JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפעלת המיקרוגלים וmicrogliosis הן תגובות מפתח לניוון של מערכת עצבים כרוניות. כאן, אנו מציגים שיטות לin vivo, הדמיה לטווח הארוך של תאים ברשתית microglial CX3CR1-GFP + על ידי ophthalmoscopy confocal, ולסף וmorphometric מנתח לזהות ולכמת ההפעלה שלהם. אנו עוקבים אחר שינויי microglial בגלאוקומה הקשורות לגיל שלבים מוקדמים.

Abstract

מיקרוגלים, שהם תאים במערכת העצבים המרכזית neuroimmune-תושב, להפוך המורפולוגיה והגודל שלהם בתגובה לנזק במערכת העצבים המרכזית, מעבר למצב מופעל עם פונקציות שונות ופרופילי ביטוי גנים. התפקידים של הפעלת microglial בבריאות, פציעה ומחלה נשארים הבינו באופן חלקי בשל הרגולציה הדינמית והמורכבת שלהם בתגובה לשינויים במייקרו-הסביבה שלהם. לכן, זה הוא קריטי לצג הלא פולשני ולנתח שינויים בהפעלת microglial לאורך זמן באורגניזם שלם. במחקרי vivo של הפעלת microglial עוכבו על ידי מגבלות טכניות להתנהגות microglial מעקב מבלי לשנות את הסביבה במערכת העצבים המרכזית. זה היה מאתגר במיוחד בניוון מוחיה כרוני, שבו שינויים לטווח ארוך חייבים להיות במעקב. הרשתית, איבר של מערכת העצבים המרכזית ניתנים להדמית חיה לא פולשנית, מציעה מערכת חזקה לדמיין ולאפיין את הדינמיקה של הפעלת מיקרוגליה בהפרעות כרוניות.

התחת = "jove_content"> פרוטוקול זה מתאר שיטות לטווח ארוך הדמיה, in vivo של מיקרוגליה רשתית, באמצעות ophthalmoscopy confocal (cSLO) ועכברים / + כתב CX3CR1 GFP, לדמיין microglia עם רזולוציה סלולרית. כמו כן, אנו מתארים שיטות לכמת את השינויים חודשיים בהפעלת תא וצפיפות בתת תא גדול (200-300 תאים לכל רשתית). אנו מאשרים את השימוש בשטח somal כמדד שימושי למעקב חי של הפעלת microglial ברשתית על ידי יישום ניתוח morphometric מבוסס סף אוטומטי של תמונות בvivo. אנו משתמשים ברכישת תמונה בשידור חי אלה ומנתח את אסטרטגיות לעקוב אחר השינויים הדינמיים בהפעלה וmicrogliosis microglial במהלך שלבים המוקדמים של ניוון של מערכת עצבי רשתית במודל עכבר של גלאוקומה כרונית. גישה זו צריכה להיות שימושית כדי לחקור את תרומתם של מיקרוגליה לירידה עצבית והפרעות במערכת העצבים המרכזית בaxonal כרוניות המשפיעות על הרשתית ועצב ראייה.

Introduction

Microglia הם תאי neuroimmune שבאופן בלעדי מתגוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS) מאז התפתחות עוברית המוקדמת וברחבי בגרות. מצויד ברפרטואר מורכב של קולטנים, פעילות microglial וההטרוגניות אזורית מוסדרות על ידי יחסי הגומלין שלהם עם תאי עצב דו-כיווניים שכנים, גליה, מחסום דם-מוח וחדירת תאי neuroinflammatory 1,2. פונקציות microglial בסיסיות תורמות לתחזוקה ותיקון פיסיולוגיים, כפי שהם לטעום את הטריטוריה שלהם להפרעות ב3,4 הומאוסטזיס. במהלך פציעה במערכת העצבים המרכזית או מחלה, מיקרוגלים הם המגיבים הראשונים לאותות עצביים שלאחר מכן יפעילו את המעבר שלהם לפנוטיפ תגובה, המכונה "מופעל מיקרוגלים 2,5-7. הפעלת Microglia כרוכה מחזור מורכב של גנים והחלבונים ביטוי, שהם מצמידים לסומה תא ושינוי גודל תהליך שיפוץ 6-9. הפעלת מיקרוגלים, כמו גם חלוקה מחדש תא ואשכולות, יכולים להיות מלווה העלייה הכוללת המקומית במספר התאים (microgliosis מכונה). זה יכול להיגרם כתוצאה מהתפשטות תאים והתחדשות עצמית, עם או בלי גיוס של מונוציטים דם נגזרות 3,4,7,10-14. במגוון רחב של מחלות של מערכת העצבים המרכזית כרוניות תלוי גיל, ספג microgliosis ומחלה מקבילה הפעלת מיקרוגלי התקדמות 15-19. איך מיקרוגלי ניוון מוחיים השפעה עדיין לא ברור, בעיקר בגלל שהם משחקים שני תפקידי neuroprotective ומזיקים שעשויות להיות תרומה מגוונת להופעת מחלה והתקדמות. מחקרי הדמיה חיה להבנת מחלה של מערכת העצבים המרכזית כרונית במעקב התנהגות microglial במערכת העצבים המרכזית הפגומה של מודלים של בעלי חיים ובני אדם, והראו כי שינויי microglial מתחילים להבחין בשלבים המוקדמים של מחלה 15-17,19,20. לפיכך, חשוב לפתח גישות כדי לזהות ולעקוב אחר הפעלת microglial in vivo.

Dete לא פולשניסיפורת של שינויים אזוריים בהפעלת מיקרוגלי המוח הוקמה כחשוב במחוון vivo של התקדמות מחלה ניוונית של מערכת עצבים, באמצעות הדמיה מולקולרית או טומוגרפיה פליטת אור ופליטת פוזיטרונים או הדמיה בתהודה מגנטית 18,21,22. שיטות הדמיה מולקולרית וגרעינית כמותי מאוד ולא פולשני אלה לזהות דבקים עם רזולוציה אזורית. לחלופין, ההדמיה confocal שני פוטונים בCX3CR1 GFP / + עכברים אפשרה התצפית של מיקרוגליה מוח עם רזולוציה סלולרית 3,4,9,20,23-28. עם זאת, גישה זו מגבילה לטווח ארוך ותצפית חוזרת ונשנית של שינויי microglial כרוניים, בהתחשב בסיכון הפוטנציאלי של הפרעת ההתנהגות שלהם על ידי נהלי הדמיה מוחית אפילו פולשנית 29. לחלופין, הרשתית מציעה תנאים אופטימליים לישירים, בהדמית vivo וניטור חוזר ונשנה של מיקרוגליה בנישה של מערכת העצבים המרכזית בשלמותם לאורך הזדקנות, בעקבות פציעה אקוטית, ופוטנציאל במחלות ניווניות כרוניות. כך, מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו את הכדאיות של הדמיה ברזולוציה הגבוהה של מיקרוגליה רשתית להביע GFP ידי התאמת ophthalmoscopy סריקת confocal הלייזר (cSLO) לתמונה החי CX3CR1 GFP / + עכברים. זה נעשה שימוש כדי לעקוב אחר שינויים שבועיים במספרי GFP + תא בעכברים בודדים לתקופה של עד 10 שבועות בעקבות פציעה נגרמה בחריפות או לחץ תוך עיני מוגבר 30-36.

הרחבנו גישה זו כדי לבצע הדמיה לטווח ארוך על פני כמה חודשים, וכמותית לעקוב אחר שינויים בהפעלת מיקרוגליה מבוססים על גודל סומה באמצעות ניתוח morphometric. גודל Somal הוגדר כמדד שימושי של הפעלת מיקרוגליה במחקרי הדמיה חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal שני פוטונים בפרוסות בקליפת המוח לבצע בהדמיה vivo של CX3CR1-GFP + מיקרוגלים 9. מחקרים אלה ואחרים הפגינו גם המתאם בין גודל somal והרמות של ביטוי חלבון Iba1, ש"שich גם עולה עם הפעלה 9,37. לפיכך, מיקרוגלים מופעלים יכולים להיות מזוהים בעכברים חיים, והמספרים והפצתם במעקב לאורך זמן בבריאות מערכת העצבים המרכזית ומחלות.

פרוטוקול זה מתאר שיטות לרכישת cSLO חי תמונה וניתוח לעקוב אחר מספרים סלולריים microglial, הפצה והפעלה מורפולוגיים בניוון רשתית תא גנגליון (RGC) (איור 1). כך, מחקר זה משתמש ב: 1) מודל עכבר של גלאוקומה בירושה (DBA / י 2) שעוברת עצב ראייה תלוי גיל וניוון של מערכת עצבים ורשתית תערוכות שונות מדהים בהתקדמות מחלה בין 5 ל 10 חודשים של גיל 38,39, 2) חודשי cSLO in vivo הדמיה להדמיה לטווח ארוך של ה- GFP + תאים ברשתית ועצב הראייה unmyelinated של ה- GFP / + DBA / י 2 עכברים הטרוזיגוטיים Cx3cr1 בגילי 3-5 חודשים, 3) ניתוח הדמיה לחיות בפילוח וthresholding לבודד תאי סומא ומידהאזור IR. אסטרטגיות אלו מיושמות על מנת להעריך את קינטיקה של מדינות הפעלת microglial רשתית בגלאוקומה כרונית בשלבים מוקדמים.

Protocol

In vivo הדמיה מתבצעת במתקני הפתוגן ללא שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת יוטה.
הערה: פרוטוקול הדמיה זו משמש לעכברי כתב בי מיקרוגלי רשתית ומונוציטים / מקרופאגים שחדר לבטא חלבון ירוק-ניאון (GFP) תחת שליטתו של מוקד קולט fractalkine (CX3CR1).

1. in vivo ההדמיה של רשתית GFP + Microglia ידי Confocal סריקת הלייזר Ophthalmoscopy (cSLO)

  1. הפעל את מערכת החימום מבוקר מים, שנקבעה לייצוב טמפרטורת עכבר בין 35-37 המעלות צלזיוס במהלך הליך, ולחבר את שתי כריות חימום.
    1. להפעיל את מערכת האופתלמוסקופ לייזר סריקת confocal (cSLO) (איור 2 א). פתח את תכנית cSLO, הזן את המידע שיזהה את העכבר הבודד ולהגדיר עקמומיות קרנית של 2 מ"מ (תפריט נתונים מטופל).
  2. היכונו להר"יגינג. מאובטח להתאים עדשה נקייה 55º רחב בתחום מטרה בשקעה. הכן את פלטפורמת ההדמיה האופתלמוסקופ ידי הבטחת כרית חימום מכוסה בנייר נקי. השתמש קליפים לשטח הכרית ונייר ולשמור אותם מחסימת התנועה של העדשה האובייקטיבית.
  3. להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneal של 1.3% 2,2,2-tribromoethanol ושל 0.8% אלכוהול טרט-אמיל (250 מ"ג / קילוגרם משקל גוף; 0.5 מיליליטר / 25 גרם משקל גוף) באמצעות מצויד 1 מיליליטר חד פעמי מחט 30½ G מזרק. חזור עכבר לכלוב שלה, שמרה על כרית חימום.
    הערה: המשלוח של חומר ההרדמה בזריקה לעומת שאיפה מאפשרת מיקום קל של העכבר להדמיה וגישה בלא הפרעה לעיניים, ללא קונוסים האף וצינורות.
  4. ברגע שהחיה מפסיקה לנוע ואינה מגיב לקמצוץ זנב, לגרום להרחבת אישון עם Tropicamide וphenylephrine (0.5% כל אחד), על ידי הצבת בעלי החיים נוטה ומכסים את שני העיניים עם הטיפות ל7 דקות.
  5. לאחר 5 דקות, עמ 'התחרה העכבר נוטה במרכז פלטפורמת האופתלמוסקופ, ועדשות מגע בכושר על שני העיניים, הפעלת לחץ מינימאלי.
    הערה: עדשות מגע הם קטנות ושברירית אבל יכולות להיות מטופל בזהירות עם אצבעות, אם כי ניתן להשתמש במלקחיים במקום 40. השימוש בעדשות מגע הוא אופציונלית, אך מומלץ כפי שממזער יובש בעיניים ושומר שקיפות קרנית במהלך הדמיה.
  6. לאחר 7 דקות, כוון את העכבר עם עין ימין מול העדשה האובייקטיבית ומקביל למסלול לעדשה האובייקטיבית, שמירה על בעלי החיים נטולי רסן ליד קצה הרציף (איור 2). לאסוף תמונות של הרוויה וכיוון דומים, לשמור כל הזמן את המרחק מהעין לעדשה אובייקטיבית, כמו גם היישור של העין לנתיב האור בכל מפגשי הדמיה. קליפ שפם ארוך מפריע להתבוננות בעין.
    הערה: לדקות 8-10 הבאות, העכבר לא יזוז או מצמוץ, ויהיה נשימה עם מהלך עדיןמפעלים, אשר מתעד את cSLO עין מעקב ART המצב (בזמן אמת אוטומטי), שמתאים את עמדת ראש הסריקה מבוססת על ציוני דרך קרקעית עם ניגודיות גבוהה. האחרון שזמן, עכברים מתחילים מתנשפים ומהבהבים, מה שהופך את ההדמיה מעשית.
  7. אם ההדמיה מתבצעת ללא שימוש בעדשות מגע, להחיל PBS הטיפות לשתי העיניים כל דקות 2-3 כדי למנוע מהם הייבוש.
  8. אסוף תמונת קרקעית של כלי הדם ברשתית ודיסק אופטי, המתמקד ברשתית הפנימית.
    1. בחר את מצב אינפרא אדום (IR) ולהתאים את הגדרות לעירור 820 ננומטר, 100% כוח לייזר, רגישות 40-60% (איור 2 ג).
    2. עובד במצב במהירות גבוהה (12.6 מסגרת / sec), לאתר את העין באמצעות ג'ויסטיק לנהוג האופתלמוסקופ. בהגדלה נמוכה, לבדוק את הקרנית ועדשה לפציעה או אטימות, ולהוציא מעיני המחקר עם מומים או פגיעה שישפיעו הדמיה הרשתית (איור 3 א).
    3. אתר את אזור הדיסק האופטי (פני השטח שלראש עצב הראייה, ONH) על ידי הבאת המטרה קרובה יותר לעין, אז למרכז את התמונה עליה ולנעול עמדה זו על ידי הברגת ג'ויסטיק. יישור זה של העין להאופתלמוסקופ הוא מפתח להשגה גם להתמקד ופליטה על פני התמונה.
    4. דמיינו את המטוסים הפנימיים של הרשתית, כמו גם ONH, באמצעות כלי דם הגדולים הממוקמים על פני השטח vitreal של הרשתית כמטוס התייחסות מוקדי (59 ו -60 D), או עמוק יותר (55 ד ') בעיניים מראים אופטי נחפר דיסקים. המוקד האופטימלי צריך לפתור תאי דם בתוך כלי דם גדולים, עם לומם וקירות בבירור שונה.
    5. לייעל הרוויה תמונה על ידי התאמת החיוג בלוח הבקרה של מסך מגע, עד הילה לבנה של תאורה אחידה משתרעת ברוב של שדה 55º קרקעית סביב הדיסק האופטי (באמצעות חשיפת יתר קלה). בשלב הבא, להפחית את הרוויה כדי לייעל ניגוד עד תאי דם נעו לאורך כלי הגדולים יכולים להיות ברור נפתר. אם אפל מוקדאזורים להתמיד, לא בשל פגיעה ברשתית, ליישר מחדש את העין למצלמה עד תמונה אחידה בהירה מתקבלת. התאמה זו היא יסוד כדי ללכוד סטים לשחזור של תמונות במצב ואיכות.
    6. אסוף תמונת IR ברזולוציה גבוהה של הרשתית המרכזית (1.4-1.7 מ"מ קוטר, בהתאם לגיל), עם ממוצע של 30 מסגרות בזמן אמת (4.7 מסגרות / שנייה; מנורמל), כדי לשפר את יחס אות לרעש (איור 2 ).
  9. מייד, לרכוש תמונת הקרינה של ה- GFP + מיקרוגלים ו / או מונוציטים חדירה מקומיים למטוסים הפנימיים של הרשתית וONH.
    הערה: אופטימיזציה של תמונת קרקעית IR של הרשתית קובעת את הרזולוציה של תמונת הקרינה של תאי GFP +, כמו גם את היקף הרשתית פנימית הקיף. הכישלון להתמקד המטוסים הפנימיים של הרשתית, אשר יכול להיות מזוהות על ידי רזולוציה נמוכה של כלי הדם, יגרום לנוף המעומעם GFP + תאים (איור 3). כישלון להתאים IR סאטומנה בצורה נכונה ואחיד משפיעה על תמונת הקרינה (FA), מציגה וריאציות artifactual בGFP + עוצמת תא וגודל (איור 3 ג).
    1. Swich לקרינת מצב הדמיה (FA) בפנל מסך המגע, באמצעות עירור כחול, 488 ננומטר לייזר (מערכת סינון מחסום 460-490 ננומטר), והגדרות רכישה (100% רגישות כוח הלייזר ו100-125%), אשר נשמרים קבוע לכל העכברים (איור 2E).
    2. לאסוף XY-נקודה אחת, תמונת הקרינה bidimensional של הרשתית, וללכוד תמונת קרקעית מייד בעמדה זהה (100x ממוצע סריקה; 55º זווית סריקה עבור שני התמונות; איור 2F).
    3. ללכוד תמונה מרובות על ידי הבחירה "מורכב" בלוח הבקרה (איור 2G) ונע ימינה האופתלמוסקופ ועזב, צילום פנורמי הרשתית על פני ציר האף-זמני (איור 2H).
      הערה: לאחר סריקת תמונת XY-נקודה אחת (100x שליכול בממוצע), התוכנה באופן אוטומטי ממוצעי סריקות חדשות מאותו והאזורים החדשים (מוגבלים עם עיגול ירוק במהלך סריקה אופטימלית, או בצבע אדום כאשר הסריקה היא ישימה), ותפרים כל XY-העמדות בזמן אמת. התמונה המורכבת וכתוצאה משתרעת 1.5-1.7 מ"מ על ציר x 3-4 מ"מ האופקי בציר האנכי (55º x 120-124º זווית סריקה).
  10. הדמיה מלאה של כל עכבר תוך 15 דקות לאחר גרימת הרדמה, לפני מהבהב והפעלה מחדש של תנועה.
  11. הסר עדשות מגע, עיני מימה עם PBS ולהחזיר את החיה לכלוב שלה חימם, בדיקת התנהגות עד להחלמה מלאה של תנועתיות.
  12. למחקרים ארוכי טווח באמצעות מפגשי cSLO הדמיה לסירוגין באותו העכבר בודד, לחזור על הדמיה לא פחות מזה מזה 3 ימים, כדי למנוע את הרעילות המצטברת של הרדמה, כמו גם לגירוי של קרנית.

2. עיבוד תמונה חי וניתוח

  1. יישור תמונה רציף:
    1. יישרתמונות הקרקעית לסדרת זמן של אותו עין באמצעות כלי הדם ודיסק אופטי כציוני דרך. פתח את כל התמונות במצגת תכנית מצגת שקופיות מסחריות, על ידי גרירה כל תמונה מעל קודמו עד הדיסקים האופטיים שלהם ליישר על מטוס xy- (התמונה העליונה מופיעה שקופה למחצה בזמן שגרר), ואז לסובב את התמונה העליונה עד כלי דם גדולים חפיפה עם כלי הדם על התמונה למטה (התמקדות בכולים הרחוק ביותר מהדיסק האופטי). רשום את זווית הסיבוב עבור כל תמונה ולשמור את סדרת זמן זה לשימוש עתידי, שמירה על המסלול של זהות עכבר ועין.
    2. יישר את הסדרה המקבילה של תמונות הקרינה XY-נקודה אחת על ידי יישום הזווית נרשמה לתקן את סיבוב XY בכל נקודת זמן, באמצעות תכנית עורך גרפית סריקה. בנוסף, להתאים את הרזולוציה ל -300 dpi (ללא rescaling) ורקע (במצב RGB, רמות בחרו ולטעום לומן של כלי דם שחורים). לשמור תמונות אלהכקבצי TIF, והוסיף "מיושר" לשמות שלהם.
  2. פילוח תא microglial:
    1. לזהות GFP + תאים ברשתית המרכזית, פתוח בFluoRender קובץ TIF "מיושר" המתאים לנקודת זמן / הגיל המוקדם ביותר. זום התמונה כדי להתאים את המסך, ואז להגדיר את התצוגה לדקלם (מרוכבים, מאונך, אינטרפולציה) והמאפיינים שלו (0.58 גמא, 255 לנקודת רוויה, בהירות 255, 195 אלפא ו1.00 הצללה), בחירת שני ערוצי RG כגלויים (להסתיר B ערוץ על-ידי אותו במסגרת סביבת העבודה לחיצה כפולה; איור 4 א).
    2. כדי לבחור תאים בודדים, סף הערוץ האדום (חייב להיות מסומן במסגרת סביבת העבודה), על ידי הגדלת הסף הנמוך עד שרוב התאים הם רעולי פנים (לבן) עם תהליכי מינימום חפיפה ותא (ציאן), תוך שמירה על הסף הגבוה קבוע (255). ערך הסף הנמוך נע בין 100 ו -170, תלוי בעוצמת הקרינה (איור 4 </ Strong>).
    3. להציל את ההשקפה זו עם הערוץ האדום הגלוי בלבד (הפקודה לכידת) כקובץ TIF חדש, והוסיף "cellsegm" לשם המקורי שלה (איור 4C). שימוש בתוכנת עורך גרפי סריקה כללית, להפוך בגווני אפור שלה ולהתאים את הרזולוציה ל -300 dpi כאמור לעיל, ולשמור שוב כמו RGB (איור 4D).
      הערה: מחק את התיקיות (פרויקטים) שנוצרו באופן אוטומטי על ידי FluoRender, ולשמור את סף הבקשה לעיון בעתיד.
  3. פילוח microglial סומה וmorphometry:
    1. לזהות GFP + somata תא לכימות אזור, להשתמש בתוכנת ניתוח תמונה עם מדידות אוטומטיות עוצמה ויכולות סף, כמו גם ספירת אובייקט מבוסס סף ומדידה. פתח את קובץ "cellsegm" TIF, ובחר את שיטת rescaling (שגם) ואת הערוץ האדום (לחץ על לשונית אדומה בRGB). לשפר את ההדמיה על ידי ביטול בחירה "ערוץ נוף בצבע" (לחץ לחיצה ימנית על RG האדוםB כרטיסייה), ובחירה באפשרות "להשלים צבעים" (תמונה / התאם תמונה) כדי להפוך את גווני אפור ולראות את התאים אפורים ב/ שחור על רקע לבן (איור 4E).
    2. לכייל את התמונה ל1.4-1.7 מ"מ בהתאם לגיל, על ידי ציור קו אופקי על פני כל התמונה (הכיול, כיול מהיר).
    3. somata תא בודד מגזר על ידי יישום thresholding עוצמה (איור 4). לשם כך, עבודה בערוץ RGB האדום ולפתוח את פונקצית עצמת סף (אובייקט רוזן; בחירת הפקודה "עדכון ספירה") כדי לעקוב אחר הפרמטרים bidimensional לכל איזור thresholded של העניין (ROI) המייצג somata הבודד.
    4. הגדר את סף העצמה בהיסטוגרמה העצמה, על ידי בחירת 50-60% הנמוכים ביותר של הרמות 255, ושיפור ערך הסף הסופי על ידי חזותי הערכת החפיפה בין מסכת צבע סף (הכחול) ועוטף סומה התא (האפור) ב תאים בודדים (Figure 4E).
    5. להעריך את הדיוק של מסכות סומה התא לייצג את ממדי somal על ידי מדידת השטח לפני ואחרי הפילוח ב 10 תאים וקיבלתי מגוון סף הנבחר, אם המדידות שונות פחות מ -10% (להשתמש בינארי סרגל הכלים ומדידות מבוארים).
    6. ידני לזהות ROIs somal הכוללות מספר תאים ולהפריד רכיבים אלה (לחסל או ROIs הנפרד באמצעות הפקדים בינארי סרגל הכלים, או קטלוגי האובייקט) תוך החלפה / כיבוי בינארי לדמיין ישירות התאים (איור 4F).
    7. לסווג תאי microglial כROIs עם אזורי somal גדולים יותר וקטנים יותר מאשר 50-60 מיקרומטר 2 להפלות somata התא מתאים למיקרוגלים מופעלים ומנוטרל מיקרוגלי בהתאמה, על ידי שימוש בשטח הגבלה.
      הערה: כל תת-קבוצה somal התא מזוהה עם שכבת ינארי pseudocolored שונה, וניתן לאפיין נוסף לפרמטרים מורפולוגיים אחרים (perimeter, מעגלי, וכו '), כמו גם לכמת בתוך מגזרים בדידים רשתית (איור 4G). שמור את התמונה כקובץ ניתחה ND2.
    8. ודא את התהליך ומורכבות הסתעפות בתאי microglial מופעלים בודדים, על ידי שכיסה את מסכת somal ותמונת -point XY הבודד (לעומת עלייה של 50%; איור 4H). באופן ידני לספור את התהליכים ישירות משתרעים סומה התא או למדוד את הקוטר של המצולע המקיף את הסוכה (להשתמש בינארי סרגל הכלים ומדידות מבוארים).
      הערה: תאים הופעל חסרי תהליכים או לשאת כמה (<4) וקצר (<קוטר somal 2x) אלה, בניגוד לתהליכים בתא-מופעל עישון, המהווים סוכה מסועפת ונרחבת (> 3-10x קוטר somal) המקיפים אותם יחסית סומה הקטנה.
    9. ידני לזהות תאים עם somata קטן יותר <20 מיקרומטר 2 ו / או GFP ביטוי מתחת לסף הגילוי, אשר מבלי שיבחינו לכן על ידי בthresholding דריכות. השתמש בפקודת טקסונומיה בהערות לספור אלמנטים מזוהים באופן ידני.

תוצאות

האחרון במחקרי vivo שלנו השתמשו בשיטות רכישת תמונה וניתוח חיות אלה כדי לחזות ולעקוב אחר קינטיקה ודפוסי ONH ושינויי microglial רשתית בגלאוקומה כרונית ומערכת היחסים שלהם בשלבים מוקדמים למאוחר ניוון מוחיים 59. כאן אנו מדגימים פרוטוקול רכישת תמונת cSLO לדמיין תאי microglial ?...

Discussion

ניטור חי של מספר תא microglial והפעלה מורפולוגיים במחלה ניוונית של מערכת עצבים מחייב השימוש בשיטות הדמיה לא פולשנית המאפשרות הדמיה מפורטת של תכונות תא. לאחר הדמיה, תאי microglial חייבים להיות מבודדים (מפולח) לניתוח morphometric על ידי שימוש בצעדי סף מרובים כדי להעריך גודל somal ו / או מ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ miceThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 and 00582Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringeBD, East Rutherford, NJ305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tabletsSigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 and P4417Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/PumpGaymar Industries, Orchard Park, NYTP-650
Cotton-tipped applicatorsFisher Scientific, Pittsburgh, PA23-400-100
Tropicamide 1%Bausch & Lomb, Rochester, NYNDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick centerCantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UKG003709Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer softwareHeidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CAVersion 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Redmond, WAVersion 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, San Jose, CAVersion CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, University of UtahVersion 2.13Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Melville, NYVersion 4.30.01

References

  1. Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. . Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  7. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57 (6), 563-581 (1999).
  8. Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763 (2012).
  9. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
  10. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  11. Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
  12. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  13. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  14. Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  16. Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
  17. Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
  18. Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1393-1415 (2012).
  19. Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
  20. Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
  21. Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
  22. Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61 (1), 10-23 (2013).
  23. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
  24. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910 (2011).
  25. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
  26. Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
  27. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
  28. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  29. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
  30. Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
  31. Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
  32. Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
  33. Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
  34. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  35. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
  36. Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
  37. Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
  38. Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
  39. Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
  40. Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
  41. Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
  42. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  43. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
  44. Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
  45. Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
  46. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  47. Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
  48. Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
  49. Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
  50. Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
  51. Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
  52. Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
  53. Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
  54. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
  55. Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
  56. Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
  57. Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
  58. Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
  59. Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

99ophthalmoscopy confocalthresholdingmorphometry CX3CR1DBA 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved