HPLC Medición de la oxidación del ADN de biomarcadores, 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina, en células cultivadas y tejidos animales

Resumen

El objetivo de este protocolo es la detección del marcador de la oxidación del ADN, 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina (8-oxo-dGuo) por HPLC-ED, en el ADN de células cultivadas o tejidos animales.

Resumen

El estrés oxidativo está asociado con muchos procesos fisiológicos y patológicos, así como el metabolismo de xenobióticos, que conduce a la oxidación de biomacromoléculas, incluyendo ADN. Por lo tanto, la detección eficiente de la oxidación del ADN es importante para una variedad de disciplinas de investigación, incluyendo la medicina y toxicología. Un biomarcador común de ADN oxidativamente dañado es 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina (8-oxo-dGuo; a menudo denominado erróneamente como 8-hidroxi-2' desoxiguanosina (8-OH-dGuo o 8 oxo-DG)). Se han descrito varios protocolos para la medición de 8-oxo-dGuo por cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-ED). Sin embargo, éstos se aplicaron principalmente a ADN purificado tratado con pro-oxidantes. Además, debido a las diferencias metodológicas entre los laboratorios, debido principalmente a las diferencias en equipo analítico, la adopción de métodos publicados para la detección de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED requiere la optimización cuidadosa de cada laboratorio. LAprotocolo integral, que describe un procedimiento de este tipo de optimización, es insuficiente. Aquí, un protocolo detallado se describe para la detección de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED, en el ADN de células cultivadas o tejidos animales. Se ilustra cómo la preparación de muestras de ADN se puede optimizar fácilmente y rápidamente para minimizar la oxidación indeseable de ADN que puede ocurrir durante la preparación de la muestra. Este protocolo muestra cómo detectar 8-oxo-dGuo en células cultivadas humanos adenocarcinoma alveolar (es decir, células A549) tratados con el agente oxidante KBrO _3, y del bazo de ratones expuestos a la dibenzo hidrocarburo aromático policíclico (def, p) criseno (DBC, antes conocido como dibenzo (a, l) pireno, DALP). En general, este trabajo ilustra cómo una metodología HPLC-ED se puede optimizar fácilmente para la detección de 8-oxo-dGuo en muestras biológicas.

Introducción

Especies reactivas del oxígeno (ROS), cuyos niveles de estado estacionario puede aumentar durante muchas condiciones patológicas y el metabolismo xenotoxic, contribuyen a una mayor frecuencia de daño oxidativo del ADN. Entre varios productos de oxidación posibles nucleobases, daño oxidativo del ADN fácilmente se puede medir usando el marcador estable 8-oxo-7,8-dihidro-2 'desoxiguanosina (8-oxo-dGuo), que es una de las formas oxidadas de 2' -deoxyguanosine (dGuo) ^1. 8-oxo-dGuo es el más abundante lesión del ADN ² y, por lo tanto, ha sido estudiado para mayor detalle como un biomarcador oxidación del ADN a pesar de la existencia de productos de oxidación de ADN múltiple ^3. En los seres humanos, este daño puede ser reparado a través de la reparación por escisión de base por 8-oxoguanina glicosilasa 1 (hOGG1) ^4. Si se deja sin reparar, 8-oxo-dGuo puede contribuir a la formación de mutaciones de sustitución de pares de bases (es decir, G a T transversiones) ^4. Es importante destacar que, 8-oxo-dGuo es un marcador establecido fodaño en el ADN r en relación con la iniciación y promoción de la carcinogénesis ^2. Por lo tanto, la cuantificación precisa de 8-oxo-dGuo es un biomarcador útil y deseable de daño oxidativo del ADN ^5.

Hay una confusión generalizada en la literatura con respecto a los nombres correctos de las formas dañadas oxidativamente de 2-desoxiguanosina y, por otra parte, el nombre correcto del compuesto (s) mide rutinariamente como un biomarcador de daño oxidativo del ADN ^6. Los 6,8-diceto-enol y 6, 8-ceto formas tautoméricas de 8-oxo-dGuo (mostrado en la Figura 1) son los dos tautómeros más prominentes discutidos en la literatura ^5,7. La forma de 6,8-diceto es la forma más prominente a pH fisiológico de 7,4, y es el producto de oxidación de ADN más prominente ^7. Por lo tanto, 8-oxo-dGuo, en lugar de 8-hidroxi-dGuo es el nombre más apropiado para este producto de oxidación ^6. También es importante señalar que 2-desoxiguanosina (dGuo), en lugar de nucleobase guanina (Gua) o guanosina ribonucleósido (Guo), respectivamente, se detecta por la mayoría de los métodos de ^6.

Detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo exacta es difícil debido a: i) la variabilidad en la digestión de la muestra de ADN, ii) la oxidación adventicia de dGuo a 8-oxo-dGuo que puede ocurrir durante la preparación de la muestra, y iii) la necesidad para la validación efectiva del método HPLC-ED analítica ^8. En este protocolo, que tuvo como objetivo a lograr i) proporcionando condiciones favorables para la digestión completa del ADN y ii) por la inclusión quelante de metal y soluciones quelantes tratados y un reactivo DNA-aislamiento especial, mientras iii) fue sólo parcialmente abordados por la inclusión de controles positivos y, por tanto proporcionando que el método es capaz de detectar 8-oxo-dGuo en muestras biológicas. Además de validación está más allá del alcance de este documento. Sin embargo, estamos seguros de que este protocolo ayudará a la prospectivalos usuarios a determinar el grado en que ellos necesitan para validar formalmente el protocolo, dependiendo de sus fines. Una lista de los pasos requeridos para la validación formal del método está provisto además. Durante el desarrollo e implementación de un método para la detección de 8-oxo-dGuo, métodos publicados fueron revisados ​​y consolidados. Por lo tanto, este método elimina la necesidad de reunir información de varias fuentes publicadas que a menudo carecen de importantes detalles experimentales mientras que también proporciona medios rápidos y directos de las pruebas si el método para la detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo ha sido adoptado con éxito. Este método adaptado fue empleado con éxito para analizar muestras de ADN de las células cultivadas y el tejido murino. Este artículo de vídeo ayudará a otros grupos en el establecimiento de un método eficaz para la detección fiable y cuantificación de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED.

Protocolo

Asegúrese de que todo la ganadería, la vivienda, la manipulación y la experimentación se adhieran a las normas y regulaciones locales y que los protocolos de experimentación se aprobó antes de comenzar cualquier estudio. Para los experimentos descritos, cuidado de los animales, el manejo y el tratamiento fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal Health Canada. Consulte la "Tabla de Reactivos" para obtener información de los proveedores.

1. Recolección de muestras biológicas

1. Las células o tejidos de animales
   1. Crecer células A549 adenocarcinoma alveolares humanos en medios F12-K que contenía suero bovino fetal al 10%, 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina.
   2. Células de semillas en aproximadamente 1 millón de células por una placa de 10 cm. Para cada experimento, utilice un conjunto de 12 placas en total (tres placas por una réplica biológica x cuatro dosis) para proporcionar suficiente ADN (80 g) para la digestión enzimática y el análisis HPLC.
   3. Cuando la densidad celular se hace mayor que aproxmadamente 70% del área de superficie de la placa, eliminar los medios de comunicación y lavar las células dos veces con 4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4.
   4. Para las células animales cultivadas, utilice KBrO ₃ como un control positivo.
      NOTA: Una relación lineal positiva entre KBrO concentración ₃ y frecuencia 8-oxo-dGuo ha sido reportado en la literatura ^9.
   5. Disolver KBrO ₃ en PBS. Asegúrese de que la concentración final en el medio de cultivo celular es mayor que 1 mM para obtener un aumento estadísticamente significativo de 8-oxo-dGuo respecto a las células un-expuesta. Añadir la misma concentración de KBrO ₃ a cada placa en la serie (por ejemplo, placas de 12 10-cm).
   6. Incubar las placas durante 3 horas a 37 ° C. Quite el papel y lavar una vez con PBS.
   7. Añadir 1 ml de solución de tripsina (concentración de stock 2,5 g / ml) y se incuba durante 3 min a 37 ° C.
   8. Lavar con 4 ml de PBS, recoger las células de cada conjunto en una sola poliestir 50 ml cónicotubo de centrífuga eno, y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
   9. Retirar PBS y almacenar el sedimento celular a -80 ° C hasta su posterior análisis. La oxidación del ADN Artificial puede minimizarse aún más por el aislamiento nuclear, como se describe en otra parte ^10.
2. Los tejidos de animales
   1. Dosis animales según se requiera. Para este protocolo, adulto (9 semanas de edad) el tratamiento masculino Muta ratón por sonda oral al día durante tres días consecutivos con 20 mg DBC / kg de peso corporal por día disuelto en aceite de oliva.
      NOTA: Este animal transgénico puertos ingeniería λ-bacteriófago y la mutación gen reportero lacZ de E. coli ¹¹ se utiliza para ensayos de mutación de roedores transgénicos ^12.
   2. Realice la necropsia de los animales, por ejemplo, los ratones anestesiados utilizando isoflurano puede y luego sacrificados mediante dislocación cervical seguida de abertura de la cavidad torácica. Inmediatamente parpadear tejidos por congelación en nitrógeno líquido. Tejidos Almacenar a -80 ° C hasta su análisis.
      NOTA: El momento de la eutanasia después del tratamiento puede ser otra variable importante (por ejemplo, la oxidación del ADN fue máxima a 72 hr después de la exposición al ruido en el cerebro de la rata y el hígado ^13).

2. Extracción de ADN, precipitación y lavado (para los tejidos proceder directamente a 2,2)

1. Homogeneizar las células recogidas en un tubo de centrífuga de poliestireno cónico de 50 ml con 1 ml de ADN aislando agente como DNAzol. Utilice una punta de pipeta l 1000 para dispersar el sedimento celular hasta que la solución sea homogénea. Transferencia homogeneizado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar en hielo durante 10-20 min. Proceda a 2,3.
2. Homogeneizar 15-20 mg de tejido en un homogeneizador de vidrio antiadherente de mano 1 ml contiene 500 agente de aislamiento de ADN l. Elevar suavemente e inferior homogenizador durante 1 min; tejidos más blandos requerirán menos tiempo. Tratamiento suave asegura menos esquila de ADN. Guarde el homogeneizado en hielo durante aproximadamente 10-20 min.
3. Bolitael homogeneizado por centrifugación durante 10 min a 10.000 xg y 4 ° C en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml cónica.
4. Transferir con cuidado el sobrenadante resultante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml prestando especial atención a evitar el contacto con la pastilla.
5. Precipitar el ADN del homogeneizado mediante la adición de 0,5 ml EtOH al 100% por 1 ml de homogeneizado. Invertir tubos de 10 veces para asegurar reactivo aislar y EtOH son suficientemente mezclado.
6. En este punto, precipitado de ADN es viscoso, carrete que en una punta de pipeta de plástico (por ejemplo, con una capacidad máxima de retención de 200 l) y después se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml cónico.
   NOTA: centrifugación rápida se puede emplear para eliminar cualquier lisado restante a partir del ADN aislado.
   (DNA Wash y solubilización)
7. Añadir 1 ml de EtOH al 75% para el ADN aislado. Suspender el sedimento de ADN completamente invirtiendo los tubos 10 veces.
8. Decantar cuidadosamente el etanol a partir de tubo. Asegúrese de que XXe pellet de ADN se pega a la pared del tubo. Guarde los tubos verticalmente durante 1-2 min y utilizar una pipeta para eliminar cualquier exceso de EtOH desde la parte inferior del tubo.
9. Repita el ADN lavar una vez más, y, o bien almacenar la muestra en EtOH a -20 ° C (estable durante varios meses), o proceder de inmediato a la digestión.
10. Disolver el ADN en tampón de digestión (descrito a continuación) y luego cuantificar utilizando métodos espectroscópicos estándar (es decir, la absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro NanoDrop).

3. La digestión enzimática

1. Prepare "tampón de digestión" mediante la combinación de volúmenes apropiados (en función del número de muestras para ser digerida) de 50 mM de fosfato monobásico Na (que contiene 2,0 mM KCl, 1,0 mM desferal (DFO) y 200 mM de MgCl ₂₎ con 50 mM fosfato dibásico de Na (que también contiene 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO y 200 mM de MgCl _2). Cada muestra requiere 4,0 l monobásico y 17,0 l de solución de fosfato dibásico.
2. Eliminar cualquier resto de EtOH desde el fondo de las muestras de tubos y de secado al aire durante unos 5 minutos. Asegúrese de que el ADN no se seque por completo.
3. Disolver 80 g de ADN extraído en 21,0 l de tampón de digestión de la, añadir 1 unidad de DNasa I disuelto en 2,0 l de tampón de digestión.
4. Vortex suavemente para lograr una mezcla completa y se incuba durante 1,5 horas a 37 ° C.
5. Al final del periodo de incubación, añadir 216,4 l de solución de fosfato dibásico 50 mM Na que contiene 2,0 mM de KCl, 1,0 mM DFO y 200 mM de MgCl _2.
6. Preparar "digestión buffer-2" mediante la combinación de un volumen de tampón de digestión con nueve volúmenes de dibásico, 50 mM fosfato de Na (con 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO y 200 mM de MgCl _2).
7. Añadir 0,025 unidades de la fosfodiesterasa (PDE) Me enzima en 16,3 l de tampón-2 digestión. Pipetear hacia arriba y abajo durante varios segundos, luego vórtice ligeramente para lograr una mezcla completa y se incuba durante 1,5 horas a 37 ° C.
8. Añadir 00,4 unidades de fosfatasa alcalina (AP) en 8,0 l de tampón-2 digestión. Pipetear hacia arriba y abajo durante varios segundos, luego vórtice ligeramente para lograr una mezcla completa y se incuba durante 1,5 horas a 37 ° C. Añadir 33,0 l HPLC grado MeOH.
9. Ejecutar las muestras de ADN digeridos en HPLC, como se describe a continuación, de inmediato o almacenar a -80 ° C hasta su uso para minimizar la oxidación. NOTA: Los pasos de digestión de 1,5 hr sugeridas aquí se basan en los intervalos sugirió otros lugares ⁹ y en las conclusiones que los protocolos similares a lograr la digestión completa del ADN ^9. Por lo tanto, se asumió que el único factor limitante para lograr la digestión completa era el tiempo y que la inhibición de la enzima y la falta de homogeneidad de la muestra eran insignificantes.

4. HPLC Run: Preparación de la fase móvil, instalación de Instrumentación y Mantenimiento

1. Use agua ultrapura para preparar todas las soluciones tampón y tratado con resina de alta fuerza de adherencia (por ejemplo, Chelex 100: estireno divinylbecopolímero nzene con iminodiacetato iones de metales de transición que quelato con alta afinidad) para minimizar la contaminación por metales y la oxidación del ADN durante la preparación de la muestra.
2. Preparar tampón de fosfato 250 mM Na, pH 6,2. Utilice una relación de 1: 3,6957 de fosfato de sodio dibásico (FW = 177,99 g / mol) a fosfato de sodio monobásico (FW = 119,98 g / mol).
   Ejemplo: Por lo tanto, para una solución madre de 3 L combinar 70,81 g de monobásico y 28,43 g de polvo dibásico, añadir agua hasta por ejemplo, 2,8 L y verificar que el pH de la solución es 6,2. Ajustar el pH con 250 mono o fosfato de sodio dibásico soluciones mM, preparadas por separado y no por ácidos o bases concentradas. Añadir 2,24 g de KCl para obtener una concentración de 10 mM KCl.
3. Preparar la fase móvil en tres botellas, por lo menos 1 litro cada una, conteniendo: disolvente B - metanol grado HPLC, disolvente - agua ultrapura B, C y solvente - tampón fosfato desde el paso 4.2. Inserte HPLC tubería de suministro de fase móvil en las botellas; remainitubos ng deben ser también sumergen en una de las botellas (por ejemplo, solución C) y cebados, incluso si no se requieren para la mezcla.
4. Durante la carrera, mezclar las soluciones de la fase móvil como 6% de disolvente A, disolvente B 74% y 20% C disolvente para lograr solución final de 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 6,2) con KCl 2,0 mM, y 6% de MeOH.
5. Separe el electrodo del detector electroquímico, desmontarlo y limpio electrodos de referencia y de trabajo con las soluciones de limpieza del electrodo y discos para pulir recomendados por el fabricante. Enjuague las superficies limpiadas con agua ultrapura, limpie el grifo con cuidado y asegúrese de que el detector esté seca antes de encender el sistema.
6. Volver a montar el detector y conectar la entrada de fase móvil para el electrodo. A su vez en el flujo y permitir que la fase móvil para llenar el electrodo antes de conectar el tubo de salida de fase móvil. Instalar una nueva columna antes de iniciar la optimización. Asegúrese de que la instalación está en la dirección correcta y follows todas las recomendaciones del fabricante.
7. Encienda la instrumentación de HPLC muy por delante (por ejemplo, 1 hr) de la muestra de análisis para permitir el equilibrio y para reducir el ruido de línea de base. Ver Tabla 1 para los ajustes sugeridos; el límite de presión de vuelta debe establecerse en 3000 psi para evitar daños columna. Encienda el desgasificador. Proceda con el cebado de las bombas y la creación de gradiente de disolvente.
8. Primer seco las bombas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Hacer esto para mojar las líneas cuando una fase móvil ha sido reemplazado o la entrada de tubo se expone al aire.
9. Busque el disco de cebado e insertar una jeringa de plástico de 10-15 ml allí. Asegúrese de que la jeringa se inserta completamente antes de abrir la línea. Para abrir las líneas simplemente gire el disco hacia la izquierda durante un turno.
10. Inicie la primera con la selección de la interfaz de HPLC adecuado. Tire suavemente la jeringa para extraer fluido en las líneas. Una vez que el fluido está fluyendo, el primer es completa; permitir que el programaterminar la carrera. Repita para todas las líneas (normalmente cuatro, dependiendo del instrumento).
11. Alternativamente, el primer mojado cuando las líneas ya se humedecen de un primer seca antes (ver más abajo).
    NOTA: Cuando haya transcurrido una gran cantidad de tiempo entre usos (por ejemplo, 2 semanas o más), se recomienda un primer seco.
12. Cambie la composición de los componentes disolventes de fase móvil a 25% cada uno usando la interfaz de usuario HPLC. Desde la interfaz, seleccione la opción "Función directa", luego la opción "Wet Prime" seleccionar. Esto se cebará todas las líneas al mismo tiempo.
13. Asegúrese de que todo el aire está fuera del sistema mediante la observación de la línea principal húmeda ya que entra en el recipiente de residuos. Después de un buen primer, asegúrese de que no hay burbujas se dejan en la línea. Si persisten las burbujas, repetir el cebado.
14. Una vez que la bomba está cebada, empezar a mover la fase móvil HPLC. Utilice la interfaz de HPLC para cambiar manualmente la composición de la fase móvil a 6% de metanol (disolvente A) y 94%agua (disolvente B), y seleccione un caudal de 0,9 ml / min. Permitir 5 minutos para despejar cualquier metanol a partir de la etapa de limpieza de la columna.
15. Después de 5 min, cambiar la composición a 6% de metanol (disolvente A), 74% de agua (disolvente B), tampón de 20% (disolvente C), aumentar la velocidad de flujo a 1,0 ml / min. Establezca otros parámetros como se resume en la Tabla 1, y establecer el límite de presión de nuevo a 3000 psi para evitar daños en la columna.
    NOTA: Los problemas potenciales con la configuración HPLC incluyen la línea de base a la deriva, el pico de división y la intensidad de la señal disminuye. Estos por lo general se pueden superar mediante la limpieza de la columna después de cada uso, la limpieza frecuente del electrodo, y asegurar que las soluciones tampón están libres de contaminación (por ejemplo, partículas o crecimiento microbiano).
16. Ejecute la fase móvil durante aproximadamente 1 a 1,5 horas para lograr una señal de línea de base estable.
17. Mediante la interfaz de software del instrumento, seleccione los parámetros que se indican en la Tabla 1 y se ajusta el tiempo de ejecución de 15 min. Inyectar el sample. Utilice aumento de los tiempos de ejecución para muestras complejas (determinar esto empíricamente mediante la observación de la presencia o ausencia de picos allá intervalo de 15 min).
    NOTA: El software del instrumento permite la programación de las condiciones de ejecución de la muestra y la configuración de automuestreo.
18. Después de las carreras se han completado, apague la célula detector mediante la interfaz del detector. Es importante seguir las recomendaciones del fabricante con respecto a apagar el detector como un manejo inadecuado y apagado pueden dañar el instrumento. NO apagar el celular al cambiar la parte posterior del detector, ya que podría dañar el instrumento.
19. Cambiar manualmente la composición de la fase móvil a 6% de metanol y 94% de agua. Corre por 5 min.
20. Reducir manualmente la velocidad de flujo de 0,7 ml / min, inmediatamente cambiar la composición a 50% de MeOH y 50% de agua. Corre por al menos 20 minutos. Si no se ejecuta este paso durante el tiempo recomendado puede causar daños a la columna y el detector. Apague la corriente, unad luego apague el desgasificador.

5. Elaboración de Normas

1. Preparar tampón de fase móvil como se indica en los pasos 4.1 a 4.3 anteriores. Es importante utilizar la fase móvil de HPLC para la preparación de normas para evitar picos resultantes de la mezcla de soluciones diferentes después de la inyección de la muestra.
2. Diluir esta solución uno de cada cinco con agua ultrapura antes de su uso, y la solución final debe contener 6% de MeOH.
3. dGuo Estándar
   NOTA: Alto potencial de oxidación requerido para la detección dGuo puede aumentar el riesgo de medir interferir compuestos electroactivos. Esto puede ser verificada mediante, por ejemplo, una curva estándar de detección UV de dGuo a 260 nm y comparándola con la curva estándar creado con detección CE. Si ambos se alinean bien (por ejemplo, Figura 1) y los efectos de la matriz de la muestra se han tenido en cuenta, se puede proceder con la detección dGuo por UV a 260 nm, en lugar de la detección de la CE.
   1. Medir 1,0 mg de dGuo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir MeOH grado 1,0 ml HPLC.
   2. Vortex a alta velocidad hasta dGuo disuelve completamente. Esta es la acción primaria; almacenar a -20 ° C durante varias semanas.
   3. Para crear la acción dGuo secundario (0,5 mM), diluir 143 l de dGuo social primario en 857 l de fase móvil HPLC. Almacenar en hielo hasta su uso y preparar fresco todos los días.
   4. Hacer diluciones adicionales para crear una curva estándar (por ejemplo, Tabla 2). Soluciones de las tiendas en el hielo y se preparan fresco todos los días. Normas Ejecutar en serie con muestras experimentales.
   5. Antes de correr, puede variar el voltaje del detector con la más alta concentración de la población para encontrar la tensión óptima.
4. 8-oxo-dGuo Standard
   1. Mida 1,0 mg de 8-oxo-dGuo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir MeOH grado 0,1 ml HPLC. Vortex a velocidad alta hasta 8-oxo-dGuo disuelve completamente. Este es el stock primaria de 8-oxo-dGuo. Conservar a -20 ° C durante sevsemana va-.
   2. En un tubo separado, combine 2,9 l de existencias primarias y 997,1 l de tampón de fase móvil HPLC, vórtice. Esta es la acción secundaria (10.000 nM).
   3. Para crear una solución de trabajo para la curva estándar (250 nm), se combinan 24,4 l de valores secundario y 975,6 l de tampón de fase móvil.
   4. Realizar diluciones adicionales para proporcionar las soluciones necesarias para crear una curva estándar (por ejemplo, la Tabla 3). Soluciones de las tiendas en el hielo y se preparan fresco todos los días. Ejecutar las normas con las muestras experimentales.
5. Cuantificación
   1. Integrar el área bajo la curva para ambos 8-oxo-dGuo y dGuo utilizando software estándar (como parte de la interfaz de HPLC-ordenador; ver Figura suplementaria 2A).
   2. Construir la curva estándar (concentración conocida de cada analito vs. área bajo la curva (Figura complementario 2B). Usando la ecuación de la curva estándar, para calcular la relación de 8-oxo-dGuo / dGuo para cada muestra.

6. Electroforesis en gel de agarosa

NOTA: electroforesis en gel de agarosa se puede realizar para verificar la integridad de la digestión del ADN.

1. Preparar 50x Tris-acetato-EDTA (TAE) de amortiguación, disolviendo 242 g de base Tris (FW = 121,14) en 750 ml de agua ultrapura. Añadir 57,1 ml de ácido acético glacial y 100 ml de 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA se disolverá completamente cuando el pH de la solución se ajusta a 8,0 con, por ejemplo, NaOH) y añadir agua ultrapura a un volumen final de 1 L. Almacenar a RT, diluir esta solución 50x antes de su uso.
2. Pesar 1 g de agarosa y se disuelven en 100 ml de tampón 1x TAE, calentando en el microondas durante 1-2 minutos. Use gafas y equipo de protección para evitar el contacto con agarosa hirviendo.
3. Enfriar la solución hasta que aproximadamente 50 ° C, añadir 5 l de bromuro de etidio (precaución: mutágeno) y se vierte en el aparato de gel de agarosa correr. Inserte el peine.
4. Esperar hasta que se solidifica la solución, se vierte tampón TAE sobre el gel y cargar las muestras (volumen depende del tamaño peine; típicamente, se carga 10-20 l de muestra de ADN, se mezcla con 6x colorante corriendo para visualizar y facilitar la carga).
5. Ejecutar el gel hasta que el colorante migra aproximadamente 2/3 de la longitud del gel (por ejemplo, 45 min a 150 V). Visualizar bandas de ADN bajo la luz ultravioleta.

Resultados

dGuo fue observado para tener un tiempo de retención de 4,7 min mientras que 8-oxo-dGuo tenía un tiempo de retención de aproximadamente 6,4 min (Figura 2A y B). Hay una diferencia sobre 1.000 veces en las alturas de los picos entre los dos analitos, como se ve en la Figura 2C. Voltamogramas para 8-oxo-dGuo y dGuo se obtuvieron por las normas de funcionamiento a un potencial de trabajo en el intervalo de 0,2 a 1,1 V. El potencial de trabajo óptimo para 8-oxo-dGuo se ...

Discusión

Aunque 8-oxo-dGuo ha sido reportado como un biomarcador útil de la oxidación del ADN, su cuantificación fiable puede suponer un reto. Aunque existen varios métodos publicados, hay una necesidad de una visión global, descriptivo de protocolo para permitir a los investigadores a implementar el método en sus laboratorios. Aquí presentamos un resumen detallado de un protocolo basado en HPLC que permita a los nuevos usuarios para establecer un método eficaz para la detección y cuantificación de 8-oxo-dGuo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-oxo-dGuo standard	Cayman Chemical Company	89320	Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphatase	Sigma-Aldrich	P5931	From E. coli
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901	Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylate	Sigma-Aldrich	D9533
dGuo standard	Sigma-Aldrich	D7145
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9390
DNA from salmon sperm	Sigma-Aldrich	D1626	Sodium salt
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527	TypeII, from bovine pancreas
DNAzol	Invitrogen	10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E4884	The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K media	ATCC	30-2004
Foetal bovine serum	ATCC	30-2020
Guard column	Chromatographic Specialties	YBA 99S03 0204GC	Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Monobasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered saline	Invitrogen	15190-250
Phosphodiesterase I enzyme	Sigma-Aldrich	P3243	Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizer	Thomas Scientific	7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively	Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
Trypsin	Invitrogen	15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silica	Chromatographic Specialties	YBA 99S03 1546WT