HPLC Misurazione del DNA ossidazione Biomarker, 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina, in colture cellulari e tessuti animali

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è il rilevamento del marker dell'ossidazione DNA, 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dGuo) mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali.

Abstract

Lo stress ossidativo è associato con molti processi fisiologici e patologici, nonché metabolismo xenobiotico, porta alla ossidazione di Biomacromolecules, compreso il DNA. Pertanto, la rilevazione efficiente di ossidazione del DNA è importante per una varietà di discipline di ricerca, tra cui la medicina e tossicologia. Un biomarcatore comune di DNA ossidativo danneggiato è di 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dGuo; spesso erroneamente indicato come 8-idrossi-2'-deossiguanosina (8-OH-dGuo o 8 -oxo-dG)). Sono stati descritti diversi protocolli per 8-oxo-dGuo misurazione ad alta pressione cromatografia liquida con rivelazione elettrochimica (HPLC-ED). Tuttavia, questi sono stati applicati principalmente DNA purificato trattati con pro-ossidanti. Inoltre, a causa delle differenze metodologiche tra laboratori, principalmente a causa delle differenze di allestimento di analisi, l'adozione di metodi pubblicati per il rilevamento di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-DE richiede un'attenta ottimizzazione da ciascun laboratorio. Laprotocollo, descrivendo un tale processo di ottimizzazione, è carente. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per la rilevazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali. Esso illustra come preparazione del campione di DNA può essere facilmente e rapidamente ottimizzato per minimizzare indesiderabile ossidazione DNA che può verificarsi durante la loro preparazione. Questo protocollo mostra come rilevare 8-oxo-dGuo in cellule coltivate umane adenocarcinoma alveolare (cioè cellule A549) trattati con l'agente ossidante KBrO _3, e dalla milza di topi esposti al dibenzo idrocarburi aromatici policiclici (DEF, p) crisene (DBC, precedentemente noto come dibenzo (a, l) pirene, Dalp). Nel complesso, questo lavoro illustra come un metodo HPLC-ED può essere facilmente ottimizzato per il rilevamento di 8-oxo-dGuo in campioni biologici.

Introduzione

Specie reattive dell'ossigeno (ROS), i cui livelli di stato stazionario può aumentare durante molte condizioni patologiche e metabolismo xenotoxic, contribuiscono ad una maggiore frequenza di danno ossidativo al DNA. Tra diverse possibili basi azotate prodotti di ossidazione, danno ossidativo del DNA può essere facilmente misurata utilizzando il marcatore stabile 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dGuo), che è una delle forme ossidate di 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) ^1. 8-oxo-dGuo è il più abbondante lesione DNA ² e, di conseguenza, è stato studiato per maggiore dettaglio come biomarker di ossidazione DNA nonostante l'esistenza di DNA multiple prodotti di ossidazione ^3. Negli esseri umani, questo danno può essere riparato con la base di riparazione per escissione dell'8-oxoguanine glicosilasi 1 (hOGG1) ^4. Se lasciato non riparata, 8-oxo-dGuo può contribuire alla formazione di base di mutazioni coppia-di sostituzione (cioè, G a T trasversioni) ^4. È importante sottolineare che, a 8-oxo-dGuo è un marcatore consolidata for danni al DNA in relazione alla iniziazione e promozione di carcinogenesi ^2. Pertanto, la quantificazione precisa di 8-oxo-dGuo è un biomarker utile e desiderabile di danno ossidativo del DNA ^5.

C'è confusione diffusa nella letteratura per quanto riguarda i nomi corretti per i moduli ossidativamente-danneggiati di 2-deossiguanosina e, inoltre, il nome corretto del composto (s) di routine misurato come biomarker di danno ossidativo del DNA ^6. I 6,8-dicheto e 6-enolica, 8-cheto forme tautomere di 8-oxo-dGuo (illustrata nella figura 1) sono i due tautomeri più importanti discussi in letteratura ^5,7. La forma 6,8-dicheto è la forma più prominente a pH fisiologico di 7,4, ed è il più importante prodotto di ossidazione DNA ^7. Pertanto, 8-oxo-dGuo, piuttosto che a 8-idrossi-dGuo è il nome più appropriato per questo prodotto di ossidazione ^6. E 'anche importante notare che il 2-deossiguanosina (dGuo), piuttosto che nucleobase guanina (Gua) o guanosina ribonucleosidi (Guo), rispettivamente, viene rilevato dalla maggior parte dei metodi ^{di 6.}

La rilevazione accurata e la quantificazione di 8-oxo-dGuo è difficile a causa: i) la variabilità nella digestione del campione di DNA, ii) ossidazione accidentale di dGuo a 8-oxo-dGuo che può verificarsi durante la preparazione del campione, e iii) la necessità per la convalida efficace del metodo HPLC-ED analitica ^8. In questo protocollo, abbiamo puntato a raggiungere i) offrendo condizioni favorevoli, per la completa digestione del DNA e ii) da parte del chelante inclusione metallo e soluzioni ferrochelanti trattati e un DNA di isolamento speciale reagente, mentre iii) solo parzialmente affrontati dalla inclusione di controlli positivi e fornendo in tal modo che il metodo è in grado di rilevare 8-oxo-dGuo in campioni biologici. Ulteriore convalida va oltre lo scopo di questo articolo. Tuttavia, siamo fiduciosi che questo protocollo aiuterà il futuroutenti di determinare la misura in cui essi devono convalidare formalmente il protocollo, a seconda dei loro fini. Un elenco di passi necessari per la validazione formale del metodo è fornito ulteriormente. Durante lo sviluppo e la diffusione di un metodo di rilevazione a 8-oxo-dGuo, metodi pubblicati sono stati rivisti e consolidati. Così, questo metodo elimina la necessità di raccogliere informazioni da diverse fonti pubblicati che spesso mancano di importanti dettagli sperimentali fornendo allo stesso tempo mezzi rapidi e semplici di test, se è stato adottato il metodo per l'individuazione e la quantificazione di 8-oxo-dGuo con successo. Questo metodo adatto è stato impiegato con successo per analizzare campioni di DNA da cellule in coltura e tessuti murino. Questo articolo video aiuterà altri gruppi a stabilire un metodo efficace per un rilevamento affidabile e quantificazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-ED.

Protocollo

Assicurarsi che tutti la zootecnia, l'alloggio, la manipolazione e la sperimentazione rispettare norme e regolamenti locali e che i protocolli di sperimentazione siano approvate prima di iniziare qualsiasi studio. Per gli esperimenti descritti, cura degli animali, la gestione e il trattamento sono stati approvati dal Comitato Animal Care Health Canada. Vedere la "tabella di reagenti" per informazioni dei fornitori.

1. la raccolta di campioni biologici

1. Cellule o tessuti animali
   1. Crescere cellule adenocarcinoma A549 alveolari umani in F12-K multimediale contenente il 10% di siero bovino fetale, 100 Unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina.
   2. Cellule seme a circa 1 milione di cellule per un piatto di 10 cm. Per ogni esperimento, utilizzare un set di 12 piatti in totale (tre piastre per una replica biologico x quattro dosi) per fornire abbastanza DNA (80 mg) per la digestione enzimatica e analisi HPLC.
   3. Quando la densità cellulare diventa maggiore di ca.imately 70% della superficie piatto, rimuovere il supporto e lavare le cellule due volte con 4 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4.
   4. Per le cellule animali in coltura, utilizzare KBrO ₃ come controllo positivo.
      NOTA: una relazione lineare positiva tra KBrO ₃ la concentrazione e la frequenza a 8-oxo-dGuo è stato riportato in letteratura ^9.
   5. Sciogliere KBrO ₃ in PBS. Assicurarsi che la concentrazione finale nel mezzo di coltura cellulare è superiore a 1 mM per ottenere un aumento statisticamente significativo a 8-oxo-dGuo rispetto alle cellule non-esposte. Aggiungere la stessa concentrazione di KBrO ₃ a ciascuna piastra in serie (ad esempio, piastre da 12 a 10 cm).
   6. Incubare le piastre per 3 ore a 37 ° C. Rimuovere il supporto e lavare una volta con PBS.
   7. Aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina (concentrazione magazzino 2,5 g / ml) e incubare per 3 minuti a 37 ° C.
   8. Lavare con 4 ml di PBS, raccogliere le cellule di ogni insieme in un unico polystyr 50 ml conicaene provetta da centrifuga e centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
   9. Rimuovere PBS e conservare il pellet cellulare a -80 ° C fino ad ulteriore analisi. Ossidazione DNA artificiale può essere ulteriormente ridotta isolamento nucleare, come descritto altrove ^10.
2. Tessuti animali
   1. Dose animali come richiesto. Per questo protocollo, per adulti (9 settimane di età) trattamento negli uomini della Muta mouse mediante sonda gastrica al giorno per tre giorni consecutivi con 20 mg DBC / kg di peso corporeo al giorno disciolto in olio d'oliva.
      NOTA: Questo animale transgenico porti ingegnerizzato λ-batteriofago e la mutazione gene reporter lacZ da E. coli ¹¹ è utilizzato per roditori transgenici mutazione analisi ^12.
   2. Eseguire necroscopia animale ad esempio, anestetizzato i topi può con isoflurano e quindi eutanasia tramite dislocazione cervicale seguita da apertura cavità toracica. Immediatamente lampeggiare tessuti congelare in azoto liquido. Conservare i tessuti a -80 ° C fino al momento dell'analisi.
      NOTA: I tempi dell'eutanasia dopo il trattamento può essere un'altra variabile importante (per esempio, l'ossidazione del DNA è massima a 72 ore dopo l'esposizione al rumore nel cervello di ratto e nel fegato ^13).

2. DNA Extraction, precipitazioni e di lavaggio (per i tessuti procedere direttamente alla 2.2)

1. Omogeneizzare le cellule raccolte in un 50 ml conica provetta di polistirene centrifuga con 1 ml di DNA isolare l'agente, come DNAzol. Utilizzare un puntale microlitri 1.000 per disperdere il pellet cellulare fino a quando la soluzione è omogenea. Trasferire omogenato in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Incubare in ghiaccio per 10-20 minuti. Procedere alla 2.3.
2. Omogeneizzare 15-20 mg di tessuto in un 1 ml palmare omogeneizzatore vetro antiaderente contenente 500 microlitri agente di isolamento del DNA. Delicatamente sollevare e abbassare omogeneizzatore per circa 1 minuto; tessuti morbidi richiederanno meno tempo. Trattamento delicato assicura meno tosatura del DNA. Conservare il omogenato in ghiaccio per circa 10-20 min.
3. Pallinal'omogeneizzato mediante centrifugazione per 10 min a 10.000 xg e 4 ° C in una provetta da 1,5 ml conica.
4. Trasferire accuratamente il surnatante risultante in una nuova provetta 1,5 ml facendo attenzione ad evitare di contattare il pellet.
5. Precipitare DNA dall'omogeneizzato aggiungendo 0,5 ml di EtOH 100% per 1 ml di omogenato. Invertire tubi 10 volte per garantire l'isolamento reagenti e EtOH sono sufficientemente mescolato.
6. A questo punto, precipitato DNA è viscoso, bobina esso su una punta di plastica pipetta (ad esempio, con una capacità massima tenuta di 200 mL) e poi trasferito in un nuovo 1,5 ml provetta conica.
   NOTA: centrifugazione rapida può essere impiegato per rimuovere ogni lisato residua dal DNA isolato.
   (Wash DNA e solubilizzazione)
7. Aggiungere 1 ml di 75% EtOH al DNA isolato. Sospendere il pellet di DNA bene capovolgendo le provette 10 volte.
8. Decantare con cautela l'etanolo dal tubo. Assicurarsi che the DNA pellet attacca al lato del tubo. Conservare le provette verticalmente per 1-2 min e utilizzare una pipetta per rimuovere qualsiasi eccesso di EtOH dal fondo della provetta.
9. Ripetere il DNA lavare una volta di più, e sia conservare il campione in EtOH a -20 ° C (stabile per diversi mesi) o procedere immediatamente alla digestione.
10. Sciogliere DNA in tampone di digestione (descritto di seguito) e quindi quantificare con metodi spettroscopici standard (cioè, l'assorbanza a 260 nm utilizzando NanoDrop spettrofotometro).

3. digestione enzimatica

1. Preparare "tampone di digestione" combinando volumi adeguati (a seconda del numero di campioni da digerire) di 50 mM Na fosfato monobasico (contenenti KCl 2,0 mM, Desferal 1,0 mM (DFO) e 200 mM MgCl ₂₎ con 50 mM fosfato bibasico Na (contenente anche KCl 2,0 mM, 1,0 DFO mM MgCl e 200 mM _2). Ogni campione richiede 4,0 microlitri monobasici e 17,0 ml di soluzione di fosfato bibasico.
2. Rimuovere ogni residuo EtOH dal fondo dei campioni tubi e aria secca per circa 5 minuti. Assicurarsi che il DNA non si asciughi completamente.
3. Sciogliere 80 mg DNA estratto in 21.0 ml di tampone di digestione, aggiungere 1 unità di DNasi I disciolti in 2,0 ml di tampone di digestione.
4. Vortex leggermente per ottenere una miscelazione accurata e incubare per 1,5 ore a 37 ° C.
5. Alla fine del periodo di incubazione, aggiungere 216,4 ml di soluzione di fosfato bibasico 50 mM Na contenente KCl 2,0 mM, 1,0 mM DFO e MgCl ₂ 200 mM.
6. Preparare "digestione tampone-2", combinando un volume di tampone digestione con nove volumi di bibasico, 50 Na mM fosfato (con mM KCl 2.0, 1.0 DFO e 200 mm MgCl _2).
7. Aggiungere 0,025 unità di fosfodiesterasi (PDE) che enzima in 16.3 ml di buffer di 2-digestione. Pipetta su e giù per alcuni secondi, poi vortice leggermente per ottenere una completa miscelazione e incubare per 1,5 ore a 37 ° C.
8. Aggiungi 0.4 Unità di fosfatasi alcalina (AP) in 8,0 ml di buffer di 2-digestione. Pipetta su e giù per alcuni secondi, poi vortice leggermente per ottenere una completa miscelazione e incubare per 1,5 ore a 37 ° C. Aggiungere 33,0 ml HPLC grado MeOH.
9. Eseguire campioni di DNA digeriti in HPLC, come descritto di seguito, subito o conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso per ridurre al minimo l'ossidazione. Nota: la procedura di digestione 1,5 hr qui suggeriti si basano su tali intervalli suggerito altrove ⁹ e sui risultati che protocolli simili a raggiungere la completa digestione del DNA ^9. Pertanto, si è ipotizzato che il fattore limitante per ottenere la completa digestione era tempo e che l'inibizione enzimatica e disomogeneità del campione erano trascurabili.

4. HPLC Run: Preparazione della fase mobile, il programma di installazione di strumenti e manutenzione

1. Usare acqua ultrapura per preparare tutte le soluzioni tampone e trattati con alto legame resina resistenza (ad esempio, Chelex 100: stirene divinylbecopolimero nzene con iminodiacetate ioni che i metalli di transizione chelati con elevata affinità) per ridurre al minimo la contaminazione da metalli e ossidazione DNA durante la preparazione del campione.
2. Preparare tampone fosfato 250 mM Na, pH 6,2. Utilizzare un rapporto di 1: 3,6957 di sodio fosfato bibasico (FW = 177.99 g / mol) di fosfato di sodio monobasico (FW = 119.98 g / mol).
   Esempio: Pertanto, per una soluzione madre 3 L combinare 70.81 g di monobasico e 28.43 g di polvere dibasico, aggiungere acqua fino ad esempio, 2,8 L e verificare che il pH della soluzione è 6,2. Aggiustare il pH con 250 mM mono o sodio fosfato bibasico, soluzioni preparate separatamente e non con acidi concentrati o basi. Aggiungere 2,24 g di KCl per ottenere una concentrazione di KCl 10 mM.
3. Preparare fase mobile a tre bottiglie, almeno 1 L ogni, contenente: solvente B - HPLC-grade metanolo, solventi - B acqua ultrapura, e solvente C - tampone fosfato dal punto 4.2. Inserire HPLC tubo di alimentazione fase mobile nelle bottiglie; remainitubi ng devono essere immerse anche in una delle bottiglie (ad esempio, soluzione C) e innescato anche se non sono necessarie per la miscelazione.
4. Durante la corsa, mescolare le soluzioni fase mobile 6% Un solvente, 74% B solvente e il 20% di solvente C per ottenere la soluzione finale di 50 mM tampone fosfato di sodio (pH 6,2) con KCl 2,0 mM, e il 6% MeOH.
5. Staccare l'elettrodo dal rilevatore elettrochimico, smontarlo e riferimento pulita ed elettrodi di lavoro con le soluzioni di pulizia elettrodo e dischi lucidatura consigliati dal costruttore. Sciacquare le superfici pulite con acqua ultrapura, pulire l'acqua fuori delicatamente e verificare che il rivelatore è asciutta prima di accendere il sistema.
6. Riassemblare il rivelatore e collegare l'ingresso fase mobile all'elettrodo. Accendere il flusso e consentire la fase mobile per riempire l'elettrodo prima di collegare il tubo di uscita fase mobile. Installare una nuova colonna prima di iniziare l'ottimizzazione. Assicurarsi che l'installazione è nella direzione corretta e follows raccomandazioni tutto del produttore.
7. Accendere la strumentazione HPLC con largo anticipo (ad esempio, 1 ora) delle analisi dei campioni per consentire il raggiungimento dell'equilibrio e per ridurre il rumore della linea di base. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni consigliate; il limite di pressione posteriore dovrebbe essere impostato a 3.000 psi per evitare danni alla colonna. Accendere il sistema di degasaggio. Procedere con adescamento delle pompe e la creazione di pendenza solvente.
8. Primo secco le pompe in base alle istruzioni del produttore. Eseguire questa bagnare le linee quando una fase mobile è stata sostituita o nell'ingresso tubazione viene esposta all'aria.
9. Individuare il disco di adescamento ed inserire una siringa di plastica di 10-15 ml lì. Assicurarsi che la siringa sia completamente inserita prima di aprire la linea. Per aprire le linee semplicemente girare il contatore disco in senso orario per un turno.
10. Inizia il primo con la selezione appropriata interfaccia HPLC. Tirare delicatamente la siringa per aspirare il fluido nelle linee. Una volta che il fluido scorre, il primo è completa; consentire al programma difinire la corsa. Ripetere per tutte le linee (in genere quattro, a seconda dello strumento).
11. In alternativa, il primo bagnato quando le linee sono già bagnate da un primo asciutto prima (vedi sotto).
    NOTA: quando è trascorso una grande quantità di tempo tra gli usi (ad esempio, 2 settimane o più), si raccomanda un primo asciutto.
12. Modificare la composizione dei componenti solvente fase mobile al 25% ciascuno utilizzando l'interfaccia utente HPLC. Dall'interfaccia, selezionare l'opzione "Funzione diretta", quindi selezionare l'opzione "Wet Prime". Questo adescherà tutte le linee contemporaneamente.
13. Assicurarsi che tutta l'aria è fuori dal sistema osservando la linea primaria bagnato mentre entra nel contenitore di rifiuti. Dopo un buon primo, assicurarsi che non bolle sono lasciati nella linea. Se bolle persistono, ripetere adescamento.
14. Quando la pompa è adescata, iniziare a muovere la fase mobile HPLC. Utilizzare l'interfaccia HPLC per modificare manualmente la composizione della fase mobile al 6% di metanolo (solvente A) e il 94%acqua (solvente B), e selezionare una velocità di flusso di 0,9 ml / min. Lasciare 5 min per eliminare qualsiasi metanolo dalla fase di pulizia della colonna.
15. Dopo 5 min, modificare la composizione al 6% di metanolo (solvente A), 74% di acqua (solvente B), il tampone 20% (solvente C), di aumentare la portata di 1,0 ml / min. Imposta altri parametri come riassunto nella tabella 1, e impostare il limite di contropressione a 3.000 psi per evitare danni alla colonna.
    NOTA: Potenziali problemi con l'installazione HPLC sono alla deriva della linea di base, picco dividere e intensità del segnale diminuisce. Questi di solito può essere superate con la pulizia della colonna dopo ogni utilizzo, la pulizia degli elettrodi frequente, e garantire che le soluzioni tampone sono privi di contaminazioni (ad esempio, la presenza di particelle o di crescita microbica).
16. Eseguire la fase mobile per circa 1-1,5 ore per ottenere un segnale stabile di riferimento.
17. Utilizzando l'interfaccia software dello strumento, selezionare i parametri come indicato nella tabella 1 e set gestito il tempo di 15 min. Iniettare il sample. Utilizzare maggiori tempi di esecuzione per campioni complessi (determinare empiricamente osservando la presenza o l'assenza di picchi oltre intervallo di 15 min).
    NOTA: Il software Instrument consente la programmazione delle condizioni di esecuzione del campione e configurazione per autosampling.
18. Dopo l'esecuzione sono state completate, spegnere la cella del rivelatore utilizzando l'interfaccia del rivelatore. E 'importante seguire le raccomandazioni del produttore per quanto riguarda spegnere il rilevatore come uso improprio e di arresto può danneggiare lo strumento. NON spegnere la cella passando retro del rivelatore, che possono danneggiare lo strumento.
19. Modificare manualmente la composizione della fase mobile al 6% di metanolo e 94% di acqua. Eseguire per 5 min.
20. Ridurre manualmente la portata di 0,7 ml / min, immediatamente cambiare la composizione al 50% MeOH e 50% di acqua. Run per almeno 20 minuti. La mancata eseguire questo passaggio per il tempo indicato potrebbe causare danni alla colonna e il rivelatore. Chiudere il flusso, und quindi spegnere il sistema di degasaggio.

5. Preparazione di norme

1. Preparare tampone fase mobile come indicato dal passo 4,1-4,3 sopra. È importante utilizzare la fase mobile HPLC per la preparazione di standard per evitare picchi risultanti dalla miscelazione di soluzioni differenti dopo l'iniezione del campione.
2. Diluire la soluzione uno su cinque con acqua ultrapura prima dell'uso, e la soluzione finale deve contenere il 6% MeOH.
3. dGuo standard
   NOTA: Elevato potenziale di ossidazione necessari per il rilevamento dGuo può aumentare il rischio di misurare interferire composti elettroattivi. Questo si può verificare, ad esempio, una curva standard di rilevamento UV di dGuo a 260 nm e confrontandola con la curva standard creato con rilevazione CE. Se entrambi allineare bene (ad esempio, la figura complementare 1) e gli effetti di matrice del campione sono state prese in considerazione, si può procedere con la rilevazione dGuo da UV a 260 nm, piuttosto che la rilevazione CE.
   1. Misura 1,0 mg di dGuo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere grado MeOH 1,0 ml HPLC.
   2. Vortex ad alta velocità fino dGuo scioglie completamente. Questo è il titolo principale; conservare a -20 ° C per diverse settimane.
   3. Per creare il dGuo azione secondaria (0,5 mm), diluire 143 ml di dGuo primario azionario in 857 ml di Fase mobile per HPLC. Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso e preparare quotidiano fresco.
   4. Fare diluizioni per creare una curva standard (ad esempio, Tabella 2). Solutions Store su ghiaccio e preparare fresco ogni giorno. Standard Eseguire in serie con i campioni sperimentali.
   5. Prima di eseguire, variare la tensione detector utilizza la più alta concentrazione dello stock di trovare la tensione ottimale.
4. 8-oxo-dGuo standard
   1. Misurare 1,0 mg di 8-oxo-dGuo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere grado MeOH 0,1 ml HPLC. Vortex sull'alta velocità fino a 8-oxo-dGuo dissolve completamente. Questo è il magazzino principale di 8-oxo-dGuo. Conservare a -20 ° C per sevsettimane rale.
   2. In un tubo, unire 2,9 ml di brodo primario e 997,1 ml di HPLC tampone fase mobile, vortice. Questo è il titolo secondario (10.000 Nm).
   3. Per creare una soluzione di lavoro per la curva standard (250 nm), unire 24.4 ml di brodo secondaria e 975,6 ml di buffer di fase mobile.
   4. Eseguire ulteriori diluizioni per fornire le soluzioni necessarie per creare una curva standard (ad esempio, Tabella 3). Solutions Store su ghiaccio e preparare fresco ogni giorno. Norme Corri con i campioni sperimentali.
5. Quantificazione
   1. Integrare l'area sotto la curva sia 8-oxo-dGuo e dGuo utilizzando software standard (come una parte di interfaccia HPLC-macchina; vedere complementare Figura 2A).
   2. Creare la curva standard (concentrazione nota di ogni analita vs. area sotto la curva (complementare Figura 2B). Usando l'equazione della curva standard, calcolare il rapporto per 8-oxo-dGuo / dGuo per ogni campione.

6. Gel di Agarosio

NOTA: elettroforesi su gel di agarosio può essere eseguito per verificare la completezza della digestione DNA.

1. Preparare 50x Tris-acetato-EDTA (TAE) Buffer, sciogliendo 242 g Tris base (FW = 121,14) in 750 ml di acqua ultrapura. Aggiungere 57,1 ml di acido acetico glaciale e 100 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA sciogliere completamente quando il pH della soluzione viene regolato a 8,0 con ad esempio, NaOH) e aggiungere acqua ultrapura ad un volume finale di 1 L. Conservare a RT, diluire questa soluzione 50x prima dell'uso.
2. Pesare 1 g di agarosio e scioglierlo in 100 ml di tampone 1x TAE, riscaldamento nel forno a microonde per 1-2 minuti. Indossare occhiali e dispositivi di protezione per evitare il contatto con agarosio bollente.
3. Raffreddare la soluzione verso il basso fino a circa 50 ° C, aggiungere 5 ml di etidio bromuro (attenzione: mutageno) e versarlo nel agarosio dell'apparato gel esecuzione. Inserire il pettine.
4. Attendere che si solidifica soluzione, versare tampone TAE sopra il gel e caricare i campioni (volume dipende dalle dimensioni pettine, in genere, viene caricata 10-20 ml di campione di DNA, mescolato con 6x tintura in esecuzione per visualizzare e facilitare carico).
5. Eseguire il gel finché il colorante migra circa 2/3 della lunghezza del gel (ad esempio, 45 min a 150 V). Visualizzare le bande di DNA sotto la luce UV.

Risultati

dGuo stato osservato per avere un tempo di ritenzione di 4,7 min, mentre 8-oxo-dGuo aveva un tempo di ritenzione di circa 6,4 min (Figura 2A e B). Vi è circa 1.000 volte differenza nelle altezze tra i due analiti, come si vede nella Figura 2C. Voltammograms per 8-oxo-dGuo e dGuo stati ottenuti per gli standard che funzionano a potenziale lavorativo nell'intervallo 0,2-1,1 V. Il potenziale di lavoro ottimale per 8-oxo-dGuo è risultata di +0,5 V e +0,9 V per dGuo

Discussione

Anche se a 8-oxo-dGuo 'stato segnalato come un utile biomarcatore di ossidazione del DNA, la sua quantificazione affidabile può rappresentare una sfida. Anche se esistono diversi metodi pubblicati, vi è la necessità di un approccio globale, panoramica descrittiva di protocollo per consentire ai ricercatori di implementare il metodo nei loro laboratori. Qui vi presentiamo una panoramica dettagliata di un protocollo basato su HPLC che permetterà ai nuovi utenti di stabilire un metodo efficace per il rilevamento a ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-oxo-dGuo standard	Cayman Chemical Company	89320	Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphatase	Sigma-Aldrich	P5931	From E. coli
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901	Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylate	Sigma-Aldrich	D9533
dGuo standard	Sigma-Aldrich	D7145
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9390
DNA from salmon sperm	Sigma-Aldrich	D1626	Sodium salt
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527	TypeII, from bovine pancreas
DNAzol	Invitrogen	10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E4884	The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K media	ATCC	30-2004
Foetal bovine serum	ATCC	30-2020
Guard column	Chromatographic Specialties	YBA 99S03 0204GC	Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Monobasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered saline	Invitrogen	15190-250
Phosphodiesterase I enzyme	Sigma-Aldrich	P3243	Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizer	Thomas Scientific	7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively	Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
Trypsin	Invitrogen	15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silica	Chromatographic Specialties	YBA 99S03 1546WT