JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא הגילוי של סמן חמצון ה- DNA, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo) על ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים.

Abstract

סטרס חמצונים קשור הרבה תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כמו גם חילוף חומרים xenobiotic, מוביל לחמצון של Biomacromolecules, כולל DNA. לכן, זיהוי יעיל של חמצון ה- DNA הוא חשוב עבור מגוון רחב של תחומי מחקר, כוללים רפואה וטוקסיקולוגיה. סמן ביולוגי משותף של דנ"א פגום oxidatively הוא 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo; לעתים קרובות מכונה בטעות כ8-הידרוקסי-2'deoxyguanosine (8-OH-dGuo או 8 -oxo-DG)). כמה פרוטוקולים ל8-אוקסו-dGuo מדידה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ED) תוארו. עם זאת, אלה יושמו בעיקר ל- DNA מטוהר שטופל בפרו-חמצון. בנוסף, עקב הבדלים מתודולוגיים בין מעבדות, בעיקר בשל הבדלים בציוד אנליטי, האימוץ של שיטות שפורסמו לצורך זיהוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED דורש אופטימיזציה זהירה בכל מעבדה.פרוטוקול מקיף, המתאר תהליך האופטימיזציה כזה, חסר. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לגילוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים. זה מדגים כיצד הכנת דגימת DNA יכולה להיות מותאמת בקלות ובמהירות כדי למזער חמצון ה- DNA לא רצוי שיכול להתרחש במהלך הכנת מדגם. פרוטוקול זה מראה כיצד לזהות 8-אוקסו-dGuo בתאים בתרבית אדם אדנוקרצינומה מכתשי (כלומר, תאי A549) שטופלו בסוכן חמצון KBrO 3, ומהטחול של עכברים שנחשפו לdibenzo פחמימנים ארומטיים polycyclic (def, עמ ') chrysene (DBC, שנקרא בעבר פיר dibenzo (, יב), DalP). בסך הכל, עבודה זו מדגימה כיצד מתודולוגיה HPLC-ED יכולה להיות מותאמת בקלות לזיהוי של 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות.

Introduction

מינים תגובתי חמצן (ROS), מצב יציב שיכולים להגדיל את הרמות בהרבה מצבים פתולוגיים וחילוף חומרי xenotoxic, תורמים לשכיחות מוגברת של נזק לדנ"א חמצוני. בין כמה מוצרי חמצון nucleobases האפשרי, נזק לדנ"א חמצוני יכול בקלות למדוד באמצעות הסמן היציב 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo), שהוא אחת מצורות חמצון של 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-אוקסו-dGuo הוא נגע DNA הנפוץ ביותר 2, ולכן, כבר למד לפירוט רב יותר כסמן ביולוגי חמצון ה- DNA למרות קיומם של מוצרי חמצון ה- DNA המרובים 3. בבני אדם, נזק זה ניתן לתיקון באמצעות תיקון כריתת בסיס על ידי glycosylase 8-oxoguanine 1 (hOGG1) 4. אם עזב מתוקן, 8-אוקסו-dGuo יכול לתרום להיווצרותן של מוטציות זוג-החלפת בסיס (כלומר, G לT transversions) 4. חשוב לציין, 8-אוקסו-dGuo הוא סמן הוקם FOנזק לדנ"א r ביחס לייזום והקידום של היווצרות הסרטן 2. לכן, כימות מדויק של 8-אוקסו-dGuo הוא סמן ביולוגי שימושי ורצוי של נזק לדנ"א חמצוני 5.

יש בלבול נפוץ בספרות בנוגע לשמות הנכונים לצורות oxidatively פגועות של 2-deoxyguanosine ו, יתר על כן, את השם הנכון של המתחם (ים) שנמדדו באופן שגרתי כסמן ביולוגי של נזק לדנ"א חמצוני 6. צורות tautomeric 8-קטו 6,8-diketo ו6-enol, של 8-אוקסו-dGuo (מוצג באיור 1) הן שני tautomers הבולט ביותר שנדון בספרות 5,7. טופס 6,8-diketo הוא הצורה הבולטת ביותר ב- pH הפיזיולוגי של 7.4, והוא מוצר חמצון ה- DNA הבולט 7. לכן, 8-אוקסו-dGuo, במקום 8-הידרוקסי-dGuo הוא השם המתאים ביותר למוצר חמצון זה 6. כמו כן, חשוב לשים לב ש2-deoxyguanosine (dGuo), ולא nucleobגואנין ASE (גואה) או guanosine ribonucleoside (גואו), בהתאמה, הוא זוהה על ידי רוב השיטות 6.

איתור וכימות של 8-אוקסו-dGuo מדויקים הוא מאתגר עקב: השתנות i) בעיכול של דגימת DNA, ii) חמצון adventitious של dGuo 8-אוקסו-dGuo שיכול להתרחש במהלך הכנת מדגם, וiii) את הצורך לאימות יעילה של שיטת HPLC-ED אנליטיים 8. בפרוטוקול זה, אנו חותרים להשגת i) על ידי מתן תנאים, נוחים לעיכול DNA מלא וii) על ידי chelator הכללת המתכת ופתרונות שטופל chelator ומגיב בידוד-דנ"א מיוחד, תוך iii) היה ממוען רק באופן חלקי על ידי הכללת בקרות חיוביות וכך לספק כי השיטה היא מסוגלת לאתר 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות. אימות נוספת היא מעבר להיקף של מאמר זה. עם זאת, אנו בטוחים כי פרוטוקול זה יעזור לי פוטנציאלימשתמשים לקבוע את המידה שבה הם צריכים לאמת באופן רשמי בפרוטוקול, בהתאם לצרכיהם. רשימה של צעדים הנדרשים לאימות הפורמאלית של השיטה מסופקת נוספת. במהלך הפיתוח והפריסה של שיטה לזיהוי 8-אוקסו-dGuo, שיטות שפורסמו נסקרו ומאוחדת. לכן, שיטה זו מבטלת את הצורך לאסוף מידע ממספר מקורות שפורסמו, כי לעתים קרובות חסרי פרטים ניסיוניים חשובים גם בעת מתן אמצעי מהיר ופשוט של בדיקות אם השיטה לאיתור והכימות של 8-אוקסו-dGuo כבר אימצה בהצלחה. שיטה מותאמת זה הועסקה לנתח בהצלחה דגימות DNA מהתאים בתרבית רקמה ועכברית. מאמר זה וידאו יסייע קבוצות אחרות בהקמת שיטה יעילה לגילוי אמין וכימות של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED.

Protocol

ודא שכל בעלי חיים, דיור, טיפול וניסויים לדבוק בכללים ותקנות מקומיים וכי פרוטוקולי ניסויים אושרו לפני תחילת כל מחקר. לניסויים שתוארו, טיפול בבעלי חיים, טיפול, וטיפול אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים הבריאות בקנדה. ראה "שולחן ריאגנטים" למידע של הספקים.

1. איסוף דגימות ביולוגיות

  1. תאים או רקמות בעלי החיים
    1. לגדל תאי A549 אדנוקרצינומה מכתשיים אדם בתקשורת F12-K המכילה 10% בסרום שור עוברי, 100 / מיליליטר יחידות של פניצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר של סטרפטומיצין.
    2. תאי זרע בכ 1 מיליון תאים לכל צלחת 10 סנטימטרים. עבור כל ניסוי, שימוש בערכה של 12 צלחות בסך הכל (שלוש צלחות ללשכפל ביולוגי אחד x ארבע מנות) כדי לספק מספיק DNA (80 מיקרוגרם) לעיכול אנזימטי וניתוח HPLC.
    3. כאשר צפיפות תאים הופכת גדולה יותר מכimately 70% משטח הצלחת, להסיר תקשורת לשטוף תאים פעמיים עם 4 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS), pH 7.4.
    4. לתאים של בעלי חיים מתורבתים, להשתמש KBrO 3 כביקורת חיובית.
      הערה: קשר לינארי חיובי בין ריכוז KBrO 3 ותדירות 8-אוקסו-dGuo כבר דווחה בספרות 9.
    5. לפזר KBrO 3 בPBS. ודא שהריכוז הסופי בתרבית תאים הבינוני הוא גדול מ -1 מ"מ להשיג עלייה מובהקת סטטיסטי ב8-אוקסו-dGuo ביחס לתאים שנחשפו לאו"ם. להוסיף אותו הריכוז של KBrO 3 לכל צלחת בסדרה (למשל, צלחות 12 10 סנטימטרים).
    6. דגירה הצלחות במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס. הסר את המדיה ולשטוף פעם אחת עם PBS.
    7. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת טריפסין (ריכוז המניה 2.5 גר '/ מיליליטר) ודגירה של 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    8. לשטוף עם 4 מיליליטר PBS, לאסוף את התאים מכל להגדיר לpolystyr 50 מיליליטר חרוטי אחתצינור ENE צנטריפוגות, וצנטריפוגה XG ב 1000 עבור 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    9. הסר PBS ולאחסן את התא גלולה ב -80 ° C עד לניתוח נוסף. חמצון ה- DNA מלאכותי ניתן למזער עוד יותר על ידי בידוד גרעיני, כפי שתואר במקום אחר 10.
  2. רקמות בעלי החיים
    1. מינון בעלי חיים כנדרש. לפרוטוקול זה, למבוגרים (9 שבועות של גיל) טיפול בגברים מוטה עכבר על ידי gavage פה יומי במשך שלושה ימים רצופים עם 20 מ"ג לקילו ליום BW DBC / מומס בשמן זית.
      נמלי בעלי חיים מהונדסים זה מהונדס λ-bacteriophage וlacZ גן כתב המוטציה מא: הערה 11 coli משמש עבור מבחני מוטציה מכרסמים מהונדס 12.
    2. לבצע נתיחה לאחר מוות של בעלי חיים לדוגמא, בהרדמה העכברים יכולים באמצעות isoflurane ולאחר מכן מורדמים באמצעות נקע בצוואר הרחם ואחרי פתיחת בית חזה. מייד יהבהבו רקמות הקפאה בחנקן נוזלי. רקמות חנות ב -80 ° C עד ניתוח.
      הערה: התזמון של המתת חסד לאחר הטיפול יכול להיות אחר משתנה חשוב (למשל, חמצון ה- DNA היה מקסימאלי ב 72 שעות לאחר חשיפה לרעש במוח החולדה וכבד 13).

2. הפקת DNA, רטיבות ולשטוף (לרקמות להמשיך ישירות 2.2)

  1. Homogenize התאים שנאספו בצינור צנטריפוגות קלקר חרוטי 50 מיליליטר עם 1 מיליליטר סוכן ה- DNA של בידוד כגון DNAzol. השתמש קצה פיפטה μl 1,000 לפזר את התא גלולה עד הפתרון הוא הומוגנית. העבר את homogenate לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש. לדגור על קרח במשך 10-20 דקות. המשך 2.3.
  2. Homogenize 15-20 מ"ג של רקמה בhomogenizer זכוכית nonstick כף יד 1 מיליליטר מכיל 500 סוכן בידוד DNA μl. בעדינות להעלות וhomogenizer נמוך יותר עבור דקות על 1; רקמות רכות תדרוש פחות זמן. טיפול עדין מבטיח פחות גז של ה- DNA. אחסן את homogenate על קרח על 10-20 דקות.
  3. גלולהhomogenate על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 XG ו4 ° C בצינור microcentrifuge חרוטי 1.5 מיליליטר.
  4. להעביר בזהירות את supernatant שנוצר לתוך צינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר תשומת לב זהיר, כדי למנוע יצירת קשר עם גלולה.
  5. לזרז DNA מhomogenate על ידי הוספת 0.5 מיליליטר EtOH 100% לכל 1 מיליליטר של homogenate. היפוך צינורות 10 פעמים כדי להבטיח מגיב בידוד וEtOH הם מספיק מעורבים.
  6. בשלב זה, משקע ה- DNA הוא צמיג, סליל אותו על קצה פיפטה פלסטיק (למשל, עם קיבולת החזקה המרבית של 200 μl) ולאחר מכן הועבר לצינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר חרוטי.
    הערה: צנטריפוגה מהירה יכולה להיות מועסק על מנת להסיר כל lysate שנותר מה- DNA המבודד.
    (DNA לשטוף וsolubilization)
  7. הוסף 1 מיליליטר של 75% EtOH ל- DNA המבודד. להשעות את גלולה DNA ביסודיות על ידי היפוך הצינורות 10 פעמים.
  8. למזוג בזהירות את אתנול מהצינור. ודא כי הדואר DNA גלולה מקלות לצד של הצינור. אחסן את הצינורות אנכי במשך 1-2 דקות ולהשתמש בפיפטה כדי להסיר כל EtOH עודף מהחלק התחתון של הצינור.
  9. חזור על DNA לשטוף פעם נוספת, וגם לאחסן את המדגם בEtOH ב -20 ° C (יציב במשך כמה חודשים) או מייד להמשיך עיכול.
  10. לפזר DNA במאגר עיכול (שיפורט להלן) ולאחר מכן לכמת בשיטות ספקטרוסקופיות סטנדרטיים (כלומר, הספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop).

3. אנזימתי עיכול

  1. הכן "חיץ עיכול" על ידי שילוב של כרכים מתאימים (תלוי במספר הדגימות להתעכל) של 50 מ"מ פוספט Na monobasic (המכילים 2.0 מ"מ KCl, desferal מ"מ 1.0 (DFO) ו -200 מ"מ MgCl 2) פוספט Na dibasic עם 50 מ"מ (גם מכיל 2.0 מ"מ KCl, 1.0 מ"מ DFO ו -200 מ"מ MgCl 2). כל דגימה דורשת 4.0 μl monobasic ו17.0 μl פתרון פוספט dibasic.
  2. הסר את כל EtOH שנותר מהחלק התחתון של הצינור ודגימות אוויר יבש במשך כ 5 דקות. ודא שה- DNA לא להתייבש לחלוטין.
  3. לפזר DNA שחולץ 80 מיקרוגרם ב21.0 μl של חיץ העיכול, להוסיף 1 יחידה של DNase אני מומס ב2.0 μl של חיץ עיכול.
  4. מערבולת קלה להשיג ערבוב יסודי ודגירה של 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  5. בתום תקופת הדגירה, להוסיף 216.4 μl של 50 dibasic פתרון פוספט מ"מ Na המכיל 2.0 מ"מ KCl, 1.0 מ"מ DFO ו -200 מ"מ MgCl 2.
  6. הכן "עיכול חיץ-2" על ידי שילוב של כרך אחד של חיץ עיכול עם תשעה כרכים של dibasic, 50 מ"מ פוספט Na (עם 2.0 מ"מ KCl, 1.0 מ"מ DFO ו -200 מ"מ MgCl 2).
  7. להוסיף 0.025 יחידות של phosphodiesterase (PDE) אני אנזים ב16.3 μl של חיץ-2 עיכול. פיפטה למעלה ולמטה במשך כמה שניות, ואז מערבולת קלה להשיג ערבוב יסודי ודגירה של 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
  8. הוסף 0.4 יחידות של phosphatase אלקליין (AP) ב8.0 μl של חיץ-2 עיכול. פיפטה למעלה ולמטה במשך כמה שניות, ואז מערבולת קלה להשיג ערבוב יסודי ודגירה של 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 33.0 כיתה HPLC μl MeOH.
  9. הפעל דגימות DNA מתעכלים על HPLC, כפי שיתואר להלן, מייד או לאחסן ב -80 ° C עד שימוש כדי למזער חמצון. הערה: שלבי העיכול 1.5 שעות הציעו כאן מבוססים על מרווחים כאלה הציעו במקום אחר 9 ועל הממצאים שפרוטוקולים דומים להשיג עיכול DNA שלם 9. לכן, הנחה היה שהגורם המגביל היחיד להשיג עיכול מלא הזמן ושinhomogeneity עיכוב אנזים והמדגם היו זניח.

4. HPLC הפעלה: הכנת הניידת שלב, התקנת מכשור ותחזוקה

  1. השתמש במי ultrapure להכין את כל פתרונות החיץ וטופל בשרף כוח אג"ח גבוה (למשל, Chelex 100: divinylbe סטירןקופולימר nzene עם iminodiacetate יונים שמתכות מעבר Chelate עם זיקה גבוהה) כדי למזער את זיהום מתכת וחמצון ה- DNA במהלך הכנת מדגם.
  2. הכן 250 חיץ פוספט מ"מ Na, pH 6.2. השתמש יחס של 1: 3.6957 של פוספט נתרן dibasic (FW = 177.99 g / mol) לmonobasic פוספט נתרן (FW = 119.98 g / mol).
    לדוגמא: לכן, לפתרון מניות 3 L לשלב 70.81 גרם של monobasic ו28.43 גרם של אבקת dibasic, מוסיף מים עד לדוגמא, 2.8 ליטר ולוודא שה- pH של התמיסה הוא 6.2. התאם את ה- pH עם 250 פתרונות מונו או פוספט נתרן dibasic מ"מ, שהוכנו בנפרד ולא על ידי חומצות או בסיסים מרוכזים. להוסיף 2.24 גרם של KCl להשיג ריכוז של 10 מ"מ KCl.
  3. הכן שלב נייד בשלושה בקבוקים, L לפחות 1 כל אחת, המכיל: B ממס - מתנול HPLC הכיתה, ממס - מים ultrapure B, ו- C ממס - חיץ פוספט מהשלב 4.2. הכנס צינורות אספקת שלב נייד HPLC לבקבוקים; remainiצינורות ng יש גם טבלו באחד מהבקבוקים (למשל, C פתרון) ודרוכים, גם אם הם אינם נדרשים לערבוב.
  4. בזמן הריצה, לערבב את פתרונות ששלב הניידים כממס 6%, 74% B ממס וממס של 20% C כדי להשיג פתרון סופי של 50 מ"מ חיץ פוספט נתרן (pH 6.2) עם 2.0 מ"מ KCl, ו -6% MeOH.
  5. לנתק את האלקטרודה מגלאי אלקטרוכימי, לפרק אותו והתייחסות נקייה ואלקטרודות עבודה עם פתרונות ניקוי אלקטרודה ודיסקי ליטוש מומלצים על ידי היצרן. יש לשטוף את המשטחים לנקות עם מים ultrapure, לנגב את המים בעדינות ולהבטיח את הגלאי הוא יבש לפני הפעלת המערכת על.
  6. להרכיב מחדש את הגלאים ולחבר את כניסת השלב הניידת לאלקטרודה. הפעל את הזרימה ולאפשר את השלב הנייד כדי למלא את האלקטרודה לפני הצמדת צינור השלב הנייד לשקע. התקן טור חדש לפני תחילת אופטימיזציה. ודא שהתקנה היא בכיוון הנכון וFollows המלצות כל היצרן.
  7. הפעל את מכשור HLPC גם קדימה (למשל, 1 שעה) של מדגם ניתוח כדי לאפשר איזון וכדי להפחית את הרעש בנקודת ההתחלה. ראה טבלה 1 להגדרות הציעו; מגבלת הלחץ האחורית צריכה להיות מוגדרת 3,000 psi, כדי למנוע נזק עמודה. הפעל את מסלק הגזים. להמשיך ביחולו המשאבות והקמת שיפוע ממס.
  8. ראש יבש המשאבות לפי הוראות יצרן. האם זה להרטיב את הקווים כאשר שלב נייד הוחלף או כניסת צינורות חשופה לאוויר.
  9. אתר את דיסק האתחול ולהכניס מזרק פלסטיק 10-15 מיליליטר שם. ודא את המזרק מוכנס באופן מלא לפני שפתח את הקו. כדי לפתוח את השורות פשוט להפוך נגד כיוון השעון דיסק לתורם אחד.
  10. התחל עם ראש בחירת ממשק HPLC המתאים. משוך בעדינות את המזרק לצייר נוזל לתוך השורות. ברגע שהנוזל זורם, ראש הושלם; לאפשר לתכנית ללסיים את הריצה. חזור לכל הקווים (בדרך כלל ארבעה, תלוי במכשיר).
  11. לחלופין, ראש רטוב כאשר הקווים כבר רטוב מראש יבש קודם לכן (ראה להלן).
    הערה: כאשר כמות גדולה של זמן שחלף בין שימושים (לדוגמא, 2 שבועות או יותר), ראש יבש מומלץ.
  12. לשנות את הרכב של רכיבי ממס השלב הנייד ל- 25% כל אחד באמצעות ממשק משתמש HPLC. מהממשק, בחר באפשרות "פונקציה ישירה", ולאחר מכן בחר באפשרות "רטוב ראש". זה יהיה ראש את כל הקווים באותו הזמן.
  13. ודא שכל האוויר יצא מהמערכת על ידי התבוננות בקו ראש הרטוב כפי שהוא מזין את מיכל הפסולת. אחרי ראש טוב, לוודא שאין בועות נשארות בקו. אם בועות להתמיד, לחזור תחול.
  14. ברגע שהמשאבה דרוכה, להתחיל לנוע השלב הנייד HPLC. השתמש בממשק HPLC לשנות באופן ידני את ההרכב של השלב הנייד למתנול (6% ממס) ו -94%מים (ב ממס), ובחר קצב זרימה של 0.9 מיליליטר / דקה. לאפשר 5 דקות כדי לנקות כל מתנול מהשלב ניקוי עמודה.
  15. לאחר 5 דקות, לשנות את הרכב למתנול (6% ממס), 74% מים (ב ממס), חיץ 20% (C ממס), להגדיל את קצב הזרימה ל1.0 מיליליטר / דקה. להגדיר את הפרמטרים אחרים כפי שסוכם בטבלה 1, ולהגדיר את מגבלת לחץ חזרה ל3,000 psi, כדי למנוע נזק עמודה.
    הערה: בעיות פוטנציאליות עם התקנת HPLC כוללות בסיס נסחף, שיא פיצול ועוצמת אות פחתה. אלה בדרך כלל ניתן להתגבר על ידי ניקוי העמודה לאחר כל שימוש, ניקוי אלקטרודה תכוף, ולהבטיח שפתרונות החיץ חופשיים של זיהום (למשל, חומר חלקיקים או התפתחותם של חיידקים).
  16. הפעל את השלב הנייד כ 1-1.5 שעות כדי להשיג אות בסיס יציבה.
  17. שימוש בממשק תוכנת מכשיר, בחרו פרמטרים כפי שצוין בטבלה 1 ולהגדיר את זמן ריצת 15 דקות. להזריק את סםple. השתמש פעמים ריצה מוגברות לדגימות מורכבות (לקבוע את זה באופן אמפירי על ידי התבוננות הנוכחות או עדר של פסגות מעבר מרווח 15 דקות-).
    הערה: תוכנת כלי מאפשרת תכנות של תנאי הפעלת מדגם והתקנה לautosampling.
  18. אחרי הריצות הושלמו, לכבות את תא הגלאי באמצעות הממשק של הגלאי. חשוב לעקוב אחר המלצות יצרן לגבי הפעלה מטה הגלאי כטיפול לא נכון וכיבוי עלול לגרום נזק למכשיר. אל תכבה את התא על ידי מעבר האחורי של הגלאי כמו זה יכול לגרום נזק למכשיר.
  19. באופן ידני לשנות את הרכב השלב הנייד למתנול 6% ו -94% מים. הפעל למשך 5 דקות.
  20. ידני להפחית את קצב הזרימה של 0.7 מיליליטר / דקה, מייד לשנות את הרכב לMeOH 50% ו -50% מים. לרוץ לפחות 20 דקות. אי להפעיל את הצעד הזה בפעם המומלצת עלולים לגרום לניזק לעמודה והגלאים. כבה את הזרימה,אז d לכבות את מסלק הגזים.

5. הכנת התקנים

  1. הכן חיץ שלב נייד כפי שמתואר בשלבים 4.1-4.3 לעיל. חשוב להשתמש בשלב HPLC הנייד להכנת תקנים כדי למנוע פסגות כתוצאה מערבוב של פתרונות שונים לאחר הזרקת מדגם.
  2. לדלל פתרון אחד זה בחמישה במי ultrapure לפני השימוש, והפתרון הסופי חייב לכלול 6% MeOH.
  3. dGuo תקן
    הערה: פוטנציאל חמצון גבוה הנדרש לאיתור dGuo עלול להגביר את הסיכון למדידה מפריעה תרכובות electroactive. זה יכול להיות מאומת על ידי, למשל, עקומה סטנדרטית של גילוי UV של dGuo ב 260 ננומטר והשוואתה לעקומת הסטנדרט שנוצרה עם גילוי EC. אם שני ליישר היטב (למשל, איור משלים 1) ומדגם אפקטי המטריצה ​​נלקחו בחשבון, ניתן להמשיך באיתור dGuo ידי UV ב 260 ננומטר, ולא גילוי EC.
    1. למדוד 1.0 מ"ג של dGuo בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. להוסיף MeOH הכיתה 1.0 מיליליטר HPLC.
    2. מערבולת במהירות גבוהה עד dGuo מתמוססת לחלוטין. זהו המניות העיקריות; לאחסן ב -20 ° C למשך מספר שבועות.
    3. כדי ליצור את מניית dGuo המשנית (0.5 מ"מ), לדלל 143 μl של מניית dGuo העיקרית ב857 μl של שלב נייד HPLC. אחסן על קרח עד לשימוש ולהכין טרי בכל יום.
    4. הפוך את דילולים נוספים כדי ליצור עקומה סטנדרטית (לדוגמא, טבלה 2). פתרונות חנות על קרח ולהכין טרי בכל יום. סטנדרטים לרוץ בסדרה עם דגימות ניסוי.
    5. לפני לרוץ, להשתנות מתח הגלאי באמצעות הריכוז הגבוה ביותר של המניה למצוא מתח אופטימלי.
  4. 8-אוקסו-dGuo תקן
    1. למדוד 1.0 מ"ג של 8-אוקסו-dGuo בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. להוסיף MeOH הכיתה 0.1 מיליליטר HPLC. מערבולת במהירות גבוהה עד 8-אוקסו-dGuo מתמוססת לחלוטין. זהו המניות העיקריות של 8-אוקסו-dGuo. חנות ב -20 ° C לsevשבועות eral.
    2. בצינור נפרד, לשלב 2.9 μl של מניות עיקריות ו997.1 μl של חיץ שלב נייד HPLC, מערבולת. זהו המניות המשניות (10,000 ננומטר).
    3. כדי ליצור פתרון עבודה לעקומה סטנדרטית (250 ננומטר), לשלב 24.4 μl של מניות המשניות ו975.6 μl של חיץ שלב נייד.
    4. לבצע דילולים נוספים כדי לספק את הפתרונות הנדרשים כדי ליצור עקומה סטנדרטית (לדוגמא, טבלה 3). פתרונות חנות על קרח ולהכין טרי בכל יום. סטנדרטים לרוץ עם דגימות הניסוי.
  5. כימות
    1. לשלב את השטח מתחת לעקומה לשני 8-אוקסו-dGuo וdGuo באמצעות תוכנה סטנדרטית (כחלק מממשק HPLC-מחשב, ראה איור 2 א המשלים).
    2. לבנות עקומה סטנדרטית (ריכוז ידוע של כל אנליטי לעומת שטח מתחת לעקומה (2B איור המשלים). שימוש במשוואה של העקומה סטנדרטית, לחשב את היחס ל8-אוקסו-dGuo / dGuo עבור כל דגימה.

6. Agarose ג'ל אלקטרופורזה

הערה: ג'ל אלקטרופורזה agarose ניתן לבצע כדי לאמת את השלמות של מערכת עיכול DNA.

  1. הכן 50x טריס-אצטט-EDTA (טה) חיץ, על ידי המסת בסיס 242 גרם טריס (FW = 121.14) בשנת 750 מיליליטר המים ultrapure. להוסיף 57.1 מיליליטר חומצה אצטית קרחונית ושל 0.5 M EDTA 100 מיליליטר (pH 8.0; EDTA יתמוסס לחלוטין כאשר pH הפתרון מותאם ל8.0 עם למשל, NaOH) ולהוסיף מים ultrapure לנפח סופי של 1 ל 'חנות ב RT, לדלל 50x לפני שימוש זה פתרון.
  2. לשקול את 1 גרם של agarose ולפזר אותו ב100 מיליליטר חיץ 1x טה, חימום במיקרוגל במשך 1-2 דקות. לחבוש משקפי מגן וציוד מגן להימנע ממגע עם רותח agarose.
  3. להתקרר הפתרון עד כ 50 מעלות צלזיוס, להוסיף 5 μl ethidium ברומיד (זהירות: mutagen) ולשפוך אותו לתוך מכשיר ריצת agarose ג'ל. הכנס את המסרק.
  4. חכה עד שמתמצק הפתרון, לשפוך חיץ טה על ג'ל ולטעון את הדגימות (נפח תלוי בגודל מסרק, בדרך כלל, 10-20 μl של דגימת DNA טעון, מעורב עם צבע פועל 6x לדמיין ולהקל טעינה).
  5. הפעל את הג'ל עד הצבע נודד כ 2/3 האורך של ג'ל (למשל, 45 דקות ב 150 V). דמיינו להקות DNA תחת אור UV.

תוצאות

dGuo נצפה ליש זמן שמירה של 4.7 דקות ואילו 8-אוקסו-dGuo זמן שמירה של כ 6.4 דקות (איור 2 א 'וב'). יש הבדל כ -1,000 פי בגבה השיא בין שני analytes, כפי שניתן לראות באיור 2 ג. Voltammograms ל8-אוקסו-dGuo וdGuo התקבלו על ידי סטנדרטים פועלים בפוטנציאל עבודה בטווח של 0.2-1.1 V. פוטנציאל העב?...

Discussion

למרות 8-אוקסו-dGuo דווח כסמן ביולוגי שימושי של חמצון ה- DNA, הכימות אמין שלה יכול להוות אתגר. למרות כמה שיטות שפורסמו קיימות, יש צורך בסקירה מקיפה, תיאורים של פרוטוקול להתיר לחוקרים לפרוס את השיטה במעבדות שלהם. כאן אנו מציגים סקירה מפורטת של פרוטוקול מבוסס HPLC שיאפשר למשתמש...

Disclosures

No conflict of interest or competing financial interests declared.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי משרד הבריאות הקנדית ג'נומיקס המחקר ופיתוח היוזמה (GRDI) ותקינת האסטרטגיה הקנדית לביוטכנולוגיה (CRSB). יש הסופרים אין ניגוד האינטרסים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
8-oxo-dGuo standardCayman Chemical Company89320Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphataseSigma-AldrichP5931From E. coli
Chelex 100Sigma-AldrichC7901Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylateSigma-AldrichD9533
dGuo standardSigma-AldrichD7145
Dibasic sodium phosphateSigma-AldrichS9390
DNA from salmon spermSigma-AldrichD1626Sodium salt
DNase ISigma-AldrichD4527TypeII, from bovine pancreas
DNAzolInvitrogen10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE4884The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K mediaATCC30-2004
Foetal bovine serumATCC30-2020
Guard columnChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 0204GCProtects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Monobasic sodium phosphateSigma-AldrichS9638
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140-122
Phosphate buffered salineInvitrogen15190-250
Phosphodiesterase I enzyme Sigma-AldrichP3243Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizerThomas Scientific7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectivelyVolume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
TrypsinInvitrogen15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silicaChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 1546WT

References

  1. Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
  2. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
  3. Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
  4. Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
  5. Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
  6. Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
  7. Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
  8. Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
  9. Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
  10. Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
  11. Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
  12. Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
  13. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
  14. Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
  15. Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
  16. Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
  17. Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
  18. Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
  19. Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
  20. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
  21. Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
  22. Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
  23. Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
  24. Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
  25. . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1028 78 Dihydro 2 deoxyguanosine8 2 deoxyguanosineXenobiotic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved