
  10. Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
  11. Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
  12. Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
  13. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
  14. Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
  15. Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
  16. Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
  17. Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
  18. Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
  19. Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
  20. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
  21. Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
  22. Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
  23. Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
  24. Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
  25. . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

102 8 7 8 2 deoxyguanosine 8 2 deoxyguanosine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved