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  • Résumé
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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le but de ce protocole est la détection du marqueur de l'oxydation de l'ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo) par CLHP-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux.

Résumé

Le stress oxydatif est associé à de nombreux processus physiologiques et pathologiques, ainsi que le métabolisme des xénobiotiques, conduisant à l'oxydation des macromolécules biologiques, y compris l'ADN. Par conséquent, la détection efficace de l'oxydation de l'ADN est important pour une variété de disciplines de recherche, y compris la médecine et de la toxicologie. Un biomarqueur commun par oxydation de l'ADN endommagé est le 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo; souvent appelée à tort comme 8-hydroxy-2'-désoxyguanosine (8-OH-dGuo ou 8 oxo-dG)). Plusieurs protocoles de mesure 8-oxo-dGuo par chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique (HPLC-ED) ont été décrites. Toutefois, ceux-ci ont été principalement appliquées à l'ADN purifié traité avec pro-oxydants. En outre, en raison de différences méthodologiques entre les laboratoires, principalement en raison de différences dans l'équipement analytique, l'adoption de méthodes publiées pour la détection de la 8-oxo-dGuo par HPLC-ED nécessite une optimisation soignée par chaque laboratoire. UNprotocole complet, décrivant un tel processus d'optimisation, est absente. Ici, un protocole détaillé est décrit pour la détection de 8-oxo-dGuo par HPLC-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux. Elle illustre comment la préparation d'échantillons d'ADN peut être facilement et rapidement optimisée pour minimiser l'oxydation indésirable de l'ADN qui peut se produire au cours de la préparation des échantillons. Ce protocole montre comment détecter 8-oxo-dGuo dans des cellules humaines en culture d'adénocarcinome alvéolaire (par exemple, des cellules A549) traités avec l'agent oxydant KBrO 3, et à partir de la rate des souris exposées à la dibenzo d'hydrocarbure aromatique polycyclique (DEF, p) chrysène (DBC, anciennement connu sous le dibenzo (a, l) pyrène, Dalp). Dans l'ensemble, ce travail illustre comment une méthode HPLC-ED peut être facilement optimisée pour la détection de la 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques.

Introduction

Espèces réactives de l'oxygène (ROS), dont les niveaux de l'état d'équilibre peut augmenter pendant de nombreuses conditions pathologiques et le métabolisme xenotoxic, contribuent à une augmentation de la fréquence des dommages oxydatifs à l'ADN. Parmi plusieurs produits d'oxydation possibles de nucléobases, des dommages oxydatifs de l'ADN peut être facilement mesurée en utilisant le marqueur stable 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo), qui est l'une des formes oxydées de 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo ADN est le plus abondant lésion 2 et, par conséquent, a été étudiée de façon plus détaillée en tant que biomarqueur de l'oxydation de l'ADN malgré l'existence de produits d'oxydation de l'ADN multiple 3. Chez l'homme, ces dommages peuvent être réparé via la base réparation par excision de 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Si laissé non réparés, 8-oxo-dGuo peut contribuer à la formation de base de mutations paire de substitution (ie, G à T transversions) 4. Fait important, la 8-oxo-dGuo est un marqueur établi for dommages à l'ADN par rapport à l'initiation et à la promotion de la cancérogenèse 2. Par conséquent, la quantification précise de la 8-oxo-dGuo est un biomarqueur utile et souhaitable de dommages oxydatifs de l'ADN 5.

Il ya une grande confusion dans la littérature concernant les noms corrects pour les formes oxydante endommagées de 2-désoxyguanosine et, d'ailleurs, le nom correct du composé (s) régulièrement mesurés en tant que biomarqueur de lésions oxydatives de l'ADN 6. Les 8-céto-6,8-dicéto-énol et 6, les formes tautomères des 8-oxo-dGuo (représenté sur la figure 1) sont les deux plus importants tautomères décrits dans la littérature 5,7. La forme 6,8-dicéto est la forme la plus importante au pH physiologique de 7,4, et est le produit d'oxydation de l'ADN le plus important 7. Par conséquent, 8-oxo-dGuo, plutôt que 8-hydroxy-dGuo est le nom le plus approprié pour ce produit d'oxydation 6. Il est également important de noter que le 2-désoxyguanosine (dGuo), plutôt que nucleobase guanine (GUA) ribonucléoside ou guanosine (Guo), respectivement, sont détectés par la plupart des méthodes 6.

Détection précise et la quantification de 8-oxo-dGuo est difficile en raison de: i) la variabilité dans la digestion de l'échantillon d'ADN, ii) l'oxydation accidentelle de dGuo à 8-oxo-dGuo qui peut se produire lors de la préparation de l'échantillon, et iii) la nécessité pour la validation effective de la méthode HPLC-ED analytique 8. Dans ce protocole, nous avons cherché à obtenir i) en fournissant des conditions, favorables à la digestion complète de l'ADN et ii) par le chélateur inclusion de métal et des solutions de chélateur-traitée et un réactif d'ADN isolation spéciale, tandis que iii) n'a été que partiellement abordées par l'inclusion de Des témoins positifs et fournissent ainsi que la méthode est capable de détecter des 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques. En outre la validation est au-delà de la portée de ce document. Cependant, nous sommes convaincus que ce protocole aidera la prospectiveles utilisateurs à déterminer la mesure dans laquelle ils ont besoin de valider formellement le protocole, en fonction de leurs besoins. Une liste des étapes nécessaires à la validation formelle de la méthode est fournie plus loin. Pendant le développement et le déploiement d'une méthode de détection 8-oxo-dGuo, méthodes publiées ont été revues et consolidées. Ainsi, cette méthode élimine le besoin de recueillir des informations de plusieurs sources publiées qui manquent souvent d'importants détails expérimentaux tout en fournissant également des moyens rapides et simples de tester si la méthode pour la détection et la quantification de 8-oxo-dGuo a été adoptée avec succès. Ce procédé a été adapté avec succès utilisé pour analyser des échantillons d'ADN à partir de cellules en culture et le tissu murin. Cet article vidéo aidera les autres groupes à établir une méthode efficace pour la détection et la quantification fiable de 8-oxo-dGuo par HPLC-ED.

Protocole

Veiller à ce que tous l'élevage, le logement, la manipulation et l'expérimentation respecter les règles et réglementations locales et que les protocoles d'expérimentation sont approuvés avant le début de toute étude. Pour les expériences décrites, soins aux animaux, la manipulation et le traitement ont été approuvés par le Comité de protection des animaux Santé Canada. Voir la "table des réactifs" pour l'information des fournisseurs.

1. Prélèvement d'échantillons biologiques

  1. Cellules ou tissus animaux
    1. Cultiver des cellules d'adénocarcinome A549 alvéolaires humains dans un milieu F12-K contenant 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
    2. cellules de semences à environ 1 million de cellules par une plaque de 10 cm. Pour chaque expérience, utiliser un ensemble de 12 plaques au total (trois plaques par une répétition biologique x quatre doses) pour fournir suffisamment d'ADN (80 pg) pour la digestion enzymatique et l'analyse HPLC.
    3. Lorsque la densité des cellules devient supérieure à envron 70% de la superficie de la surface de la plaque, retirer médias et laver les cellules deux fois avec 4 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4.
    4. Pour les cellules animales cultivées, utiliser KBrO 3 comme un contrôle positif.
      REMARQUE: Une relation linéaire positive entre KBrO 3 concentration et la fréquence 8-oxo-dGuo a été rapporté dans la littérature 9.
    5. Dissoudre KBrO 3 dans du PBS. Assurez-vous que la concentration finale dans le milieu de culture cellulaire est supérieure à 1 mM pour obtenir une augmentation statistiquement significative de 8-oxo-dGuo par rapport aux cellules exposées à l'ONU. Ajouter la même concentration de KBrO 3 de chaque plaque de la série (par exemple, des plaques à 12 10 cm).
    6. Incuber les plaques pendant 3 heures à 37 ° C. Retirez les médias et laver une fois avec du PBS.
    7. Ajouter 1 ml de solution de trypsine (concentration des stocks de 2,5 g / ml) et incuber pendant 3 min à 37 ° C.
    8. Laver avec 4 ml de PBS, recueillir les cellules de chaque ensemble dans un seul polystyr conique de 50 mlle tube ène de centrifugeuse et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
    9. Retirer du PBS et stocker le culot cellulaire à -80 ° C jusqu'à analyse ultérieure. Oxydation de l'ADN artificiel peut être encore réduit par l'isolement nucléaire, comme décrit par ailleurs 10.
  2. Tissus animaux
    1. Dose animaux tel que requis. Pour ce protocole, adulte (âge de 9 semaines) traiter mâle Muta souris par gavage oral par jour pendant trois jours consécutifs avec 20 mg DBC / kg de poids corporel par jour dissous dans l'huile d'olive.
      NOTE: Cet animal transgénique ports conçu λ-bactériophage et la mutation du gène rapporteur lacZ de E. coli 11 est utilisé pour des essais de mutation rongeurs transgéniques 12.
    2. Effectuer l'autopsie des animaux, par exemple, anesthésié les souris peut utilisant l'isoflurane et ensuite euthanasiés par dislocation cervicale suivie par l'ouverture de la cavité thoracique. Immédiatement clignoter tissus de congélation dans l'azote liquide. tissus de conserver à -80 ° C jusqu'à l'analyse.
      NOTE: Le calendrier de l'euthanasie après le traitement peut être une autre variable importante (par exemple, l'oxydation de l'ADN était maximale à 72 heures après l'exposition au bruit dans le cerveau de rat et le foie 13).

2. Extraction de l'ADN, des précipitations et de lavage (pour les tissus Allez directement à 2.2)

  1. Homogénéiser les cellules recueillies dans un tube conique de centrifugation de polystyrène de 50 ml avec 1 ml d'ADN isoler agent tel que DNAzol. Utiliser un embout de pipette ul 1,000 pour disperser le culot de cellules jusqu'à ce que la solution soit homogène. Transfert homogénat à un nouveau tube de 1,5 ml. Incuber sur de la glace pendant 10-20 min. Passez à 2.3.
  2. Homogénéiser 15-20 mg de tissu dans une poche homogénéisateur en verre antiadhésif 1 ml contenant 500 ul agent de l'ADN d'isolement. Soulevez doucement et homogénéisateur inférieure pendant environ 1 min; tissus doux, il faudra moins de temps. Un traitement en douceur assure moins de cisaillement de l'ADN. Rangez le broyat sur la glace pendant environ 10-20 min.
  3. Pastillel'homogénat par centrifugation pendant 10 min à 10 000 x g et 4 ° C dans un tube conique de centrifugation de 1,5 ml.
  4. Soigneusement transférer le surnageant résultant dans un nouveau tube de 1,5 ml en faisant attention à éviter tout contact avec le culot.
  5. Précipiter l'ADN à partir de l'homogénat par addition de 0,5 ml de EtOH à 100% par 1 ml d'homogénat. Inversez tubes 10 fois pour assurer réactif isoler et EtOH sont suffisamment mélangés.
  6. À ce stade, l'ADN précipité est visqueux, spool il sur une pointe de pipette en plastique (par exemple, avec une capacité de rétention maximale de 200 pi), puis transféré à un nouveau 1,5 ml conique microtube.
    REMARQUE: centrifugation rapide peut être utilisé pour enlever tout reste de lysat à partir de l'ADN isolé.
    (DNA Laver et solubilisation)
  7. Ajouter 1 ml de EtOH à 75% à l'ADN isolé. Suspendre le culot d'ADN soigneusement en inversant les tubes 10 fois.
  8. Décanter avec soin l'éthanol à partir du tube. Veiller à ce que ee culot d'ADN bâtons sur le côté du tube. Conserver les tubes à la verticale pendant 1-2 min et utiliser une pipette pour enlever l'excédent EtOH du fond du tube.
  9. Répéter l'ADN laver une fois de plus, et soit stocker l'échantillon dans de l'éthanol à -20 ° C (stable pendant plusieurs mois) ou procéder immédiatement à la digestion.
  10. Dissoudre l'ADN dans un tampon de digestion (décrit ci-dessous), puis quantifier en utilisant des méthodes spectroscopiques classiques (par exemple, l'absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop).

3. Digestion enzymatique

  1. Préparez "tampon de digestion" en combinant des volumes appropriés (en fonction du nombre d'échantillons à digérer) de 50 mM de phosphate de Na monobasique (contenant 2,0 mM de KCl, mM de Desferal 1,0 (MPO) et 200 mM de MgCl2) avec 50 mM de phosphate dibasique de Na (contenant également mM KCl 2,0 mM, 1,0 MPO et 200 mM MgCl2). Chaque échantillon nécessite 4,0 pi monobasiques et 17,0 ul solution de phosphate disodique.
  2. Retirez tout EtOH restant dans le fond des échantillons de tubes et sécher à l'air pendant environ 5 min. Assurez-vous que l'ADN ne se dessèche pas complètement.
  3. Dissoudre 80 ug de l'ADN extrait dans 21,0 ul de tampon de digestion, ajouter une unité de DNase I dissous dans 2,0 ul de tampon de digestion.
  4. Vortex légèrement pour atteindre un mélange complet et incuber pendant 1,5 heures à 37 ° C.
  5. A la fin de la période d'incubation, ajouter 216,4 pi de solution de phosphate dibasique 50 mM de Na contenant 2,0 mM de KCl, 1,0 mM de MPO et 200 mM de MgCl 2.
  6. Préparer "digestion tampon-2" en combinant un volume de tampon de digestion avec neuf volumes de phosphate dibasique, 50 mM de Na (avec 2,0 mM de KCl, 1,0 mM de MPO et 200 mM de MgCl2).
  7. Ajouter 0,025 unités de la phosphodiestérase (PDE) Je enzyme dans 16,3 ul de la digestion tampon-2. Pipette de haut en bas pendant plusieurs secondes, puis vortex légèrement pour atteindre un mélange complet et incuber pendant 1,5 heures à 37 ° C.
  8. Ajouter 00,4 unités de phosphatase alcaline (AP) dans 8,0 ul de la digestion tampon-2. Pipette de haut en bas pendant plusieurs secondes, puis vortex légèrement pour atteindre un mélange complet et incuber pendant 1,5 heures à 37 ° C. Ajouter 33,0 pi qualité HPLC MeOH.
  9. Exécutez des échantillons d'ADN digérés par HPLC, comme décrit ci-dessous, tout de suite ou conserver à -80 ° C jusqu'à son utilisation pour minimiser l'oxydation. REMARQUE: Les étapes de digestion de 1,5 h suggérées ici sont basés sur des intervalles suggéré ailleurs 9 et sur ​​les conclusions que les protocoles similaires atteindre digestion complète de l'ADN 9. Par conséquent, on a supposé que le seul facteur limitant pour obtenir une digestion complète était temps et que l'inhibition de l'enzyme et de l'échantillon étaient des non-homogénéité négligeable.

4. HPLC Run: Préparation de la phase mobile, installation de Instrumentation et maintenance

  1. Utilisez de l'eau ultra pure pour préparer toutes les solutions tampons et traité à la résine de force de liaison (par exemple, Chelex 100: styrène divinylbenzene copolymère avec des ions iminodiacétate que les métaux de transition chelates avec une affinité élevée) pour minimiser la contamination métallique et l'oxydation de l'ADN au cours de la préparation des échantillons.
  2. Préparer 250 mM de tampon de phosphate de Na, pH 6,2. Utiliser un rapport de 1: 3,6957 de phosphate de sodium dibasique (FW = 177,99 g / mol) de phosphate de sodium monobasique (FW = 119,98 g / mol).
    Exemple: Par conséquent, pour un stock solution à 3 L combiner 70,81 g de monosodique et de 28,43 g de poudre dibasique, ajouter de l'eau jusqu'à par exemple, 2,8 L et vérifiez que le pH de la solution est de 6,2. Ajuster le pH avec 250 mM de phosphate mono ou disodique solutions préparées séparément, et non par des acides ou des bases concentrées. Ajouter 2,24 g de KCl pour obtenir une concentration de 10 mM de KCl.
  3. Préparer la phase mobile en trois bouteilles, au moins 1 L chaque contenant: solvant B - méthanol de qualité HPLC, solvant - B eau ultra-pure, et solvant C - tampon phosphate de l'étape 4.2. Insérez HPLC tube d'alimentation de la phase mobile dans les bouteilles; remaining tubes doivent également être trempées dans l'une des bouteilles (par exemple, solution C) et amorcés, même si elles ne sont pas nécessaires pour le mélange.
  4. Au cours de l'essai, le mélange des solutions de phase mobile jusqu'à 6% de solvant A, 74% de solvant B et 20% de solvant C pour obtenir une solution finale de mM de tampon 50 phosphate de sodium (pH 6,2) avec mM de KCl 2,0, et 6% de MeOH.
  5. Détacher l'électrode du détecteur électrochimique, le démonter et de référence propre et électrodes de travail avec les solutions de nettoyage de l'électrode et disques à polir recommandés par le fabricant. Rincer les surfaces nettoyées avec de l'eau ultra-pure, essuyez l'eau douce et d'assurer le détecteur est sec avant d'allumer le système.
  6. Remonter le détecteur et relier l'entrée de la phase mobile à l'électrode. Tournez sur le flux et permettre à la phase mobile pour remplir l'électrode avant de fixer le tube de sortie de phase mobile. Installez une nouvelle colonne avant de commencer l'optimisation. Assurez-vous que l'installation est dans la direction correcte et follows toutes les recommandations du fabricant.
  7. Allumez l'instrumentation HLPC bien en avance (par exemple, 1 h) de l'analyse des échantillons pour permettre un équilibrage et de réduire le bruit de fond. Voir le tableau 1 pour les réglages suggérés; la limite de pression de retour doit être réglé à 3000 psi pour éviter d'endommager la colonne. Allumez le dégazeur. Procéder à l'amorçage des pompes et de la mise en place gradient de solvant.
  8. Premier à sec les pompes selon les instructions du fabricant. Pour ce faire, pour mouiller les lignes quand une phase mobile a été remplacée ou l'entrée du tube est exposé à l'air.
  9. Localisez le disque d'amorçage et insérez une seringue en plastique de 10-15 ml il. Assurez-vous que la seringue est complètement inséré avant l'ouverture de la ligne. Pour ouvrir les lignes il suffit de tourner le compteur disque dans le sens horaire pour un tour.
  10. Lancer le premier avec la sélection de l'interface HPLC appropriée. Tirez doucement la seringue pour aspirer le fluide dans les lignes. Une fois fluide circule, le premier est terminé; permettre au programme determiner la course. Répétez l'opération pour toutes les lignes (généralement quatre, en fonction de l'instrument).
  11. Alternativement, le Premier humide lorsque les lignes sont déjà mouillés à partir d'un premier sèche plus tôt (voir ci-dessous).
    REMARQUE: Quand une grande quantité de temps écoulé entre les utilisations (par exemple, 2 semaines ou plus), un premier à sec est recommandé.
  12. Changer la composition des composants de solvant de phase mobile pour 25% par l'aide de l'interface utilisateur de l'HPLC. Depuis l'interface, sélectionner l'option "Fonction Direct", puis sélectionnez l'option "Wet Premier". Ce sera apprêter toutes les lignes en même temps.
  13. Assurez-vous que tout l'air est sorti du système en observant la ligne principale humide qui entre dans le conteneur de déchets. Après un bon premier, veiller à ce que pas de bulles sont laissés dans la ligne. Si des bulles persistent, répéter l'amorçage.
  14. Une fois que la pompe est amorcée, commencer à déplacer la phase mobile HPLC. Utiliser l'interface de HPLC pour changer manuellement la composition de la phase mobile à 6% de methanol (solvant A) et 94%l'eau (solvant B), et sélectionnez un taux de 0,9 ml / min. Autoriser 5 min pour effacer toute méthanol à partir de l'étape de nettoyage de la colonne.
  15. Après 5 min, de changer la composition de 6% de methanol (solvant A), 74% d'eau (solvant B), 20% de tampon (solvant C), d'augmenter la vitesse d'écoulement de 1,0 ml / min. Définissez d'autres paramètres tels que résumés dans le tableau 1, et définir la limite de pression à 3000 psi pour éviter d'endommager la colonne.
    REMARQUE: Les problèmes potentiels avec la configuration de HPLC comprennent la dérive de base, pic scission et de l'intensité du signal diminue. Ceux-ci peuvent généralement être surmontés par le nettoyage de la colonne après chaque utilisation, le nettoyage de l'électrode fréquentes, et veiller à ce que les solutions tampons sont exempts de contamination (par exemple, des particules ou la croissance microbienne).
  16. Exécutez la phase mobile pour environ 1-1,5 heures pour atteindre un signal de référence stable.
  17. Utilisation de l'interface de logiciel de l'appareil, sélectionnez les paramètres comme indiqué dans le tableau 1 et régler le temps d'exécution à 15 min. Injecter le sample. L'utilisation accrue des temps d'exécution pour les échantillons complexes (le déterminer de façon empirique en observant la présence ou l'absence de pics au-delà de l'intervalle de 15 min).
    REMARQUE: Le logiciel Instrument permet de programmer des conditions de roulage de l'échantillon et de la configuration pour autosampling.
  18. Après les courses ont été validées, éteindre la cellule de détection en utilisant l'interface du détecteur. Il est important de suivre les recommandations du fabricant concernant la mise hors tension du détecteur comme une mauvaise manipulation et d'arrêt peut endommager l'appareil. NE PAS éteindre le portable en passant à l'arrière du détecteur, car cela pourrait endommager l'appareil.
  19. Modifier manuellement la composition de la phase mobile à 6% de methanol et 94% d'eau. Exécutez pendant 5 min.
  20. Réduire manuellement le débit à 0,7 ml / min, changer immédiatement la composition à 50% de MeOH et 50% d'eau. Exécutez pendant au moins 20 min. Défaut d'exécuter cette étape pour la durée recommandée peut entraîner des dommages à la colonne et le détecteur. Éteignez le flux, unD puis éteignez le dégazeur.

5. Préparation des étalons

  1. Préparer tampon de phase mobile, comme indiqué dans les étapes 4.1-4.3 ci-dessus. Il est important d'utiliser la phase mobile HPLC pour la préparation de normes pour éviter les pics résultant du mélange de solutions dissemblables après l'injection de l'échantillon.
  2. Diluer cette solution un sur cinq avec de l'eau ultra pure avant de l'utiliser, et la solution finale doit contenir 6% de MeOH.
  3. dGuo standard
    NOTE: Un fort potentiel d'oxydation nécessaire pour la détection dGuo peut augmenter le risque de mesurer interférer composés électroactifs. Cela peut être vérifié, par exemple, une courbe d'étalonnage de détection UV de 260 nm à dGuo et en la comparant à la courbe d'étalonnage créée avec détection CE. Si les deux cadrent bien (par exemple, la figure 1 supplémentaire) et les effets de la matrice de l'échantillon ont été pris en compte, on peut procéder à la détection dGuo par UV à 260 nm, plutôt que la détection CE.
    1. Mesurer 1,0 mg de dGuo dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 1,0 ml de qualité HPLC MeOH.
    2. Vortex à grande vitesse jusqu'à dGuo dissout complètement. Ceci est le stock primaire; stocker à -20 ° C pendant plusieurs semaines.
    3. Pour créer le stock dGuo secondaire (0,5 mM), diluer 143 pi de primaire actions dGuo dans 857 pi de phase mobile HPLC. Stocker sur la glace jusqu'à utilisation et préparer frais tous les jours.
    4. Faire des dilutions pour créer une courbe standard (par exemple, le tableau 2). solutions de magasins sur la glace et à préparer quotidiennement. Exécuter les normes en série avec des échantillons expérimentaux.
    5. Avant de courir, faire varier la tension du détecteur utilisant la plus forte concentration du stock pour trouver la tension optimale.
  4. 8-oxo-dGuo standard
    1. Mesurer 1,0 mg de 8-oxo-dGuo dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 0,1 ml de qualité HPLC MeOH. Vortex à haute vitesse jusqu'à 8-oxo-dGuo dissout complètement. Ceci est le stock primaire de 8-oxo-dGuo. Conserver à -20 ° C pendant sevsieurs semaines.
    2. Dans un tube, mélanger 2,9 ul d'actions primaires et 997,1 pi de tampon de CLHP phase mobile, vortex. Ceci est le stock secondaire (10 000 nM).
    3. Pour créer une solution de travail pour la courbe standard (250 nM), mélanger 24,4 ul d'actions secondaire et 975,6 pi de tampon de la phase mobile.
    4. Effectuer d'autres dilutions pour fournir les solutions nécessaires pour créer une courbe standard (par exemple, le tableau 3). solutions de magasins sur la glace et à préparer quotidiennement. Normes courir avec les échantillons expérimentaux.
  5. Quantification
    1. Intégrer l'aire sous la courbe pour les deux 8-oxo-dGuo et dGuo utilisant un logiciel standard (comme une partie de l'interface HPLC-ordinateur; voir complémentaire figure 2A).
    2. Construire la courbe standard (concentration connue de chaque analyte vs aire sous la courbe (complémentaire figure 2B). En utilisant l'équation de la courbe standard, pour calculer le ratio 8-oxo-dGuo / dGuo pour chaque échantillon.

6. Agarose Gel Electrophoresis

REMARQUE: électrophorèse sur gel d'agarose peut être réalisée pour vérifier l'intégrité de l'ADN digestion.

  1. Préparer 50x Tris-acétate-EDTA (TAE) tampon, en dissolvant 242 g de base Tris (FW = 121.14) dans 750 ml d'eau ultra-pure. Ajouter 57,1 ml d'acide acétique glacial et 100 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8,0; EDTA complètement dissoudre lorsque le pH de la solution est ajusté à 8,0 avec, par exemple, NaOH) et ajouter de l'eau ultra-pure à un volume final de 1 L. Conserver à la température ambiante, diluer cette solution 50x avant de l'utiliser.
  2. Peser 1 g d'agarose et le dissoudre dans 100 ml de tampon 1x TAE, chauffage au micro-ondes pendant 1-2 min. Porter des lunettes et des équipements de protection pour éviter tout contact avec de l'agarose bouillante.
  3. Refroidir la solution jusqu'à ce que environ 50 ° C, ajouter 5 ul de bromure d'éthidium (attention: mutagène) et versez-le dans l'appareil gel de fonctionnement agarose. Insérez le peigne.
  4. Attendez jusqu'à ce que la solidification de la solution, verser tampon TAE sur le gel et de charger les échantillons (volume dépend de la taille de peigne; typiquement, 10-20 ul de l'échantillon d'ADN est chargé, mélangé avec 6x colorant courir à visualiser et à faciliter le chargement).
  5. Exécuter le gel jusqu'à ce que le colorant migre approximativement 2/3 de la longueur du gel (par exemple, 45 minutes à 150 V). Visualiser les bandes d'ADN sous la lumière UV.

Résultats

dGuo a été observé à un temps de rétention de 4,7 min alors que les 8-oxo-dGuo avait un temps de rétention d'environ 6,4 min (Figure 2A et B). Il n'y a de différence sur 1000 fois dans les hauteurs de pics entre les deux analytes, comme on le voit sur ​​la figure 2C. Voltammogrammes pour 8-oxo-dGuo et dGuo ont été obtenus par les normes en cours d'exécution à un potentiel de travail dans la gamme de 0,2 à 1,1 V. Le potentiel de travail optima...

Discussion

Bien que 8-oxo-dGuo a été rapporté comme un biomarqueur utile de l'oxydation de l'ADN, sa quantification fiable peut représenter un défi. Bien que plusieurs méthodes publiées existent, il ya une nécessité d'une approche globale, aperçu descriptif du protocole pour permettre aux chercheurs de déployer la méthode dans leurs laboratoires. Ici, nous présentons un aperçu détaillé d'un protocole fondé HPLC-qui ​​permettra aux nouveaux utilisateurs d'établir une méthode efficace pour ...

Déclarations de divulgation

No conflict of interest or competing financial interests declared.

Remerciements

Cette recherche a été financée par l'Initiative de Santé Canada de recherche en génomique et le développement (GRDI) et la Stratégie canadienne de réglementation de la biotechnologie (SCRB). Les auteurs ne sont pas de conflit d'intérêts.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
8-oxo-dGuo standardCayman Chemical Company89320Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphataseSigma-AldrichP5931From E. coli
Chelex 100Sigma-AldrichC7901Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylateSigma-AldrichD9533
dGuo standardSigma-AldrichD7145
Dibasic sodium phosphateSigma-AldrichS9390
DNA from salmon spermSigma-AldrichD1626Sodium salt
DNase ISigma-AldrichD4527TypeII, from bovine pancreas
DNAzolInvitrogen10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma-AldrichE4884The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K mediaATCC30-2004
Foetal bovine serumATCC30-2020
Guard columnChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 0204GCProtects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Monobasic sodium phosphateSigma-AldrichS9638
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140-122
Phosphate buffered salineInvitrogen15190-250
Phosphodiesterase I enzyme Sigma-AldrichP3243Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizerThomas Scientific7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectivelyVolume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
TrypsinInvitrogen15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silicaChromatographic SpecialtiesYBA 99S03 1546WT

Références

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