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요약

이 프로토콜의 목적은 DNA 산화 마커의 검출이다 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 배양 된 세포 또는 동물 조직으로부터 DNA (8 옥소 dGuo) HPLC-ED 의해.

초록

산화 스트레스는 DNA를 포함한 생체 거대 분자의 산화로 이어지는 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정뿐만 아니라, 생체 이물 대사와 관련된다. 따라서, DNA의 산화를 효율적으로 검출은 의학 및 독성학 연구 분야를 포함한 다양한 중요하다. 산화 적 DNA 손상의 일반적인 바이오 마커는 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 신 (8 옥소 dGuo이다 종종 잘못이라 -8- 하이드 록시 -2'- 데 옥시 구아노 신 (8-OH-dGuo 8 옥소 - DG)). 전기 화학적 검출 (HPLC-ED)와 고압 액체 크로마토 그래피로 -8- 옥소 dGuo 측정을위한 여러 프로토콜들이 설명되었다. 그러나, 이들은 주로 산화 촉진제로 처리 DNA 정제에 적용 하였다. 또한, 때문에 주로 분석 장비의 차이에 실험실 사이의 방법 론적 차이에, HPLC-ED 8 옥소 dGuo의 검출을위한 공개 방법의 채택은 각 실험실에 의해 조심 최적화가 필요합니다.이러한 최적화 과정을 설명하는 포괄적 인 프로토콜은 결여되어있다. 여기서, 상세한 프로토콜은 배양 된 세포 또는 동물 조직으로부터 DNA에 의해 HPLC-ED -8- 옥소 dGuo의 검출에 대하여 설명한다. 이는 DNA 샘플 제조 용이하고 신속하게 샘플 제조 동안 발생할 수있는 바람직하지 않은 DNA의 산화를 최소화하기 위해 최적화 될 수있는 방법을 예시한다. 이 프로토콜은 산화제 KBrO 3 처리 배양 된 폐포 선암 세포 (즉, A549 세포)에 -8- 옥소 dGuo를 검출하고, 다환 방향족 탄화수소 디 벤조 (DEF, P) 크리 센에 노출 된 마우스의 비장에서하는 방법을 보여준다 (구 디 벤조 (A, L) 피렌로 알려진 DBC, DalP). 전반적으로,이 작품은 HPLC-ED의 방법론은 쉽게 생체 시료 8 옥소 dGuo의 검출에 최적화 할 수있는 방법을 보여줍니다.

서문

누구의 정상 상태 수준의 많은 병리학 적 조건 xenotoxic 대사 중에 증가 할 수 반응성 산소 종 (ROS)는, 산화 DNA 손상의 빈도 증가에 기여한다. 여러 가지 뉴 클레오 산화 생성물 중 산화성 DNA 손상이 용이하게 안정 마커를 사용하여 측정 할 수 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 신 (2)의 산화 된 형태 중 하나이다 (8- 옥소 dGuo) ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. -8- 옥소 dGuo 따라서, 여러 DNA 산화 생성물 (3)의 존재에도 불구하고 DNA 산화 등의 바이오 마커에 ​​더 상세히 연구되어, 가장 풍부한 DNA 병변 2이고. 인간에있어서, 이러한 손상은 8 oxoguanine 글리코 1 (hOGG1) (4)에 의해 염기 절제 복구를 통해 복구 될 수있다. 수리되지두면 -8- 옥소 dGuo베이스 페어 치환 돌연변이의 형성 (즉, G는 transversions를 T로)에 기여할 수있다 (4). 중요한 -8- 옥소 dGuo은 확립 마커 FO는시작과 암 발생이 촉진 관련 R의 DNA 손상. 따라서 -8- 옥소 dGuo의 정확한 정량화는 산화 적 DNA 손상 (5)의 유용하고 바람직한 바이오 마커이다.

또한, 화합물 (들)의 정확한 이름 일상적 산화성 DNA 손상 (6)의 바이오 마커로서 측정 산화 손상-2- 데 옥시 구아노 형태 및 대한 정확한 명칭에 관한 문헌에서 광범위 혼란이있다. -8- 옥소 dGuo (도 1에 도시)의 6,8- 디케 및 6- 에놀 8 케토 호변 이성질체 형태는 문헌에서 논의 5,7- 개의 가장 두드러진 호변이다. 6,8- 디케 형태는 7.4의 생리 학적 pH에서 가장 두드러진 형태이고, 가장 눈에 띄는 DNA 산화 생성물 7이다. 따라서 -8- 옥소 dGuo가 아닌 8- 히드 록시 dGuo이 산화 생성물 (6)에 대해 가장 적절한 이름이다. 그것은 오히려 nucleob보다, 그 2 구아노 (dGuo)을주의하는 것이 중요하다ASE의 구아닌 (GUA) 또는 리보 구아노 신 (구오)는 각각 대부분의 방법 (6)에 의해 검출된다.

정확한 검출 및 -8- 옥소 dGuo의 정량화 인해 도전 : DNA 샘플의 소화 I)의 변동, ⅱ) 외래성 샘플 제조 동안 발생할 수 -8- 옥소 dGuo에 dGuo의 산화, 및 ⅲ) 필요 분석 HPLC-ED 방법 (8)의 효과 검증을위한. 이 프로토콜에서, 우리는 완전한 DNA 소화에 유리 및 II) 함유 금속 킬 레이터 및 킬 레이터 처리 용액 및 특별한 DNA 분리 용 시약에 의해 ⅲ) 부분적으로 만의 포함에 의해 해결되는 동안의 조건을 제공함으로써 i)를 달성하는 것을 목표 양성 대조군은 따라서 방법은 생물학적 샘플에서 -8- 옥소 dGuo를 검출 할 수있는 것을 제공한다. 또한 검증은이 문서의 범위를 벗어납니다. 그러나, 우리는이 프로토콜은 미래의 도움이 될 것으로 확신한다사용자들은 그들 자신의 정식 목적에 따라 프로토콜을 검증 할 필요가있는 범위를 결정한다. 방법의 형식적인 검증을 위해 필요한 단계의리스트를 더 제공된다. 8 옥소 dGuo 검출을위한 방법의 개발 및 배포하는 동안, 출판 방법을 검토하고 통합했다. 따라서,이 방법은 8 옥소 dGuo의 검출 및 정량 방법을 성공적으로 채택되어있는 경우도 시험을 신속하고 간단한 방법을 제공하는 동시에 자주 중요한 실험 세부 결여 여러 공개 소스로부터 정보를 수집 할 필요가 없다. 이 적응 방법은 성공적으로 배양 된 세포 및 조직에서 쥐의 DNA 시료를 분석하는 데 이용 하였다. 이 비디오 기사는 HPLC-ED에 의해 신뢰할 수있는 탐지 및 8 옥소 dGuo의 정량화를위한​​ 효과적인 방법을 확립 다른 그룹에 도움이 될 것입니다.

프로토콜

확인 모든 축산, 주택, 처리 및 실험이 지역의 규칙과 규정을 준수하고 실험 프로토콜이 어떤 연구를 시작하기 전에 승인됩니다. 설명 실험을 위해, 동물 보호, 처리, 치료는 건강 캐나다 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 공급 업체의 자세한 내용은 "시약 테이블"을 참조하십시오.

1. 생체 시료 수집

  1. 세포 또는 동물의 조직
    1. 10 % 소 태아 혈청, 페니실린 100 유니트 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 100 ㎍ / ml를 함유 F12-K 배지에서 인간 폐포 선암종 A549 세포 성장.
    2. 10 cm 판 당 약 1 백만 세포에서 종자 세포. 각각의 실험, 효소 소화 및 HPLC 분석에 대한 총 12 판 (한 생물 복제 X 사 용량 당 3 개의 판)이 충분한 DNA (80 μg의)를 제공하는 세트를 사용합니다.
    3. 세포 밀도는 약 넘을 때펼쳐줍니다 플레이트 면적의 70 %는, 미디어를 제거하고 인산 완충 식염수를 4 ㎖ (PBS), pH를 7.4로 두 번 세포를 씻어.
    4. 배양 된 동물 세포의 경우, 양성 대조군으로 KBrO 3을 사용한다.
      주 : 농도 및 3 KBrO -8- 옥소 dGuo 주파수 사이의 양의 선형 관계는 문헌 9에보고되었다.
    5. PBS에 KBrO 3 녹인다. 세포 배양 배지에 최종 농도가 미노 세포 -8- 옥소 dGuo 비해 통계적으로 유의 한 증가를 얻기 위해 1mm 이상인지 확인. 시리즈 (예를 들어, 12 10-CM 플레이트)의 각 판에 KBrO 3의 동일한 농도를 추가합니다.
    6. 37 ℃에서 3 시간 동안 번호판을 품어. 용지를 제거하고 PBS로 한 번 씻는다.
    7. 트립신 용액 중 1 ㎖ (스톡 농도 2.5 g / ㎖)를 첨가하고, 37 ℃에서 3 분 동안 배양한다.
    8. 하나의 50 ML 원뿔 polystyr로 설정 한 각에서 세포를 수집, 4 ㎖의 PBS로 세척4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에 엔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기.
    9. PBS를 제거하고 추가 분석 할 때까지 -80 ° C에서 세포 펠렛을 저장합니다. 다른 곳에서 기술 된 바와 같이 10 인공 DNA의 산화는 또한 핵 단리에 의해 최소화 될 수있다.
  2. 동물 조직
    1. 필요에 따라 동물을 복용량. 이 프로토콜의 경우, 성인 (나이 9 주) 올리브 오일에 용해 20 mg의 DBC / kg bw의 당 하루에 세 가지 일 동안 매일 구강 투여에 의해 남성 무타 마우스를 취급합니다.
      참고 :이 형질 전환 동물 항만 설계 (E)에서 λ-박테리오파지 및 돌연변이 리포터 유전자의 lacZ 대장균 (11)는 형질 전환 쥐 돌연변이 분석 (12)에 사용됩니다.
    2. 동물 부검의 예를 수행, 마우스 이소 플루 란을 사용하고 흉강 개방 다음에 자궁 경부 전위를 통해 안락사 수 마취. 즉시 액체 질소에 동결 조직을 깜박입니다. 분석 할 때까지 -80 ℃에서 저장 조직.
      주 : 치료 후 안락사 타이밍은 또 다른 중요한 변수 일 수있다 (예를 들면, DNA의 산화는 쥐의 뇌 및 간 (13) 내의 소음 노출 후 72 시간에서 최대였다).

2. DNA를 추출, 침전 및 세척 (조직 2.2에 직접 진행을 위해)

  1. 이러한 DNAzol 같은 DNA 단리 제 1 ㎖와 50 ㎖ 원뿔형 폴리스티렌 원심 분리 튜브에 수집 한 세포 균질화. 용액을 균질해질 때까지 세포 펠렛을 분산시키기 위해 1000 μL 피펫 팁을 사용한다. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 균질을 전송합니다. 10-20 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 2.3 진행합니다.
  2. 500 μL의 DNA 솔 레이팅 제를 함유 한 용액 휴대용 붙지 유리 균질화에 15-20 mg의 조직을 균질화. 조심스럽게 제기하고 약 1 분 동안 낮은 균질; 부드러운 조직은 적은 시간이 필요합니다. 젠틀 치료는 DNA의 작은 전단을 보장합니다. 약 10 ~ 20 분 동안 얼음에 균질을 저장합니다.
  3. 작은 공10,000 XG에 10 분, 1.5 ML 원뿔 microcentrifuge 관에서 4 ° C에 대한 원심 분리하여 균질.
  4. 조심스럽게 펠렛을 접촉하지 않도록주의를 지불하는 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 상층 액을 전송합니다.
  5. 균질 물 1 ㎖ 당 0.5 ml의 100 %의 EtOH를 첨가하여 파쇄로부터 DNA를 침전. 단리 시약을 보장하기 위해 관 (10) 및 전환 시간을 EtOH 충분히 혼합한다.
  6. 이때, DNA 침전물 (200 μL의 최대 유지 용량, 예) 플라스틱 피펫 팁에 그것을 스풀 다음 새로운 1.5 ml의 원추형 마이크로 원심 튜브로 옮겨, 점성이다.
    주 : 빠른 원심 분리 DNA로부터 나머지 파쇄물을 제거하는데 이용 될 수있다.
    (DNA 세척 및 가용화)
  7. 분리 된 DNA와 75 %의 EtOH 1 ML을 추가합니다. 튜브 10 회 반전 철저하게 DNA 펠렛을 일시 중단합니다.
  8. 조심스럽게 튜브에서 에탄올을 가만히 따르다. 그 일을 확인E DNA는 튜브 측으로 스틱 펠렛. 1 ~ 2 분 동안 수직으로 튜브를 저장하고 관의 바닥에서 초과의 EtOH를 제거하기 위해 피펫을 사용합니다.
  9. DNA가 한 번 더 씻어 반복 한 (몇 달 동안 안정) 또는 즉시 소화를 진행 -20 ° C에서의 EtOH의 샘플을 저장 중 하나.
  10. 소화 버퍼 DNA (후술)를 용해시키고, 다음 (즉, 260 nm에서의 흡광도는 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여) 분광 표준 방법을 사용하여 정량화.

3. 효소 소화

  1. 적절한 양을 결합하여 "분해 완충액"준비 염기성 나트륨 포스페이트 50 mm의 이염 나트륨 포스페이트 (2.0 mM의 KCl을 1.0 밀리미터 desferal (DFO), 200 mM의의 MgCl 2를 함유)의 50 mM의 (샘플의 개수에 따라 분해 될) (또한, 2.0 mM의 KCl을 1.0㎜, 및 200 mM의 DFO의 MgCl 2를 함유). 각 샘플 염기 4.0 μL와 17.0 μL 이염 인산 솔루션이 필요합니다.
    2. <리> 약 5 분 동안 튜브와 공기 건조 시료의 바닥에서 남아의 EtOH를 제거합니다. DNA가 완전히 건조하지 않도록하십시오.
  2. , 소화 버퍼의 21.0 μL 80 μg의 추출 된 DNA를 녹여 내가 소화 버퍼의 2.0 μL에 용해 DNase의 1 단위를 추가합니다.
  3. 소용돌이 가볍게 철저한 혼합을 달성하고 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양한다.
  4. 인큐베이션 기간의 끝에서, 2.0 mM의 KCl을 1.0㎜, 및 200 mM의 DFO의 MgCl 2를 함유하는 이염의 50 mM 인산 나트륨 용액 216.4 μL를 추가한다.
  5. 이염 아홉 권, 50 mM의 나트륨 포스페이트 (2.0 mM의 KCl을 가진 1.0㎜, 및 200 mM의 DFO의 MgCl 2)로 소화 한 버퍼의 양을 결합하여 "분해 완충액-2"를 준비한다.
  6. 포스의 0.025 단위 (PDE) 내가 소화 버퍼-2의 16.3 μL에 효소를 추가합니다. 피펫 위아래로 몇 초 동안, 다음 가볍게 소용돌이는 철저한 혼합을 달성하고 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양한다.
  7. 0 추가소화 버퍼-2의 8.0 μL의 알칼리성 포스파타제 (AP)의 0.4 단위. 피펫 위아래로 몇 초 동안, 다음 가볍게 소용돌이는 철저한 혼합을 달성하고 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양한다. 33.0 μL를 HPLC 등급 메탄올을 추가합니다.
  8. 산화를 최소화하기 위해 사용할 때까지 -80 ° C에서 바로 아래에 설명 또는 저장소로, HPLC에 소화 DNA 샘플을 실행합니다. 참고 : 이러한 간격을 기반으로 여기에 제시 한 1.5 시간의 소화 단계는 유사한 프로토콜이 완료 DNA 소화 (9)을 달성하는 것이 다른 곳에서 9 결과에를 제안했다. 따라서, 유일한 제한 요소가 완료 소화 시간과 그 효소 저해 및 샘플 불균일성 무시할 있었다이었다 달성하는 것으로 가정 하였다.

4. HPLC 실행 : 이동상, 계측의 설치 및 유지 관리의 준비

  1. 모든 완충액을 제조 초순수를 사용하여 높은 접합 강도 수지 (예를 들어, 100로 처리 Chelex : 스티렌 divinylbe이미 노디 nzene 공중 합체와 높은 친 화성을 가진 전이 금속 킬레이트)를 샘플 제조 동안 금속 오염 및 DNA의 산화를 최소화하는 것이 이온.
  2. 250 mM의 나트륨 인산염 완충액, pH가 6.2을 준비합니다. (1)의 비율을 사용하여 인산 일 수소 나트륨 3.6957 (FW = 177.99 g / 몰), 인산 나트륨 (FW = 119.98 g / 몰) 염기하기.
    예 : 따라서, 3 패 원액을 위해, 염기의 70.81 g 및 이염 분말 28.43 g의 결합 예를 들어 물 위로를 추가, 2.8 L 및 용액의 pH가 6.2인지 확인합니다. 농축 된 산 또는 염기에 의해 개별적으로가 아니라 준비 250 MM의 모노 인산 나트륨 솔루션으로 pH를 조정합니다. 10 mM의 KCl을의 농도를 얻기 위해 KCl을 2.24 g을 넣고.
  3. 포함, 최소 1 패, 세 병에 각각 이동상을 준비 : 용매 B - HPLC 급 메탄올, 용매 - B 형 초순수, 및 용매 C - 4.2 단계에서 인산 완충액. 병에 HPLC 이동상 공급 튜브를 삽입; remainiNG 튜브는 병의 하나 (예를 들면, 용액 C)에 침지하고 이들이 혼합이 필요하지 않은 경우에도 프라이밍되어야한다.
  4. 동작 동안, 2.0 mM의 KCl을 50 mM의 인산 나트륨 완충액 (pH 6.2), 6 %의 MeOH 최종 용액을 달성하기 위해 6 % 용매 A, 74 % 용매 B, 20 % 용매 C로서 이동상 용액을 혼합한다.
  5. , 전기 화학적 검출기에서 전극을 분리 그것과 전극 청소 솔루션을 청소 참조 및 작동 전극과 제조업체에서 권장하는 연마 디스크를 분해. , 초순수로 세척 표면을 씻어 부드럽게 물을 닦아 낸 검출기에 시스템을 켜기 전에 건조되어 있는지 확인합니다.
  6. 검출기를 재 조립 및 전극에 이동상 입구를 연결합니다. 흐름을 켜고 이동상 콘센트 이동상 튜브를 연결하기 전에 전극을 채울 수 있습니다. 최적화를 시작하기 전에 새 열을 설치합니다. 확인이 설치는 올바른 방향과 F에모든 제조업체의 권장 사항을 ollows.
  7. 물론 앞서 (예를 들어, 1 시간) 샘플의 HLPC 기기를 켜고은 평형을 허용하고베이스 라인 노이즈를 줄이기 위해 분석한다. 권장 설정은 표 1을 참조하십시오; 배압 제한은 열 손상을 방지하기 위해 3000 PSI로 설정되어야한다. 탈기 장치의 전원을 켭니다. 펌프 프라이밍 및 용매 그라데이션을 설정을 진행합니다.
  8. 드라이 주요 제조업체의 지침에 따라 펌프. 이동상 교체 한 또는 튜브 입구가 공기에 노출 될 때 라인을 젖은이 작업을 수행합니다.
  9. 프라이밍 디스크를 찾아이 10 ~ 15 ML의 플라스틱 주사기를 삽입합니다. 주사기가 완전히 선을 열기 전에 삽입되어 있는지 확인합니다. 열려면 라인은 단순히 한 차례 디스크를 시계 반대 방향으로 돌립니다.
  10. 적절한 HPLC 인터페이스 선택과 총리를 시작합니다. 부드럽게 라인으로 유체를 그릴 주사기를 잡아 당깁니다. 유체가 흐르는되면, 총리가 완료된 것입니다; 프로그램을 허용실행을 완료합니다. 모든 라인 (기기에 따라 보통 4)에 대해 반복합니다.
  11. 또한, 선이 이미 이전 건조 프라임에서 습식 습식 프라임 (아래 참조).
    주 : 많은 시간을 사용 (예를 들면, 1 주 또는 그 이상)의 사이에 경과하면, 건조 프라임 권장된다.
  12. 25 % HPLC 사용자 인터페이스를 사용하여 각각 이동상 용매 성분의 조성을 변경한다. 인터페이스에서, 다음, "직접 기능"옵션을 선택 "웻 총리"옵션을 선택합니다. 이것은 동시에 프라임 모든 라인 것이다.
  13. 모든 공기가 폐 컨테이너를 들어가는 젖은 프라임 라인을 관찰하여 시스템 밖으로 있는지 확인합니다. 좋은 프라임 후, 기포가 줄에 남아 있지 않은지 확인합니다. 거품이 지속되면, 프라이밍 반복합니다.
  14. 펌프가 초기화되면, HPLC 이동상 이동 시작. 수동 6 % 메탄올 (용매 A)와 94 %로 이동상의 조성 변화 HPLC 인터페이스를 사용물 (용매 B)를 0.9 ㎖ / 분의 유속을 선택한다. 5 분 칼럼 세척 단계에서 모든 메탄올을 취소 할 수 있습니다.
  15. 5 분 후, 6 % 메탄올 (용매 A), 74 % 물 (용매 B), 20 % 완충액 (용매 C)로 조성을 변경 1.0 ㎖ / 분으로 유동 속도를 증가시킨다. 표 1에 정리하고, 열 손상을 방지하기 위해 3000 PSI에 배압 한도를 설정 한 다른 파라미터를 설정한다.
    참고 : HPLC 설치 잠재적 인 문제가 표류 기준, 분할 피크 감소 신호 강도를 포함한다. 이들은 일반적으로 각각의 사용, 자주 전극 세척 후 열을 청소하고, 완충 용액이 오염이없는 것을 보장함으로써 극복 할 수있다 (예를 들어, 입자상 물질 또는 미생물 성장).
  16. 안정된 기준 신호를 달성하기 위해 약 1.5 시간 동안 이동상을 실행합니다.
  17. 계기 소프트웨어 인터페이스를 사용하여, 다음 표 1과 15 분에 런타임으로하는 ​​파라미터를 선택. 샘 주사PLE. 복소 샘플에 대한 증가 된 실행 시간을 사용하여 (15 분 간격 이후 피크의 유무를 관찰하여이를 실험적으로 결정).
    참고 : 기기 소프트웨어는 autosampling 샘플 실행 조건의 프로그램 및 설정을 할 수 있습니다.
  18. 실행이 완료된 후, 검출기의 인터페이스를 사용하여 검출기 셀을 해제. 그것은 부적절한 취급으로 검출기의 전원을 끄지에 대한 제조업체의 권장 사항을 따라 기기를 손상시킬 수 있습니다 다운을 종료하는 것이 중요하다. 기기가 손상 될 수 있습니다이 같은 검출기의 뒷면을 전환하여 셀을 끄지 마십시오.
  19. 수동 6 % 메탄올 및 94 % 물 이동상 조성물을 변경. 5 분 동안 실행합니다.
  20. 수동 즉시, 0.7 ㎖ / min으로 유량을 감소 50 % 메탄올 및 50 % 물을 변경 조성물. 적어도 20 분 동안 실행. 실패는 컬럼 및 검출기가 손상 될 수 있습니다 권장 시간에 대해이 단계를 실행합니다. , 흐름을 해제다음 탈기 장치를 해제 거라고.

표준 5. 준비

  1. 위의 단계 4.1-4.3에 설명 된대로 이동상 버퍼를 준비합니다. 그것은 샘플 주입 후 이종 혼합 용액에 의한 피크를 피하기 위해 표준 제조 HPLC 이동상을 사용하는 것이 중요하다.
  2. 초순수는 사용 전에 다섯이 솔루션을 희석하고, 최종 솔루션은 6 % 메탄올을 포함해야합니다.
  3. dGuo 표준
    참고 : dGuo 감지에 필요한 높은 산화 전위는 전기 활성 화합물을 방해 측정의 위험을 증가시킬 수 있습니다. 이것은 예를 들어, 검증 될 수 있으며, 표준 260 nm에서의 UV dGuo 검출 곡선과 EC 검출로 작성된 표준 곡선과 비교. 모두가 잘 일치하면 (예를 들어, 보충도 1) 및 시료 매트릭스 효과가 고려되어, 오히려 하나 EC 검출보다 260 nm에서 UV에 의해 검출 dGuo로 진행할 수있다.
    1. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 dGuo 1.0 mg의 측정합니다. 1.0 ml의 HPLC 등급 메탄올을 추가합니다.
    2. dGuo까지 빠른 속도로 소용돌이가 완전히 용해. 이는 일차 스톡이다 몇 주 동안 -20 ℃에서 저장한다.
    3. 보조 dGuo 재고 (0.5 mm)를 만들려면, HPLC 이동상 857 μL에 차 dGuo 주식의 143 μl를 희석. 사용할 때까지 얼음에 저장하고 신선한 매일을 준비합니다.
    4. 표준 곡선을 만들기 위해 더 희석합니다 (예를 들어, 표 2). 얼음에 보관 솔루션과 신선한 매일을 준비합니다. 실험 샘플 일련의 실행 기준.
    5. 실행에 앞서, 최적의 전압을 찾는 콘텐츠의 가장 높은 농도를 사용하여 검출 전압을 변화.
  4. -8- 옥소 dGuo 스탠다드
    1. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 -8- 옥소 dGuo 1.0mg을 측정한다. 0.1 ml의 HPLC 등급 메탄올을 추가합니다. 8 옥소 dGuo까지 고속에 소용돌이가 완전히 용해. 이것은 -8- 옥소 dGuo의 주 콘텐츠이다. SEV에 대한 -20 ℃에서 보관대한 일반적인 주.
    2. 별도의 튜브에, 차 주식의 2.9 μL 및 HPLC 이동상 버퍼, 소용돌이의 997.1 μl를 결합합니다. 이 보조 주식 (10,000 ㎚)이다.
    3. 표준 곡선 (250 ㎚)에 대한 작업 솔루션을 만들려면, 보조 주식의 24.4 μL 및 이동상 버퍼의 975.6 μl를 결합합니다.
    4. 표준 곡선을 작성하는 데 필요한 솔루션을 제공하도록 추가로 희석을 수행 (예를 들어, 표 3). 얼음에 보관 솔루션과 신선한 매일을 준비합니다. 실험 샘플을 실행 기준.
  5. 부량
    1. 에 대한 곡선 아래 영역을 모두 통합 -8- 옥소 dGuo (HPLC-컴퓨터 인터페이스의 일부로서 부가도 2a 참조) 표준 소프트웨어를 사용 dGuo.
    2. 표준 곡선의 방정식을 사용하여. 표준 곡선 (곡선 (보충 그림 2B)에서 지역 대 각 분석의 알려진 농도를 구축 8의 비율을 계산옥소 dGuo 각 샘플에 대한 / dGuo.

6. 아가 로스 겔 전기 영동

주 : 아가 로스 겔 전기 영동은 DNA 소화의 완전성을 검증하기 위해 수행 될 수있다.

  1. 750 ml의 초순수에 242g 트리스베이스 (FW = 121.14)을 용해하여, 50 배 트리스 - 아세테이트 - EDTA (TAE) 버퍼를 준비합니다. 57.1 ml의 빙초산 및 0.5 M EDTA 100ml의 추가 (PH 8.0, EDTA 완전히 용액 pH를 예를 들어 8.0, NaOH로 조절 될 때 용해)와 RT에서 1 L. 스토어의 최종 부피 초순수를 추가 사용하기 전에이 솔루션의 50 배 희석.
  2. 아가로 오스의 1g을 달아 1-2 분 동안 전자 레인지에 100 ㎖ 1X TAE 버퍼, 가열에 용해. 아가로 오스 끓는과의 접촉을 피하기 위해 고글과 보호 장비를 착용 할 것.
  3. (: 돌연변이주의)와 아가 로스 젤 실행 장치에 부어 약 50 ℃까지 용액을 냉각, 5 μL 에티 디움 브로마이드를 추가합니다. 빗를 삽입합니다.
  4. (볼륨이 빗의 크기에 따라, 일반적으로 DNA 샘플의 10 ~ 20 μL를로드, 6 배 실행 염료와 혼합 시각화하고 로딩을 용이하게하기 위해), 솔루션 응고 될 때까지 기다립니다 겔상의 TAE 버퍼를 부어 샘플을로드합니다.
  5. 염료 겔의 약 2/3 길이를 마이그레이션까지 겔을 실행 (예를 들어, 45 분, 150 V에서). UV 광 하에서 DNA 밴드를 시각화.

결과

dGuo 8 옥소 dGuo 약 6.4 분 (도 2A와 B)의 체류 시간을 가졌다 반면, 4.7 분의 체류 시간이 관찰되었다. 도 2c에 도시 된 바와 같이 두 가지 분석 물질 간의 피크 높이의 약 1,000 배의 차이가있다. -8- 옥소 dGuo 및 dGuo위한 볼타 모 그램은 +1.1 +0.2 V로의 범위의 작동 전위로 실행 표준 얻었다 -8- 옥소 dGuo위한 최적의 작동 전위 +0.5 V 및 +0.9를 측정되었다 dGuo에 대한 V (그림 3).

토론

8 옥소 dGuo이 DNA의 산화의 유용한 바이오 마커로보고되었지만, 그것의 신뢰성 정량화 도전을 제기 할 수 있습니다. 여러 게시 방법이 존재하지만, 자신의 실험실에서 방법을 배포하는 연구자를 허용하는 프로토콜의 포괄적 인 개요 설명이 필요하다. 여기서 우리는 -8- 옥소 dGuo 검출 및 정량화를위한​​ 효과적인 방법을 확립하기위한 새로운 사용자를 허용 할 것이다 HPLC 기반 프로토콜의 상세한 ...

공개

No conflict of interest or competing financial interests declared.

감사의 말

이 연구는 캐나다 보건부 유전체학 연구 개발 이니셔티브 (GRDI)과 생명 공학에 대한 캐나다의 규제 전략 (CRSB)에 의해 투자되었다. 저자는 이해 관계의 충돌이 없습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
8-oxo-dGuo standardCayman Chemical Company89320Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphataseSigma-AldrichP5931From E. coli
Chelex 100Sigma-AldrichC7901Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylateSigma-AldrichD9533
dGuo standardSigma-AldrichD7145
Dibasic sodium phosphateSigma-AldrichS9390
DNA from salmon spermSigma-AldrichD1626Sodium salt
DNase ISigma-AldrichD4527TypeII, from bovine pancreas
DNAzolInvitrogen10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE4884The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K mediaATCC30-2004
Foetal bovine serumATCC30-2020
Guard columnChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 0204GCProtects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Monobasic sodium phosphateSigma-AldrichS9638
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140-122
Phosphate buffered salineInvitrogen15190-250
Phosphodiesterase I enzyme Sigma-AldrichP3243Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizerThomas Scientific7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectivelyVolume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
TrypsinInvitrogen15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silicaChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 1546WT

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