JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وكثرة الدبيقيات استجابات الرئيسية لالتنكس العصبي المزمن. هنا، فإننا نقدم طرق لفي الجسم الحي، والتصور على المدى الطويل CX3CR1-GFP + الخلايا الدبقية الشبكية بواسطة تنظير العين متحد البؤر، وعتبة والمورفولوجية تحليل لتحديد وقياس تفعيلها. نحن نراقب التغيرات دبقية خلال المراحل المبكرة من الزرق المرتبطة بالتقدم في السن.

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة، وهي الخلايا neuroimmune CNS المقيمة، وتحويل التشكل وحجمها استجابة لأضرار CNS، والتحول إلى حالة تنشيط وظائف متميزة وملامح التعبير الجيني. أدوار تفعيل دبقية في مجالات الصحة والاصابة والمرض لا تزال غير مفهومة تماما بسبب التنظيم الديناميكي والمعقد في استجابة للتغيرات في المكروية بهم. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن مراقبة غير جراحية وتحليل التغيرات في تفعيل دبقية مع مرور الوقت في الكائن الحي سليمة. في الجسم الحي تأخرت الدراسات تفعيل دبقية التي كتبها القيود التقنية لتتبع سلوك دبقية دون تغيير البيئة CNS. وقد كان هذا تحديا من نوع خاص خلال التنكس العصبي المزمن، حيث يجب أن تعقب التغييرات على المدى الطويل. شبكية العين، وهو جهاز العصبي المركزي قابلة للتصوير العيش غير الغازية، ويوفر نظام قوي لتصور وتميز ديناميات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة خلال الاضطرابات المزمنة.

الحمار = "jove_content"> يعرض هذا البروتوكول الطرق على المدى الطويل، والتصوير في الجسم الحي من الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين، وذلك باستخدام تنظير العين متحد البؤر (cSLO) وCX3CR1 GFP الفئران / + المراسل، لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة لقرار الخلوية. أيضا، نحن تصف أساليب لقياس التغيرات الشهرية في تنشيط الخلايا وكثافة في مجموعات فرعية الخلايا الكبيرة (200-300 الخلايا في شبكية العين). نحن نؤكد استخدام منطقة somal كمقياس مفيدة لتتبع مباشر لتفعيل دبقية في شبكية العين من خلال تطبيق آلية تحليل المورفومترية القائم على عتبة في الجسم الحي الصور. نحن نستخدم هذه الحصول على الصور الحية ويحلل استراتيجيات لرصد التغيرات الديناميكية في تفعيل دبقية وكثرة الدبيقيات خلال المراحل المبكرة من التنكس العصبي في شبكية العين في نموذج الفأر من الزرق المزمن. وينبغي أن يكون هذا النهج مفيدا لمعرفة مدى مساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة إلى انخفاض العصبية ومحور عصبي في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي المزمنة التي تؤثر على شبكية العين والعصب البصري.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا neuroimmune الموجودة حصرا في الجهاز العصبي المركزي (CNS) منذ التطور الجنيني المبكرة وطوال فترة البلوغ. مجهزة ذخيرة معقدة من المستقبلات، وينظم النشاط دبقية وعدم التجانس الإقليمي من خلال تفاعلها ثنائي الاتجاه مع الخلايا العصبية المجاورة، الدبقية، حاجز الدم في الدماغ والخلايا التسلل neuroinflammatory 1،2. تساهم ظائف دبقية القاعدية لصيانة وإصلاح الفسيولوجية، كما عينة أراضيها لاضطرابات في التوازن 3،4. أثناء إصابة الجهاز العصبي المركزي أو المرض، والخلايا الدبقية الصغيرة هي أول المستجيبين للإشارات العصبية التي تؤدي ثم انتقالها إلى النمط الظاهري على رد الفعل، يسمى "تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة 2،5-7. تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ينطوي على دورة معقدة من الجينات والبروتينات التعبير، التي تقترن إلى سوما الخلية وعملية تغيير الحجم ويعيد 6-9. تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، فضلا عن إعادة توزيع الخلايا والمجموعات، يمكن رافق الزيادة الإجمالية المحلية في عدد الخلايا (كثرة الدبيقيات تسميته). هذا يمكن أن تنجم عن تكاثر الخلايا وتجديد الذات، مع أو بدون توظيف حيدات الدم المستمدة 3،4،7،10-14. في مجموعة واسعة من وأمراض الجهاز العصبي المركزي المزمنة التي تعتمد على العمر وأصيب كثرة الدبيقيات وتفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة مرض مواز التقدم 15-19. كيف أثر الدبقية الصغيرة التنكس العصبي لا تزال غير واضحة، وذلك أساسا لأنها تلعب الدورين اعصاب والضارة التي قد يكون لها مساهمات متنوعة لظهور المرض وتطور. وقد رصدت الدراسات التصويرية الحية تهدف إلى فهم مرض مزمن CNS السلوك دبقية في الجهاز العصبي المركزي المتضرر من النماذج الحيوانية والبشر، وأثبتت أن التعديلات دبقية هي بداية اكتشافها في مراحل المرض المبكرة 15-17،19،20. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لوضع نهج لكشف ورصد تفعيل دبقية في الجسم الحي.

DETE غير الغازيةتأسست ction التغيرات الإقليمية في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ باعتبارها مهمة في مؤشر الجسم الحي من تطور المرض الاعصاب، وذلك باستخدام التصوير الجزيئي أو تلألؤ بيولوجي وانبعاث البوزيترون التصوير المقطعي أو التصوير بالرنين المغناطيسي 18،21،22. هذه الطرق التصوير الجزيئي والنووي الكمية للغاية وغير الغازية كشف دباق لقرار الإقليمي. بدلا من ذلك، واثنين من الفوتون التصوير متحد البؤر في CX3CR1 GFP / + الفئران قد سمح مراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ لقرار الخلوية 3،4،9،20،23-28. ومع ذلك، فإن هذا النهج يحد على المدى الطويل والمراقبة المتكررة من التعديلات دبقية المزمنة، وبالنظر إلى المخاطر المحتملة للإزعاج سلوكهم حتى مينيملي الإجراءات تصوير الدماغ 29. بدلا من ذلك، الشبكية تقدم الظروف المثلى لمباشرة في الجسم الحي التصور ورصد المتكررة من الخلايا الدبقية الصغيرة في حياتهم سليمة المتخصصة CNS طوال الشيخوخة، بعد الإصابة الحادة، ويحتمل أن تكون خلال الأمراض العصبية المزمنة. وهكذا، فقد أثبتت الدراسات الحديثة جدوى عالية الدقة التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين معربا عن GFP من خلال تكييف تنظير العين مسح متحد البؤر الليزر (cSLO) إلى الصورة الحية CX3CR1 GFP / + الفئران. وقد استخدم هذا لتتبع التغيرات الأسبوعية في GFP + الخلايا الأرقام في الفئران الفردي لمدة تصل إلى 10 أسابيع بعد الإصابة التي يسببها ارتفاع ضغط الدم الحاد أو العين 30-36.

فإننا قمنا بمد هذا النهج لأداء التصوير على المدى الطويل على مدى عدة أشهر، والكمية تعقب التغييرات في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة استنادا إلى حجم سوما باستخدام تحليل المورفومترية. وقد عرفت حجم Somal كمقياس المفيد تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة في دراسات التصوير الحية باستخدام اثنين من الفوتون المجهري متحد البؤر في شرائح القشرية لأداء في مجال التصوير المجراة من CX3CR1-GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة 9. كما أظهرت هذه الدراسات وغيرها العلاقة بين حجم somal ومستويات البروتين Iba1 التعبير، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي يزيد أيضا مع تفعيل 9،37. وبالتالي، يمكن تحديد تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران الحية، ورصد أعدادها وتوزيعها على مر الزمن خلال CNS الصحة والمرض.

يصف هذا البروتوكول طرق cSLO الحصول على الصور الحية وتحليل لرصد أعداد الخلايا الدبقية، توزيع وتفعيل الصرفي أثناء الشبكية خلايا العقدة (RGC) انحطاط (الشكل 1). وبالتالي، تستخدم هذه الدراسة: 1) نموذج الفأر من الزرق ورثت (DBA / 2J) أن يخضع تعتمد على سن العصب البصري والشبكية والتنكس العصبي يظهر التباين الملحوظ في تطور المرض ما بين 5 و 10 شهرا من العمر 38،39، 2) شهريا cSLO في الجسم الحي التصوير لرؤية طويلة الأجل لGFP + الخلايا في شبكية العين والعصب البصري امياليني من متخالف Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أشهر، 3) تحليل التصوير الحي من قبل تجزئة والعتبة لعزل somata الخلية والتدبير المنطقة الأشعة تحت الحمراء. يتم تطبيق هذه الاستراتيجيات لتقييم حركية الشبكية دول تفعيل دبقية خلال المراحل المبكرة من الزرق المزمن.

Protocol

في الجسم الحي أن يتم التصوير في مرافق خالية من مسببات الأمراض باستخدام بروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ولاية يوتا.
ملاحظة: يتم استخدام هذا البروتوكول التصوير بالنسبة للفئران مراسل فيه الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين والتسلل حيدات / الضامة تعبر عن الأخضر الفلورسنت البروتين (GFP) تحت سيطرة موضع fractalkine مستقبلات (CX3CR1).

1. في فيفو تصوير الشبكية GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة التي متحد البؤر المسح بالليزر تنظير العين (cSLO)

  1. تشغيل نظام التدفئة التي تسيطر عليها الماء، سيؤدي إلى استقرار درجة حرارة الماوس بين 35-37 درجة مئوية خلال الإجراء، وربط اثنين من منصات التدفئة.
    1. بدء متحد البؤر منظار العين المسح بالليزر (cSLO) النظام (الشكل 2A). فتح البرنامج cSLO، أدخل المعلومات التي من شأنها تحديد الماوس الفردية ووضع انحناء القرنية من 2 ملم (القائمة بيانات المريض).
  2. الاستعداد لمعهد العالم العربيجينج. تناسب بشكل آمن على 55º واسعة المجال نظيفة عدسة الهدف على المقبس. إعداد منصة التصوير منظار العين من خلال تأمين وسادة التدفئة مغطاة ورقة نظيفة. استخدام لقطات للشد وسادة ورقة ومنعهم من عرقلة حركة العدسة الشيئية.
  3. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من 1.3٪ 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول و 0.8٪ ثالثي الأميل الكحول (250 ملغم / كغم من وزن الجسم؛ 0.5 مل / 25 غرام من وزن الجسم) باستخدام إبرة 30½ G المجهزة ل1 مل يمكن التخلص منها حقنة. عودة الماوس لقفصه، وأبقى على وسادة التدفئة.
    ملاحظة: تسليم المخدر عن طريق الحقن مقابل استنشاق يسمح المواقع أسهل من الماوس للتصوير والوصول دون عائق للعيون، وخالية من المخاريط الأنف والأنابيب.
  4. بمجرد أن يتوقف الحيوان المتحركة وغير مستجيب لقرصة الذيل، لحث اتساع حدقة العين مع تروبيكاميد وفينيليفرين (0.5٪ لكل منهما)، عن طريق وضع الحيوان عرضة وتغطي كلتا العينين مع قطرات لمدة 7 دقائق.
  5. بعد 5 دقائق، صالدانتيل الماوس عرضة على مركز للمنصة منظار العين، وعدسات لاصقة تناسب أكثر من كلتا العينين، وتطبيق الحد الأدنى من الضغط.
    ملاحظة: العدسات اللاصقة هي صغيرة وهشة ولكن يمكن التعامل معها بعناية مع الأصابع، على الرغم من ملقط يمكن استخدامها بدلا من 40. استخدام العدسات اللاصقة هو اختياري، ولكن على النحو الموصى به ان يقلل من جفاف العين، ويحافظ على شفافية القرنية أثناء التصوير.
  6. بعد 7 دقائق، توجيه الماوس مع العين اليمنى التي تواجه عدسة موضوعية وبالتوازي المدار إلى العدسة الشيئية، والحفاظ على الحيوانات غير المقيد بالقرب من حافة المنصة (الشكل 2B). لجمع الصور من التشبع للمقارنة والتوجه، والحفاظ باستمرار المسافة من العين إلى العدسة الشيئية، وكذلك المواءمة بين العين إلى مسار الضوء طوال جلسات التصوير. مقطع شعيرات طويلة التدخل في مراقبة العين.
    ملاحظة: للحصول على 8-10 دقيقة المقبل، والماوس لا يتحرك أو طرفة، وسوف التنفس مع الحركة لطيفالإدلاء بالبيانات التي تتبعها cSLO العين تتبع ART (التلقائي في الوقت الحقيقي) واسطة، الذي يعدل الموقف مسح الرأس على أساس معالم قاع مع التباين العالي. الماضي ذلك الوقت، الفئران تبدأ يلهث وامض، مما يجعل من التصوير غير عملي.
  7. إذا تم إجراء التصوير بدون استخدام العدسات اللاصقة، وتطبيق برنامج تلفزيوني قطرات لكلتا العينين كل 2-3 دقيقة لمنعهم من الجفاف.
  8. جمع الصورة قاع الأوعية الدموية في شبكية العين والقرص البصري، وتركز على شبكية العين الداخلية.
    1. تحديد وضع الأشعة تحت الحمراء (IR) وضبط الإعدادات إلى 820 نانومتر الإثارة، 100٪ طاقة الليزر، 40-60٪ الحساسية (الشكل 2C).
    2. العمل في وضع عالية السرعة (12.6 إطار / ثانية)، حدد موقع العين باستخدام عصا التحكم لدفع منظار العين. في التكبير المنخفض، وفحص القرنية والعدسة لإصابة أو التعتيم، واستبعاد من وجهة نظر الدراسة يعانون من عيوب أو الإصابة التي من شأنها أن تؤثر على تصوير شبكية العين (الشكل 3A).
    3. حدد منطقة القرص البصري (سطحرأس العصب البصري، ONH) بإحراز الهدف أقرب إلى العين، ثم تركز الصورة على أنها وقفل هذا الموقف من قبل الشد على عصا التحكم. هذا التوافق من العين إلى منظار العين هي مفتاح الحصول حتى التركيز والانبعاثات عبر الصورة.
    4. تصور الطائرات الداخلية للشبكية، وكذلك ONH، وذلك باستخدام الأوعية الدموية الرئيسية تقع على سطح vitreal من شبكية العين حيث طائرة مرجعية محورية (59 و 60 D)، أو أعمق (55 D) في عيون تظهر البصرية المحفورة أقراص. يجب التركيز الأمثل لحل خلايا الدم داخل الأوعية الدموية الرئيسية، والتجويف والجدران مميزة بشكل واضح.
    5. تحسين صورة الإشباع عن طريق ضبط الطلب على لوحة التحكم التي تعمل باللمس، حتى هالة بيضاء من الإضاءة موحدة تمتد في أكثر من مجال 55º قاع حول القرص البصري (باستخدام التعرض المفرط طفيف). المقبل، وانخفاض تشبع لتحسين النقيض من ذلك حتى خلايا الدم تتحرك على طول الأوعية الكبرى يمكن حلها بشكل واضح. إذا الظلام البؤريولا تزال المناطق، وليس بسبب تلف في شبكية العين، إعادة تنظيم العين إلى الكاميرا حتى يتم الحصول على صورة بهيجة. هذا التعديل هو أمر أساسي للقبض على مجموعات قابلة للتكرار الصور في موقف والجودة.
    6. جمع صورة الأشعة تحت الحمراء عالية الدقة من الشبكية المركزية (1،4-1،7 مم في القطر، اعتمادا على العمر)، حيث بلغ متوسطها 30 لقطة في الوقت الحقيقي (4.7 لقطة / ثانية؛ تطبيع)، لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء (الشكل 2D ).
  9. على الفور، والحصول على صورة مضان من GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة و / أو التسلل حيدات مترجمة إلى الطائرات الداخلية للشبكية وONH.
    ملاحظة: الأمثل للصورة قاع IR الشبكية يحدد دقة الصورة مضان من الخلايا GFP +، فضلا عن مدى شبكية العين الداخلية امتدت. الفشل في التركيز الطائرات الداخلية للشبكية، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة قرار ضعف الأوعية الدموية، ويؤدي في GFP + خلية وجهات النظر باهتة (الشكل 3B). الفشل في ضبط IR نجمة واحدةالتموينية بشكل صحيح ومنتظم يؤثر على صورة مضان (FA)، وإدخال تغيرات مصطنعة في GFP + كثافة الخلايا وحجم (الشكل 3C).
    1. Swich إلى مضان وضع التصوير (FA) في لوحة الشاشة التي تعمل باللمس، وذلك باستخدام اللون الأزرق، 488 نانومتر الإثارة ليزر (460-490 نانومتر مرشح حاجز مجموعة)، وضبط حيازة (100٪ طاقة الليزر و100-125٪ حساسية)، والتي حافظت ثابت لجميع الفئران (الشكل 2E).
    2. جمع س ص نقطة واحدة، صورة مضان bidimensional من شبكية العين، والتقاط صورة قاع فورا في موقف مماثل (100X المتوسط ​​المسح؛ 55º زاوية المسح الضوئي لكلا الصور، الشكل 2F).
    3. التقاط صورة متعددة عن طريق اختيار "المركب" في لوحة التحكم (الشكل 2G) وتحريك الحق منظار العين واليسار، بالغسل الشبكية عبر المحور الزمني الأنف (الشكل 2H).
      ملاحظة: بعد مسح صورة س ص نقطة واحدة (100X الصورةيمكن المتوسط)، والبرنامج تلقائيا بمسح متوسطات جديدة من نفس المناطق والجديدة (مقيدة مع دائرة خضراء أثناء الفحص الأمثل، أو أحمر عند الفحص غير عملي)، وغرز جميع المناصب XY-في الوقت الحقيقي. الصورة المركبة الناتجة تمتد 1،5-1،7 مم على المحور السيني الأفقي 3-4 ملم في المحور الرأسي (55º س 120-124º زاوية المسح الضوئي).
  10. التصوير الكامل من كل فأر خلال 15 دقيقة بعد تحريض التخدير، وقبل وامض وإعادة تشغيل الحركة.
  11. إزالة العدسات اللاصقة والعيون هيدرات مع برنامج تلفزيوني والعودة الحيوان إلى قفصه حرارة، والتحقق من السلوك حتى الشفاء التام من الحركة.
  12. للدراسات طولية باستخدام جلسات cSLO التصوير متقطعة في نفس الماوس الفردية، كرر التصوير لا تقل عن 3 أيام على حدة لتجنب السمية التراكمية للتخدير، وكذلك تهيج القرنية.

2. لايف معالجة الصور وتحليل

  1. متتابعة صورة المحاذاة:
    1. محاذاةالصور قاع لسلسلة زمنية من نفس العين باستخدام الأوعية الدموية والقرص البصري كما المعالم. فتح جميع الصور في برنامج عرض الشرائح العرض التجاري، عن طريق سحب كل صورة على مدى السابقة واحد حتى محاذاة الأقراص البصرية الخاصة بهم على متن الطائرة xy- (تظهر الصورة العليا شبه شفافة في حين أن تنجر)، ثم تناوب على صورة أعلى حتى ل الأوعية الدموية الرئيسية تتداخل مع الأوعية الدموية في الصورة أدناه (التركيز على سفن أبعد من القرص البصري). تسجيل زاوية دوران لكل صورة وحفظ هذه السلسلة من الوقت للرجوع إليها في المستقبل، تتبع الماوس والعين الهوية.
    2. محاذاة سلسلة المقابلة من واحد الصور مضان XY نقطة من خلال تطبيق زاوية المسجلة لتصحيح دوران س ص في كل نقطة زمنية، وذلك باستخدام خطوط المسح برنامج محرر الرسوم البيانية. بالإضافة إلى ذلك، ضبط دقة 300 نقطة في البوصة (بدون إعادة قياس) والخلفية (في وضع RGB، حدد المستويات وأخذ عينات من التجويف في أحد الاوعية الدموية كما أسود). حفظ هذه الصوركملفات TIF، مضيفا "الانحياز" لأسمائهم.
  2. دبقية تجزئة الخلية:
    1. لتحديد GFP + الخلايا في شبكية العين المركزية، وفتح في FluoRender على "الانحياز" ملف TIF المقابلة لأقرب نقطة زمنية / العمر. تكبير الصورة لتناسب الشاشة، ثم تحديد وجهة التقديم (مركب، متعامد، محرف) وخصائصه (0.58 جاما، 255 نقطة التشبع، 255 الإنارة، 195 ألفا و 1.00 التظليل)، واختيار كل من قنوات RG كما مرئية (إخفاء قناة B بها في إطار مساحة النقر المزدوج، الشكل 4A).
    2. لتحديد الخلايا الفردية، عتبة القناة الحمراء (يجب أن يتم تسليط الضوء على الإطار مساحة عمل)، من خلال زيادة عتبة منخفضة حتى يتم حجب معظم الخلايا (أبيض) مع الحد الأدنى من عمليات التداخل والخلية (السماوي)، مع الحفاظ على عتبة عالية ثابت (255). قيمة عتبة منخفضة تتراوح ما بين 100 و 170، اعتمادا على كثافة مضان (الشكل 4B </ قوي>).
    3. حفظ هذا الرأي مع القناة الحمراء مرئية فقط (القيادة التقاط) كملف TIF الجديد، مضيفا "cellsegm" إلى اسمه الأصلي (الشكل 4C). باستخدام خطوط المسح عام محرر الرسوم البيانية البرمجيات، عكس اللون الرمادي، وضبط دقة 300 نقطة في البوصة على النحو الوارد أعلاه، وحفظ مرة أخرى كما RGB (الشكل 4D).
      ملاحظة: حذف المجلدات (المشاريع) التي تم إنشاؤها تلقائيا من قبل FluoRender، وحفظ عتبة تطبيقها لتكون مرجعا في المستقبل.
  3. دبقية تجزئة سوما وقياس الأشكال:
    1. لتحديد GFP + somata خلية لتقدير مساحة، استخدم صورة برامج التحليل مع القياسات الآلي كثافة وقدرات عتبة، وكذلك القائم على عتبة العد الكائن والقياس. فتح "cellsegm" ملف TIF، وحدد طريقة إعادة قياس (سين) والقناة الحمراء (انقر علامة التبويب الأحمر في RGB). تحسين التصور من خلال إلغاء "قناة الرأي في لون" (بزر الماوس الأيمن فوق RG الأحمرعلامة التبويب B)، واختيار "تكمل الألوان" (صورة / ضبط صورة) لعكس اللون الرمادي ورؤية الخلايا في رمادي / أسود على خلفية بيضاء (الشكل 4E).
    2. معايرة الصورة ل1،4-1،7 مم تبعا للعمر، عن طريق رسم خط أفقي عبر كامل الصورة (المعايرة، معايرة السريع).
    3. الجزء somata خلية فردية من خلال تطبيق العتبة كثافة (الشكل 4B). لهذا، والعمل على قناة RGB الأحمر وفتح وظيفة عتبة كثافة (وجوه عدد، واختيار "تحديث العد" الأوامر) من أجل تتبع المعلمات bidimensional لكل منطقة thresholded الفائدة (ROI) تمثل somata الفردية.
    4. تحديد عتبة كثافة في الرسم البياني كثافة، من خلال تحديد أدنى 50-60٪ من مستويات 255، وصقل قيمة العتبة النهائية من خلال تقييم بصريا التداخل بين قناع اللون العتبة (الأزرق) ومحيط سوما الخلية (الرمادي) في الخلايا الفردية (Figure 4E).
    5. تقدير دقة الأقنعة سوما الخلية لتمثيل أبعاد somal عن طريق قياس المنطقة قبل وبعد تجزئة في 10 الخلايا، واستعرض مجموعة عتبة محددة إذا كانت القياسات تختلف أقل من 10٪ (استخدم شريط ثنائي والمقاييس المفصل).
    6. تحديد رويس somal التي تشمل عدة خلايا وفصل هذه العناصر (أو القضاء رويس منفصلة باستخدام عناصر التحكم ثنائي شريط الأدوات، أو الكتالوج كائن)، في حين تبديل على / قبالة ثنائي لتصور بشكل مباشر على الخلايا (الشكل 4F) يدويا.
    7. تصنيف الخلايا الدبقية كما رويس مع المناطق somal أكبر وأصغر من 50-60 ميكرون 2 للتمييز somata الخلية المقابلة لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية الصغيرة بتعطيل على التوالي، وذلك باستخدام المساحة تقييد.
      ملاحظة: يتم تعريف كل somal خلية فرعية مع مختلف طبقة ثنائية pseudocolored، ويمكن وصفها كذلك لمعلمات الشكلية الأخرى (perimeثالثا، دائرية، وما إلى ذلك)، وكذلك كميا داخل القطاعات الشبكية المنفصلة (الشكل 4G). حفظ الصورة تحليلها كملف ND2.
    8. تحقق من العملية والمتفرعة التعقيد في خلايا دبيقي تنشيط الفردية، التي تتراكب مع قناع somal وس ص واحد صورة -point (زيادة المقابل 50٪، الشكل 4H). العد يدويا العمليات تمتد مباشرة من سوما الخلية أو قياس قطر المضلع يشمل الشجرة (استخدم شريط ثنائي والمقاييس المفصل).
      ملاحظة: المنشط الخلايا تفتقر العمليات أو تتحمل قليلة (<4) وباختصار (<2X somal قطر) منها، وعلى النقيض من العمليات غير المفعلة الخلية، والتي تتكون من الشجرة المتشعبة والواسعة (> 3-10x somal قطر) المحيطة بها نسبيا سوما صغير.
    9. تحديد الخلايا يدويا مع somata أصغر من <20 ميكرون 2 و / أو GFP التعبير دون حد الكشف، والتي بالتالي لم يتم كشفها من قبل فيتوتر العتبة. استخدام الأمر للتصنيف في شروح لحساب العناصر المحددة يدويا.

النتائج

استخدمت لدينا مؤخرا في الدراسات المجراة هذه الحصول على الصور وتحليل أساليب العيش لتصور وتتبع حركية وأنماط ONH والتغيرات دبقية صغيرة في شبكية العين خلال المراحل المبكرة من الزرق المزمن وعلاقتها أواخر التنكس العصبي 59. نحن هنا توضيح cSLO بروتوكول الحصول ع?...

Discussion

رصد حي لعدد الخلايا دبقية وتفعيل الصرفي أثناء مرض الاعصاب يتطلب استخدام أساليب التصوير غير الغازية التي تسمح التصور التفصيلي من الميزات الخلية. بعد التصوير، والخلايا الدبقية يجب أن تكون معزولة (مجزأة) للتحليل المظهرية عن طريق استخدام الخطوات عتبة متعددة لتقييم حجم ...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ miceThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 and 00582Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringeBD, East Rutherford, NJ305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tabletsSigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 and P4417Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/PumpGaymar Industries, Orchard Park, NYTP-650
Cotton-tipped applicatorsFisher Scientific, Pittsburgh, PA23-400-100
Tropicamide 1%Bausch & Lomb, Rochester, NYNDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick centerCantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UKG003709Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer softwareHeidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CAVersion 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Redmond, WAVersion 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, San Jose, CAVersion CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, University of UtahVersion 2.13Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Melville, NYVersion 4.30.01

References

  1. Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. . Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  7. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57 (6), 563-581 (1999).
  8. Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763 (2012).
  9. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
  10. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  11. Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
  12. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  13. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  14. Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  16. Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
  17. Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
  18. Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1393-1415 (2012).
  19. Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
  20. Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
  21. Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
  22. Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61 (1), 10-23 (2013).
  23. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
  24. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910 (2011).
  25. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
  26. Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
  27. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
  28. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  29. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
  30. Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
  31. Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
  32. Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
  33. Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
  34. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  35. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
  36. Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
  37. Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
  38. Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
  39. Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
  40. Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
  41. Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
  42. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  43. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
  44. Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
  45. Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
  46. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  47. Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
  48. Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
  49. Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
  50. Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
  51. Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
  52. Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
  53. Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
  54. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
  55. Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
  56. Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
  57. Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
  58. Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
  59. Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

99 CX3CR1 DBA 2J

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved