A medição por HPLC do ADN Oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais

Resumo

O objectivo do presente protocolo é a detecção do marcador de oxidação do DNA, 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo) por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais.

Resumo

O stress oxidativo está associado a diversos processos fisiológicos e patológicos, assim como o metabolismo xenobiótico, levando a oxidação de biomacromoléculas, incluindo ADN. Portanto, a detecção eficiente de oxidação do DNA é importante para uma variedade de disciplinas de investigação, incluindo a medicina e toxicologia. Um biomarcador comum de ADN é danificado oxidativamente 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo; erroneamente frequentemente referido como 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OH-dGuo ou 8 -oxo-dG)). Vários protocolos de medição 8-oxo-dGuo por cromatografia líquida de alta pressão com detecção electroquímica (HPLC-ED) foram descritos. No entanto, estas foram principalmente aplicada a ADN purificado tratados com pró-oxidantes. Além disso, devido a diferenças metodológicas entre laboratórios, principalmente devido às diferenças de equipamento analítico, a adoção de métodos publicados para a detecção de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED requer otimização cuidadosa de cada laboratório. UMAprotocolo abrangente, que descreve este processo de otimização, é inexistente. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para a detecção de 8-oxo-dGuo por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais. Ele ilustra como a preparação da amostra de ADN podem ser facilmente e rapidamente optimizada para minimizar a oxidação do ADN indesejáveis ​​que podem ocorrer durante a preparação da amostra. Este protocolo demonstra como detectar 8-oxo-dGuo em células humanas cultivadas adenocarcinoma alveolar (isto é, células A549) tratadas com o agente oxidante KBrO _3, e a partir do baço de ratinhos expostos ao hidrocarboneto aromático policíclico dibenzo (DEF, p) criseno (DBC, anteriormente conhecido como dibenzo (a, l) pireno, DalP). Em geral, este trabalho ilustra como uma metodologia de CLER-ED pode ser facilmente optimizado para a detecção de 8-oxo-dGuo em amostras biológicas.

Introdução

Espécies reativas de oxigênio (ROS), cujos níveis de estado estacionário pode aumentar durante muitas condições patológicas e metabolismo xenotoxic, contribuir para um aumento da frequência de dano oxidativo ao DNA. Entre os vários possíveis nucleobases produtos de oxidação, lesões oxidativas do ADN pode ser facilmente medida utilizando o marcador estável de 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo), que é uma das formas oxidadas de 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) ^1. 8-oxo-dGuo é o mais abundante lesão de DNA ² e, por conseguinte, foi estudada a maior detalhe como um biomarcador oxidação DNA, apesar da existência de múltiplos produtos de oxidação de ADN ^3. Nos seres humanos, este dano pode ser reparado através de base de reparo de excisão por 8-oxoguanine glicosilase 1 (hOGG1) ^4. Se reparado, 8-oxo-dGuo pode contribuir para a formação da base de mutações de substituição de par (isto é, transversões de G para T) ^4. Importante, 8-oxo-dGuo é um marcador estabelecido fodano do ADN r em relação à iniciação e promoção da carcinogénese ^2. Portanto, a quantificação precisa de 8-oxo-dGuo é um biomarcador útil e desejável de dano oxidativo ADN ^5.

Há uma confusão generalizada na literatura sobre os nomes corretos para as formas oxidativamente-danificadas do 2-desoxiguanosina e, além disso, o nome correto do composto (s) medidos rotineiramente como um biomarcador de dano oxidativo DNA ^6. Os 6,8-diceto-enol e 6, 8-ceto formas tautoméricas de 8-oxo-dGuo (mostrado na Figura 1) são os dois tautómeros mais proeminentes discutidos na literatura ^5,7. A forma de ácido 6,8-diceto é a forma mais proeminente a pH fisiológico de 7,4, e é o mais proeminente do produto de oxidação de DNA ^7. Portanto, 8-oxo-dGuo, em vez de 8-hidroxi-dGuo é o nome mais adequado para este produto de oxidação ^6. É também importante notar que a 2-desoxiguanosina (dGuo), em vez de nucleobase guanina (Gua) ou guanosina ribonucleósido (Guo), respectivamente, é detectado pela maioria dos métodos ^6.

Detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo preciso é um desafio devido a: i) a variabilidade na digestão da amostra de ADN, ii) oxidação acidental de dGuo a 8-oxo-dGuo que pode ocorrer durante a preparação da amostra, e iii) a necessidade eficaz para validação do método de HPLC analítico ^ED-8. Neste protocolo, com vista à consecução i) proporcionando condições favoráveis, para a digestão completa do ADN e ii) pela inclusão quelante de metal e soluções tratados com quelantes e um reagente especial de isolamento de DNA, enquanto iii) foi apenas parcialmente abordados pela inclusão de controlos positivos e proporcionando, assim, que o método é capaz de detectar 8-oxo-dGuo em amostras biológicas. Além disso validação está além do escopo deste artigo. No entanto, estamos confiantes de que este protocolo vai ajudar o prospectivoutilizadores determinar a extensão em que eles precisam validar formalmente o protocolo, dependendo das suas finalidades. Uma lista dos passos requeridos para a validação formal do método é ainda proporcionado. Durante o desenvolvimento e implantação de um método de detecção 8-oxo-dGuo, métodos publicados foram revistos e consolidados. Assim, este método elimina a necessidade de recolher informações a partir de várias fontes publicadas que carecem frequentemente importantes detalhes experimentais ao mesmo tempo proporcionar meios rápidos e simples de testar se o método para a detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo foi adoptada com sucesso. Este método foi adaptado empregue com sucesso para analisar amostras de ADN a partir de células cultivadas e tecidos de murino. Este artigo de vídeo ajudará outros grupos no estabelecimento de um método eficaz para a detecção e quantificação fiável de 8-oxo-dGuo por CLER-ED.

Protocolo

Certifique-se de que todos pecuária, acomodação, manuseamento e experimentação aderir às regras e regulamentos locais e que os protocolos de experimentação sejam aprovadas antes de iniciar qualquer estudo. Para as experiências descritas, cuidados animais, manipulação e tratamento foram aprovados pelo Comitê Animal Care a Health Canada. Consulte a "Tabela de Reagentes" para obter informações dos fornecedores.

1. Coleta de Amostras Biológicas

1. As células ou tecidos animais
   1. Cultivar células do adenocarcinoma A549 alveolares humanos em meio F12-K contendo 10% de soro fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina.
   2. Semear as células em aproximadamente 1 milhão de células por uma placa de 10 cm. Para cada experiência, utilizam um conjunto de placas 12 no total (três placas de repetição por um biológica x quatro doses) para proporcionar ADN suficiente (80 ug) para a digestão enzimática e análise por HPLC.
   3. Quando a densidade de células torna-se maior do que aproxmadamente 70% da área da superfície da placa, meios de remover e lavar as células duas vezes com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4.
   4. No caso de células animais em cultura, usar KBrO ₃ como um controlo positivo.
      NOTA: se uma relação linear positiva entre concentração KBrO ₃ e frequência de 8-oxo-dGuo tem sido relatado na literatura ^9.
   5. Dissolver KBrO ₃ em PBS. Certifique-se de que a concentração final no meio de cultura celular é maior do que 1 mm, para obter um aumento estatisticamente significativo na 8-oxo-dGuo em relação a células de un-expostos. Adicionar a mesma concentração de KBrO ₃ a cada placa em série (por exemplo, placas de 12 10 cm).
   6. Incubar as placas durante 3 h a 37 ° C. Remova a mídia e lavar uma vez com PBS.
   7. Adicionar 1 ml de solução de tripsina (concentração de estoque de 2,5 g / ml) e incubar durante 3 min a 37 ° C.
   8. Lava-se com 4 ml de PBS, recolher as células a partir de cada conjunto num único polystyr 50 ml cónicoeno tubo de centrífuga, e centrifugar a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
   9. Remover PBS e armazenar o sedimento de células à temperatura de -80 ° C até análise posterior. Oxidação de ADN artificial pode ser ainda minimizado por isolamento nuclear, tal como descrito noutro local ^10.
2. Tecidos animais
   1. Dose animais, conforme necessário. Para este protocolo, adulto (9 semanas de idade) tratar masculino Muta rato por sonda oral por dia durante três dias consecutivos com 20 mg DBC / kg de peso corporal por dia dissolvido em azeite de oliva.
      NOTA: Este animal transgênico portos engenharia λ-bacteriófago e mutação do gene repórter lacZ de E. coli ¹¹ é usado para roedores transgênicos mutação ensaios ^12.
   2. Execute necropsia de animais, por exemplo, os ratos anestesiados pode usar isoflurano e, em seguida sacrificados através de deslocação cervical seguido de abertura da cavidade torácica. Piscar imediatamente tecidos congelados em nitrogênio líquido. Armazenar os tecidos a -80 ° C até à análise.
      NOTA: O momento da eutanásia após o tratamento pode ser uma outra variável importante (por exemplo, a oxidação do ADN era máxima a 72 h após a exposição ao ruído no cérebro de rato e de fígado ^13).

2. Extração de DNA, Precipitação e Wash (para os tecidos prosseguir diretamente para 2.2)

1. Homogeneizar as células coletadas em um tubo cônico de 50 ml de poliestireno centrífuga com 1 ml de DNA isolar agente como DNAzol. Usar uma pipeta de ponta de 1.000 ul, para dispersar o sedimento de células até a solução ficar homogénea. Transferir homogeneizado para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar em gelo durante 10-20 min. Continuar em 2.3.
2. Homogeneizar 15-20 mg de tecido em 1 ml de um homogeneizador de vidro portátil antiaderente contendo 500 ul de agente de isolamento de DNA. Delicadamente levantar e abaixar homogeneizador durante cerca de 1 min; tecidos moles requerem menos tempo. Tratamento suave garante menos de corte de DNA. Armazenar o homogeneizado em gelo durante cerca de 10-20 min.
3. PastilhaO homogeneizado por centrifugação durante 10 min a 10.000 x g e 4 ° C num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml cónico.
4. Transferir cuidadosamente o sobrenadante resultante em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml prestando muita atenção para evitar entrar em contato com o sedimento.
5. Precipitar o DNA do homogenado por adição de 0,5 ml de EtOH a 100% por 1 ml de homogenato. Inverta tubos 10 vezes para garantir o isolamento e reagente de EtOH são suficientemente misturados.
6. Neste ponto, o DNA é precipitado viscoso, enrolar-lo para uma ponta de pipeta de plástico (por exemplo, com uma capacidade máxima de retenção de 200 ul) e, em seguida, transferido para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml cónico.
   NOTA: centrifugação rápida pode ser empregue para remover qualquer lisado remanescente a partir do ADN isolado.
   (ADN de lavagem e de solubilização)
7. Adicione 1 ml de EtOH a 75% para o ADN isolado. Suspende-se o sedimento de DNA bem, invertendo os tubos 10 vezes.
8. Cuidadosamente decantar o etanol a partir do tubo. Certifique-se de que the ADN sedimentar varas para o lado do tubo. Armazenar os tubos verticalmente durante 1-2 min e usar uma pipeta para remover qualquer excesso de EtOH a partir do fundo do tubo.
9. Repetir a lavagem mais uma vez de ADN, e ou armazenar a amostra no seio de EtOH à temperatura de -20 ° C (estável durante vários meses) ou proceder imediatamente à digestão.
10. Dissolve-se o ADN em tampão de digestão (descrito abaixo) e, em seguida, quantificar utilizando métodos espectroscópicos normais (isto é, absorvância a 260 nm utilizando NanoDrop espectrofotómetro).

3. Digestão Enzimática

1. Prepare "tampão de digestão" combinando volumes apropriados (dependendo do número de amostras a ser digerido) de 50 mM de fosfato de Na monobásico (contendo 2,0 mM de KCl, 1,0 mM de desferal (DFO) e 200 mM _MgCl2) com 50 mM de fosfato de Na dibásico (também contendo KCl 2,0 mM, 1,0 mM de DFO e 200 mM _MgCl2). Cada amostra requer 4,0 ul monobásicos e 17,0 ul de solução de fosfato dibásico.
2. remover qualquer remanescente de EtOH a partir da parte inferior das amostras de tubos e seco ao ar durante cerca de 5 min. Certifique-se de que o DNA não seque completamente.
3. Dissolve-se 80 ug do DNA extraído em 21,0 ul de tampão de digestão, adicionar 1 unidade de ADNase I dissolvido em 2,0 mL de tampão de digestão.
4. Vortex levemente para alcançar uma boa mistura e incubar durante 1,5 horas a 37 ° C.
5. No final do período de incubação, adicionar 216,4 ml de solução de fosfato dibásico de Na 50 mM contendo 2,0 mM de KCl, 1,0 mM de DFO e 200 mM de _MgCl2.
6. Prepare "tampão de digestão-2" pela combinação de um volume de tampão de digestão com nove volumes de dibásico, 50 mM de fosfato de Na (com KCl 2,0 mM, 1,0 mM de DFO e 200 mM _MgCl2).
7. Adicionar 0,025 unidades de fosfodiesterase (PDE) eu enzima em 16,3 uL de tampão de digestão-2. Pipeta cima e para baixo durante alguns segundos, em seguida, vortex levemente para alcançar uma boa mistura e incubar durante 1,5 horas a 37 ° C.
8. Adicionar 00,4 unidades de fosfatase alcalina (AP) em 8,0 uL de tampão de digestão-2. Pipeta cima e para baixo durante alguns segundos, em seguida, vortex levemente para alcançar uma boa mistura e incubar durante 1,5 horas a 37 ° C. Adicionar 33,0 ul de MeOH de grau HPLC.
9. Executar amostras de ADN digerido por HPLC, como descrito a seguir, imediatamente ou armazenar a -80 ° C até à utilização para minimizar a oxidação. NOTA: Os passos de digestão de 1,5 hr aqui sugeridas são baseadas em tais intervalos sugeridos em outros lugares ⁹ e sobre as conclusões que os protocolos semelhantes alcançar a digestão de DNA completa ^9. Por isso, assumiu-se que o único factor limitativo para alcançar a digestão completa foi tempo e que a inibição da enzima e da amostra não homogeneidade foram negligenciáveis.

4. HPLC Run: Preparação da fase móvel, a instalação de Instrumentação e Manutenção

1. Use água ultrapura para preparar todas as soluções tampão e tratada com resina de alta resistência de união (por exemplo, Chelex 100: estireno divinylbecopolímero nzene com iminodiacetato íons que metais de transição com elevada afinidade de quelato) para minimizar a contaminação de metal e oxidação do DNA durante a preparação da amostra.
2. Preparar tampão fosfato de Na 250 mM, pH 6,2. Utilizar uma razão de 1: 3,6957 de fosfato de sódio dibásico (FW = 177,99 g / mol) para fosfato de sódio monobásico (FW = 119,98 g / mol).
   Exemplo: Por conseguinte, para uma solução de 3 L combinar 70,81 g de fosfato monobásico e 28,43 g de pó dibásico, adicionar água até a, por exemplo, 2,8 L e verificar que o pH da solução é 6,2. Ajustar o pH com 250 mono ou fosfato de sódio dibásico soluções mM, preparados separadamente e não por ácidos concentrados ou bases. Adicionar 2,24 g de KCl para se obter uma concentração de 10 mM de KCl.
3. Preparar a fase móvel em três frascos, pelo menos, 1 L de cada vez, contendo: solvente B - metanol de grau HPLC, solvente - B de água ultrapura, e solvente C - tampão de fosfato a partir do passo 4.2. Insira HPLC tubulação de fornecimento de fase móvel para as garrafas; remainitubos ng deve ser também mergulhado numa das garrafas (por exemplo, solução C) preparada e mesmo que não são necessários para a mistura.
4. Durante o funcionamento, misturar as soluções de fase móvel como 6% de solvente A, 74% de solvente B e 20% de solvente C para se obter uma solução final de tampão de 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,2) com 2,0 mM de KCl, e 6% de MeOH.
5. Retire o eletrodo do detector eletroquímico, desmontá-lo e referência limpo e eletrodos que trabalham com as soluções de limpeza do eléctrodo e os discos para polir recomendados pelo fabricante. Lavar as superfícies limpas com água ultrapura, limpe a água com cuidado e garantir o detector está seca antes de ligar o sistema.
6. Remontar o detector e ligue a entrada de fase móvel para o eletrodo. Ligue o fluxo e permitir que a fase móvel, para encher o eléctrodo antes de acoplar o tubo de saída de fase móvel. Instale uma nova coluna antes de iniciar a otimização. Certifique-se de que a instalação está na direção correta e forma todas as recomendações do fabricante.
7. Ligue a instrumentação HLPC bem à frente (por exemplo, 1 hora) de amostra analisa a permitir o equilíbrio e para reduzir o ruído da linha de base. Ver Tabela 1 para configurações sugeridas; o limite da pressão de volta deve ser definida para 3000 psi para evitar danos coluna. Ligue o desgaseificador. Prossiga com injeção das bombas e da criação de gradiente de solvente.
8. Privilegiada a seco as bombas de acordo com as instruções do fabricante. Fazê-lo para molhar as linhas quando a fase móvel foi substituída ou o tubo de entrada está exposta ao ar.
9. Localize o disco priming e inserir a 10-15 ml seringa de plástico lá. Certifique-se a seringa está totalmente inserido antes de abrir a linha. Para abrir as linhas simplesmente virar o sentido anti-horário disco por um turno.
10. Comece o primo com a selecção da interface HPLC apropriado. Com cuidado, puxe a seringa para extrair o líquido para as linhas. Uma vez que líquido está fluindo, o principal é completo; permitir que o programaterminar a corrida. Repita o procedimento para todas as linhas (geralmente quatro, dependendo do instrumento).
11. Em alternativa, prima molhados quando as linhas já estão molhadas de uma privilegiada seco antes (veja abaixo).
    NOTA: Quando uma grande quantidade de tempo decorrido entre os usos (por exemplo, 2 semanas ou mais), um primo seco é recomendado.
12. Alterar a composição dos componentes solventes de fase móvel de 25% de cada um utilizando a interface do utilizador de HPLC. A partir da interface, selecione a opção "Função directa", em seguida, selecionar a opção "Wet Prime". Isto irá primos todas as linhas ao mesmo tempo.
13. Certifique-se de que todo o ar está fora do sistema, observando a linha principal molhado, uma vez que entra no recipiente de resíduos. Depois de uma boa privilegiada, garantir que não há bolhas são deixados na linha. Se bolhas persistir, repita priming.
14. Uma vez que a bomba está preparado, começam a se mover a fase móvel de HPLC. Utilizar a interface de HPLC para alterar manualmente a composição da fase móvel para metanol a 6% (solvente A) e 94%água (solvente B), e seleccionar uma taxa de fluxo de 0,9 ml / min. Permitir 5 minutos para limpar qualquer metanol a partir do passo de limpeza coluna.
15. Depois de 5 minutos, para alterar a composição de 6% de metanol (solvente A), 74% água (solvente B), tampão de 20% (solvente C), aumentar a taxa de fluxo de 1,0 ml / min. Definir outros parâmetros, como resumido na Tabela 1, e definir o limite da pressão de volta para 3000 psi para evitar danos coluna.
    NOTA: Os problemas potenciais com a configuração HPLC incluem linha de base à deriva, pico dividida e intensidade do sinal diminui. Estes geralmente podem ser superados com a limpeza da coluna após cada utilização, de limpeza do eléctrodo freqüente, e garantir que as soluções tampão são livres de contaminação (por exemplo, partículas em suspensão ou crescimento microbiano).
16. Executar a fase móvel durante cerca de 1-1,5 horas para atingir um sinal de linha de base estável.
17. Utilizando a interface de software do instrumento, seleccione os parâmetros como indicados na Tabela 1 e conjunto de tempo de corrida a 15 min. Injectar a sample. Use aumento dos tempos de execução para amostras complexas (determinar esta empiricamente por observação da presença ou ausência de picos para além do intervalo de 15 min).
    NOTA: O software Instrumento permite a programação de condições de execução de amostra e configuração para autosampling.
18. Após as corridas foram concluídos, desligar o detector de célula usando a interface do detector. É importante seguir as recomendações do fabricante em relação a desligar o detector como manuseio inadequado e shut-down pode danificar o instrumento. NÃO desligue o celular por mudar parte de trás do detector, pois isso pode danificar o instrumento.
19. Alterar manualmente a composição da fase móvel a 6% de metanol e 94% de água. Corra por 5 min.
20. Reduzir manualmente a taxa de fluxo de 0,7 ml / min, imediatamente alterar a composição para 50% de MeOH e 50% de água. Executado por pelo menos 20 min. A falha para executar esta etapa durante o tempo recomendado pode resultar em danos para a coluna e o detector. Desligue o fluxo, umad, em seguida, desligue o desgaseificador.

5. Preparação de Normas

1. Preparar tampão de fase móvel como descrito nas etapas 4,1-4,3 acima. É importante utilizar a fase móvel de HPLC para a preparação de padrões para evitar picos resultantes da mistura de soluções diferentes após a injecção da amostra.
2. Dilui-se esta solução de uma em cada cinco com água ultrapura antes da utilização, e a solução final deve conter 6% de MeOH.
3. dGuo Padrão
   NOTA: O potencial de alta oxidação necessário para a detecção dGuo pode aumentar o risco de medição compostos interferentes electroactivos. Isto pode ser verificada por meio de, por exemplo, uma curva-padrão de detecção de UV a 260 nm dGuo e comparando-a com a curva padrão criada com detecção CE. Se ambos alinham bem (por exemplo, Figura Suplementar 1) e os efeitos da matriz de amostra foram tomados em consideração, pode-se proceder à detecção dGuo por UV a 260 nm, em vez de detecção CE.
   1. Medir 1,0 mg de dGuo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 1,0 ml de MeOH de grau HPLC.
   2. Vortex em alta velocidade até dGuo se dissolva completamente. Este é o estoque primário; armazenar a -20 ° C durante várias semanas.
   3. Para criar o estoque dGuo secundário (0,5 mM), diluir 143 ul de estoque primário dGuo em 857 mL de fase móvel de HPLC. Armazenar em gelo até o uso e preparar diariamente.
   4. Fazer diluições adicionais para criar uma curva padrão (por exemplo, a Tabela 2). Soluções de loja no gelo e preparar diariamente. Padrões são executados em série com amostras experimentais.
   5. Antes de se executar, variar a tensão do detector utilizando a concentração mais elevada do estoque para encontrar tensão óptima.
4. 8-oxo-dGuo Padrão
   1. Medir 1,0 mg de 8-oxo-dGuo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 0,1 ml de MeOH de grau HPLC. Vortex na alta velocidade até 8-oxo-dGuo se dissolva completamente. Esta é a principal estoque de 8-oxo-dGuo. Armazenar a -20 ° C durante sevsemanas Gerais.
   2. Em um tubo separado, misture 2,9 ul de estoque primário e 997,1 mL de tampão de fase móvel de HPLC, vortex. Este é o estoque secundário (10.000 nM).
   3. Para criar uma solução de trabalho para a curva padrão (250 nM), combinar 24,4 ul de estoque secundário e 975,6 uL de tampão de fase móvel.
   4. Realizar outras diluições para fornecer as soluções necessárias para criar uma curva padrão (por exemplo, Tabela 3). Soluções de loja no gelo e preparar diariamente. Normas de execução com as amostras experimentais.
5. Quantificação
   1. Integrar a área sob a curva para ambos 8-oxo-dGuo e dGuo usando o software padrão (como uma parte da interface de computador-HPLC; ver Figura 2A Recurso).
   2. Construir curva padrão (concentração conhecida de cada analito vs a área sob a curva (Figura 2B Recurso). Utilizando a equação da curva padrão, para calcular a relação 8-oxo-dGuo / dGuo para cada amostra.

6. Agarose Gel Eletroforese

NOTA: electroforese em gel de agarose podem ser realizados para verificar a integridade de digestão de ADN.

1. Prepare 50x Tris-acetato-EDTA (TAE) tampão, dissolvendo-se 242 g de base Tris (FW = 121,14) em 750 ml de água ultrapura. Adicionar 57,1 ml de ácido acético glacial e 100 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8,0; EDTA se dissolverá completamente quando o pH da solução é ajustado a 8,0 com, por exemplo, NaOH) e adicionar água ultrapura até um volume final de 1 L. loja à TA, diluir esta solução 50x antes da utilização.
2. Pesam-se 1 g de agarose e dissolvê-lo em 100 ml de tampão 1x TAE, aquecimento no microondas durante 1-2 min. Usar óculos e equipamentos de proteção para evitar contato com agarose fervente.
3. Arrefecer a solução para baixo até aproximadamente 50 ° C, adicionar 5 mL de brometo de etídio (cuidado: mutagênico) e deite-o no aparelho de gel de agarose em execução. Insira o pente.
4. Aguardar até que a solução solidifica, derrame tampão TAE sobre o gel e carregar as amostras (de volume depende do tamanho pente; tipicamente, 10-20 ul da amostra de DNA é carregado, misturado com corante 6x correndo para visualizar e facilitar o carregamento).
5. Submeter o gel até o corante migra aproximadamente 2/3 do comprimento do gel (por exemplo, 45 minutos a 150 V). Visualize as bandas de ADN sob a luz UV.

Resultados

dGuo foi observado a ter um tempo de retenção de 4,7 minutos enquanto que 8-oxo-dGuo teve um tempo de retenção de aproximadamente 6,4 minutos (Figura 2A e B). Há uma diferença de cerca de 1.000 vezes em as alturas dos picos entre os dois analitos, como pode ser visto na Figura 2C. Voltamogramas de 8-oxo-dGuo e dGuo foram obtidos por padrões que funcionam a um potencial de trabalho na gama de 0,2-1,1 V. O potencial de trabalho óptima para o 8-oxo-dGuo foi determi...

Discussão

Apesar de 8-oxo-dGuo foi classificado como um biomarcador útil de oxidação do DNA, a sua quantificação confiável pode representar um desafio. Embora existam vários métodos publicados, há uma necessidade de uma visão abrangente, descritivo de protocolo para permitir que pesquisadores para implantar o método em seus laboratórios. Aqui apresentamos uma visão detalhada de um protocolo baseado em HPLC que irá permitir novos usuários para estabelecer um método eficaz para a detecção e quantificação de 8-ox...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-oxo-dGuo standard	Cayman Chemical Company	89320	Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphatase	Sigma-Aldrich	P5931	From E. coli
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901	Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylate	Sigma-Aldrich	D9533
dGuo standard	Sigma-Aldrich	D7145
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9390
DNA from salmon sperm	Sigma-Aldrich	D1626	Sodium salt
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527	TypeII, from bovine pancreas
DNAzol	Invitrogen	10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E4884	The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K media	ATCC	30-2004
Foetal bovine serum	ATCC	30-2020
Guard column	Chromatographic Specialties	YBA 99S03 0204GC	Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Monobasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered saline	Invitrogen	15190-250
Phosphodiesterase I enzyme	Sigma-Aldrich	P3243	Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizer	Thomas Scientific	7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively	Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
Trypsin	Invitrogen	15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silica	Chromatographic Specialties	YBA 99S03 1546WT