JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mikroglia aktivasyonu ve mikroglioz kronik nörodejenerasyona önemli tepkilerdir. Burada, in vivo, konfokal oftalmoskopi retinal CX3CR1-GFP + mikroglial hücreleri uzun süreli görselleştirme için yöntemler sunmak ve eşik ve morfometrik için belirlemek ve aktivasyonunu ölçmek için analiz eder. Biz yaşa bağlı glokomun erken evrelerinde mikrogliyal değişiklikleri takip.

Özet

CNS-resident nöroimmün hücreleri mikroglia, farklı fonksiyonları ve gen ekspresyon profilleri ile aktive durumuna geçiş, MSS hasarı yanıt olarak kendi morfolojisi ve boyutunu dönüşümü. Sağlık, yaralanma ve hastalık mikrogliyal aktivasyon rolleri tam olarak nedeniyle mikroçevresinin değişikliklere tepki olarak dinamik ve karmaşık düzenlemeye anlaşılamamıştır. Bu nedenle, non-invaziv monitör için çok önemlidir ve bozulmamış organizmada zamanla mikrogliyal aktivasyon değişiklikleri analiz eder. In vivo mikrogliyal aktivasyon çalışmaları CNS ortamı değiştirmeden izleme mikrogliyal davranış teknik sınırlamalar gecikmelidir edilmiştir. Bu uzun vadeli değişiklikler izlenir gereken kronik nörodejenerasyon sırasında özellikle zor olmuştur. Retina, non-invaziv canlı görüntüleme için uygun bir CNS organ görselleştirmek ve kronik hastalık sırasında mikroglia aktivasyonu dinamiklerini karakterize için güçlü bir sistem sunmaktadır.

in vivo görüntüleme, hücresel çözünürlük ile mikroglia görselleştirmek için, konfokal oftalmoskopi (cSLO) ve CX3CR1 GFP / + raportör fareler kullanmak için yöntemler açıklar. Ayrıca, biz büyük hücre alt hücre aktivasyonu ve yoğunluğu aylık değişimleri (retinanın başına 200-300 hücre) ölçmek için yöntemler açıklanmaktadır. Biz in vivo görüntülerin otomatik eşik tabanlı morfometrik analizi uygulayarak retinada mikrogliyal aktivasyon canlı izleme için yararlı bir metrik olarak lizozomal alanının kullanımını doğrulamaktadır. Biz bu canlı görüntü alımı kullanmak ve kronik glokom bir fare modelinde retina nörodejenerasyon erken aşamalarında mikrogliyal aktivasyon ve mikrogliyozu dinamik değişiklikleri izlemek için stratejiler analiz eder. Bu yaklaşım retina ve optik sinir etkileyen kronik CNS rahatsızlıkları nöronal ve aksonal düşüş mikroglia katkılarını araştırmak için yararlı olacaktır.

Giriş

Mikroglia sadece erken embriyonik gelişim beri ve yetişkinlik boyunca merkezi sinir sistemi (MSS) ikamet nöroimmün hücrelerdir. Reseptörlerinin karmaşık bir repertuar ile donatılmış, mikrogliyal aktivite ve bölgesel heterojenlik komşu nöronlar, glia, kan-beyin bariyeri ve nöroenflamatuar hücreleri 1,2 infiltre ile çift yönlü etkileşimi tarafından düzenlenir. Onlar homeostazisi 3,4 olarak tedirginlikler için kendi topraklarını örnek olarak bazal mikrogliyal fonksiyonlar, fizyolojik bakım ve onarım katkıda bulunmaktadır. CNS yaralanma ya da hastalık sırasında, mikroglia sonra reaktif fenotip onların geçişi tetikler nöronal sinyalleri ilk müdahale var, "mikroglia 2,5-7 aktif olarak adlandırılan. Mikroglia aktivasyonu, hücre soma ve süreç yeniden boyutlandırma ve 6-9 biçimlenme kuple edilir geni ve protein ifadesi, karmaşık bir döngüsünü içerir. Mikroglia aktivasyonu, aynı zamanda, hücre yeniden dağıtım vekümeleme, hücre sayısının (adlandırılır mikroglioz) yerel genel bir artış eşlik edebilir. Bu ya da kan-kaynaklı monosit 3,4,7,10-14 işe olmayan hücre proliferasyonu ve kendini yenileme, kaynaklanabilir. Yaşa bağlı kronik CNS hastalıkları geniş bir yelpazede, mikroglioz ve mikrogliya aktivasyon paralel hastalığın ilerlemesini 15-19 sürdürmüştür. Nasıl Mikroglia darbe nörodejenerasyon onlar hastalığın başlangıcı ve ilerlemesine farklı katkıları olabilir hem nöroprotektif ve zararlı roller oynamaya başlıca nedeni, belirsizliğini koruyor. Kronik CNS hastalığı anlamaya yönelik canlı görüntüleme çalışmaları hayvan modellerinde ve insan merkezi sinir sistemi hasar görmüş mikrogliyal davranışı gözlenir ve mikroglial değişiklikler hastalığın erken aşamalarında 15-17,19,20 saptanabilen bir başlangıç ​​olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, tespit etmek ve in vivo olarak mikroglial aktivasyon izlemek için yaklaşımlar geliştirilmesi kritik öneme sahiptir.

Non-invaziv deteBeyin mikroglia aktivasyonu bölgesel değişikliklerin ction moleküler görüntüleme veya biyolüminesans ve pozitron emisyon tomografisi veya manyetik rezonans görüntüleme 18,21,22 kullanarak, nörodejeneratif hastalığın ilerlemesi in vivo göstergesi önemli bir olarak kurulmuştur. Bu son derece nicel ve non-invaziv moleküler ve nükleer tıp görüntüleme yöntemleri bölgesel çözünürlükte gliozis algılar. Alternatif olarak, CX3CR1 GFP / + farelerde iki foton konfokal görüntüleme hücresel çözünürlükte 3,4,9,20,23-28 beyin mikroglia gözlenmesi izin verdi. Ancak, bu yaklaşım bile minimal invaziv beyin görüntüleme prosedürleri 29 kendi davranışlarını rahatsız potansiyel risk göz önüne alındığında, uzun vadeli ve kronik mikrogliyal değişiklikler tekrarlanan gözlem sınırlar. Alternatif olarak, retina, akut yaralanma sonrası in vivo görselleştirme doğrudan için en uygun koşulları ve yaşlanma boyunca bozulmadan MSS niş içinde mikrogliya tekrarlanan izleme sunar vePotansiyel kronik nörodejeneratif hastalıklar sırasında. Böylece, son çalışmalar görüntüye konfokal tarayıcı laser oftalmoskopi (cSLO) canlı CX3CR1 GFP / + fareler uyarlayarak GFP ifade retina mikroglia yüksek çözünürlüklü görüntüleme fizibilite kanıtlamıştır. Bu akut kaynaklı yaralanma ya da oküler hipertansiyon 30-36 Aşağıdaki kadar 10 hafta için tek tek farelerde GFP + hücre sayıları haftalık değişimleri izlemek için kullanılmıştır.

Biz birkaç ay içinde uzun vadeli görüntüleme gerçekleştirmek ve kantitatif morfometrik analizi kullanılarak soma boyutuna göre mikroglia aktivasyonu değişiklikleri izlemek için bu yaklaşımı artırdık. Somal boyutu CX3CR1-GFP + mikroglia 9 in vivo görüntüleme gerçekleştirmek için kortikal dilim iki foton konfokal mikroskopi kullanılarak canlı görüntüleme çalışmalarında Mikroglia aktivitesi için faydalı bir ölçüt olarak tanımlandı. Bunlar ve diğer çalışmalarda da, WH lizozomal büyüklüğü ve Iba1 protein ekspresyonu düzeyleri arasında korelasyon gösterdiIch, aktivasyon 9,37 ile artar. Bu nedenle, aktif mikroglia canlı farelerde tespit edilebilir, ve bunların sayısı ve dağılımı MSS sağlık ve hastalık sırasında zaman içinde izlenebilir.

Bu protokol cSLO canlı görüntü toplama ve analiz yöntemleri mikrogliyal hücre sayıları, retina ganglion hücre (RGH) dejenerasyonu (Şekil 1) sırasında dağılımı ve morfolojik aktivasyon izlemek için açıklanır. Böylece, bu çalışma kullanır: 1) yaşa bağlı optik sinir ve retina ve nörodejenerasyonunun uğrar miras glokom (DBA / 2J) bir fare modeli yaş 38,39 5 ile 10 ay arasında hastalığın ilerlemesinde kayda değer değişkenlik gösterir, 2) aylık Uzun vadeli retinada GFP + hücrelerin görselleştirme ve 3-5 ay, hücre somata ve ölçü izole etmek segmentasyon ve eşikleme 3) canlı görüntüleme analizi yaşlı heterozigot Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J farelerin miyelinsiz optik sinirin için cSLO in vivo görüntülemeIR alanı. Bu stratejiler, kronik glokom erken evrelerinde retina mikrogliyal aktivasyonun durumlarının kinetiğini değerlendirmek için uygulanır.

Protokol

İn vivo görüntüleme Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokoller kullanılarak patojensiz tesislerinde yapılır.
NOT: Bu görüntüleme protokolü retina mikroglia ve infiltre monositler / makrofajlar fractalkine reseptör lokus (CX3CR1) kontrolü altında, yeşil fluoresan protein (GFP) ifade eden raportör fareler için kullanılır.

Konfokal Tarayıcı Lazer Oftalmoskopide tarafından Retina GFP + mikroglia Vivo Görüntüleme 1. (cSLO)

  1. İşlem sırasında 35-37 ºC arasında fare sıcaklığını dengelemek için ayarlanmış su kontrollü ısıtma sistemi, açın ve iki ısıtma pedleri bağlayın.
    1. Konfokal tarayıcı laser oftalmoskop (cSLO) sistemi (Şekil 2A) başlatın. Bireysel fare tanımlamak ve 2 mm (Hasta Veri menüsü) bir kornea eğriliğini koyacaktır bilgileri girin, cSLO programını açın.
  2. Ima hazırlanınging. Güvenli yuvasından temiz bir 55º geniş alan objektif lens takınız. Temiz kağıdı ile kaplı bir ısıtma yastığı güvence altına alarak oftalmoskop görüntüleme platformu hazırlayın. Ped ve kağıdı düzleştirmek ve objektif lens hareketini engelleme onları tutmak için klipler kullanın.
  3. % 1.3 2,2,2-tribromoetanol ve% 0.8 tert-amil alkol intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi (250 mg / kg vücut ağırlığı; 0.5 ml / 25 g vücut ağırlığı), bir 1 ml tek kullanımlık takılan bir 30½ G iğne kullanılarak Şırınga. Kendi kafesine fare dönün, bir ısıtma yastığı üzerinde tuttu.
    NOT: Teneffüs karşı enjeksiyon yoluyla anestezi teslim burun koni ve boru ücretsiz görüntüleme ve gözlere engelsiz erişim için fare, daha kolay konumlandırma izin verir.
  4. Hayvan hareket durur ve kuyruk tutam tepkisiz sonra, eğilimli hayvan konumlandırılması ve 7 dakika boyunca damla her iki gözlerini kapatarak, tropikamid ve fenilefrin (% 0.5 her biri) ile öğrenci dilatasyon neden olur.
  5. 5 dk, p sonraMinimal basınç uygulayarak, her iki gözlerinin üzerinde oftalmoskop platformun ortasına eğilimli fare ve fit kontakt lensler dantel.
    NOT: forseps yerine 40 kullanılabilmesine rağmen Kontakt lensler, küçük ve kırılgan ama dikkatle parmaklarınızla ele alınabilir. o göz kuruluğu en aza indirir ve görüntüleme sırasında kornea saydamlığını koruyan olarak kontakt lens kullanımı isteğe ama tavsiye edilir.
  6. 7 dakika sonra, platformun (Şekil 2B) kenarına yakın sınırlanmadığı hayvan tutarak, objektif lens ve objektif lens yörünge paralel bakan sağ gözü ile fare yönlendirmek. Karşılaştırılabilir doygunluğu ve yönlendirme görüntüleri toplamak için sürekli objektif lens gözün mesafe yanı sıra görüntüleme oturumları boyunca ışık yolu göze hizasını korumak. Gözün gözlem müdahale uzun bıyıkları Clip.
    NOT: Bir sonraki 8-10 dakika için, fare taşımak veya yanıp ve nazik hareket ile olacak nefes olmazyüksek kontrastlı fundus yerlerinden dayalı tarama kafası konumunu ayarlar cSLO Göz İzleme ART (otomatik gerçek zamanlı) modu ile izlenir likte. O zaman geçmiş, fareler görüntüleme pratik yapma, nefes nefese ve yanıp sönen başlar.
  7. Görüntüleme kontakt lens kullanmadan gerçekleştirilirse, PBS her iki göze kurumasını önlemek için her 2-3 dakikada damla uygulayın.
  8. Retina damar sistemi ve optik diskin fundus görüntüsünü toplayın, iç retina üzerinde duruldu.
    1. Kızılötesi modu (IR) seçin ve 820 nm uyarma,% 100 lazer gücü,% 40-60 duyarlılık (Şekil 2C) ayarları yapın.
    2. Yüksek hız modunda (12,6 kare / sn) Çalışma, oftalmoskopu sürmek için joystick'i kullanarak göz bulun. Düşük büyütmede, yaralanma veya opaklık için kornea ve lensi incelemek ve retina (Şekil 3A) görüntüleme etkileyecek kusurları ya da yaralanma ile çalışma gözlerinden dahil değildir.
    3. Optik disk alanını (yüzeyini bulunyakın göz hedefi getirerek optik sinir başı, OSB), sonra bunun görüntüsünü ortalamak ve joystick vidalanarak bu pozisyonu kilitleyin. Oftalmoskop Gözün bu hizalama bile elde resmin üzerinde odaklanmak ve emisyon anahtarıdır.
    4. Kazılan optik gösteren gözünde bir referans odak düzlemi (59 ve 60 D), ya da daha derin (55 D) olarak retina vitreus yüzeyinde bulunan büyük kan damarlarını kullanarak, OSB yanı sıra, retinanın iç uçakları görselleştirmek diskler. Optimal odak açıkça belirgin onların lümeni ve duvarlar ile büyük kan damarları içinde kan hücreleri dolaşan çözmelidir.
    5. Üniforma aydınlatma beyaz halo (hafif aşırı pozlamayı kullanarak) optik disk etrafında 55º fundus alanında çoğunda yayılan kadar dokunmatik kontrol paneli üzerindeki düğmeyi ayarlayarak görüntü doygunluğu optimize edin. Sonra, büyük damarlar boyunca hareket kan hücreleri açıkça çözülebilir kadar kontrast optimize etmek için doygunluğu düşük. Fokal karanlık Eğeralanlar değil nedeniyle retina hasarı, bir homojen parlak bir görüntü elde edilinceye kadar kameraya göz realign, devam etmektedir. Bu ayar konumuna ve kalite görüntülerin tekrarlanabilir setleri yakalamak için esastır.
    6. Gerçek zamanlı olarak 30 kare (4.7 kare / sn; normalize) ortalama (yaşa bağlı olarak, çapı 1,4-1,7 mm), merkezi retina yüksek çözünürlüklü IR görüntüsü toplamak sinyal-gürültü oranını geliştirmek için, (Şekil 2D ).
  9. Hemen, GFP + mikrogliya ve / veya retina ve OSB iç uçakları lokalize sızan monositler bir floresan görüntü kazanır.
    Not: retina İR fundus görüntüsünün Optimizasyonu GFP + hücrelerinin floresan görüntü çözünürlüğünü, hem de yayılmış iç retina belirlemektedir. Damarsal kötü kararı ile tespit edilebilir retinanın, iç uçakları odaklanmak için başarısızlık, soluk GFP + hücre görünümleri (Şekil 3B) neden olur. IR Satu ayarlamak için başarısızlıkoranı düzgün ve eşit olarak GFP + hücre yoğunluğu ve boyutu (Şekil 3C) artefakt varyasyonları sokulması, floresan görüntü (FA) etkilemektedir.
    1. Korunur mavi, 488 nm lazer uyarma (460-490 nm bariyer filtre seti) ve satın alma ayarlarını (% 100 lazer gücü ve 100-125% duyarlılık) kullanarak, dokunmatik ekran panelinde görüntüleme modu (FA) floresan Swich Tüm fareler (Şekil 2E) için sabittir.
    2. Tek bir xy noktası, retinanın iki boyutlu floresan görüntü toplayın ve hemen özdeş pozisyonda bir fundus görüntü yakalamak (100x tarama ortalama, her iki görüntüler için 55º tarama açısı; Şekil 2F).
    3. Burun-zamansal ekseni (Şekil 2H) karşısında retina kaydırma, kontrol paneli (Şekil 2G) 'de "kompozit" seçme ve oftalmoskop sağa hareket ve sol tarafından bir çoklu görüntü yakalamak.
      NOT: Tek bir xy noktası görüntü taradıktan sonra (100x sgerçek zamanlı yazılım otomatik olarak optimum tarama veya tarama olanaksız olduğunda kırmızı sırasında ortalamalar yeşil bir daire ile sınırlı aynı ve yeni alanlara (yeni taramalar), ve dikişleri tüm xy-pozisyonları,) ortalamasını yapabilirsiniz. Elde edilen kompozit görüntü dikey eksende (55º x 120-124º tarama açı) yatay eksen x 3-4 mm üzerinde 1.5-1.7 mm açıklıklı.
  10. Yanıp sönen ve hareket yeniden başlatıldığında daha önce, anestezi uyaran sonra 15 dakika içinde her farenin Komple görüntüleme.
  11. PBS ile kontakt lensler, hidrat gözleri çıkarın ve motilite tam iyileşme kadar davranışını kontrol etmek, onun ısındı kafesine hayvan dönün.
  12. Aynı bireysel fare aralıklı cSLO görüntüleme oturumları kullanarak uzunlamasına çalışmalar için, anestezi kümülatif toksisite yanı sıra korneal tahrişi önlemek için en az 3 gün arayla görüntüleme tekrarlayın.

2. Canlı Görüntü İşleme ve Analizi

  1. Sıralı görüntü hizalama:
    1. Hizalamanirengi noktaları gibi damarsal ve optik disk kullanarak aynı gözün bir zaman serisi için fundus görüntüleri. Ticari bir slayt gösterisi sunumu programında, kendi optik diskler karboksi- uçağa hizaya gelene kadar bir önceki (üst resim sürüklenen olurken yarı saydam görünür), o zamana kadar üst görüntüyü döndürmek üzerinde her görüntüyü sürükleyerek tüm görüntüleri açın onun büyük kan damarları (uzak optik diskten gemiler odaklanan) aşağıdaki resimde damarsal örtüşüyor. Her resim için döndürme açısını kaydetme ve fare ve göz kimliğinin takip, ileride başvurmak üzere bu zaman serisi kaydedin.
    2. Her zaman noktasında xy dönüşünü düzeltmek için kaydedilen açı uygulamanın bir raster grafik editörü programını kullanarak tek xy noktası floresan görüntülerin gelen dizi aynı hizaya getirin. Ayrıca, 300 (yeniden ölçekleme olmadan) dpi ve arka plan çözünürlüğü ayarlamak (RGB modunda seçin Düzeyleri ve siyah bir kan damarının lümeni örnek). Bu görüntüleri kaydetmeTIF dosyalarını olarak, kendi adlarına "hizalanmış" eklenerek.
  2. Mikrogliyal hücre segmentasyon:
    1. FluoRender açık, merkezi retinada en erken zaman noktası / yaşa tekabül "hizaya" TIF dosyası GFP + hücreleri tespit etmek. Ekrana sığacak şekilde görüntüyü yakınlaştırma, daha sonra (sakla görünür olarak RG kanalları hem seçerek, Render görünümü (kompozit, dik, değerli) ve özelliklerini (0.58 gama, 255 doyma noktası, 255 parlaklık, 195 alfa ve 1.00 gölgeleme) tanımlamak çift ​​tıklayarak Çalışma Alanı çerçeve içinde tarafından B kanalı; Şekil 4A).
    2. Sürekli yüksek eşiği tutarken hücrelerin çoğunluğu asgari örtüşme ve hücre süreçlerinin (mavi) ile (beyaz) maskeli kadar düşük eşiği artırarak, (Workspace çerçeve üzerinde vurgulanmış olmalıdır) tek tek hücrelerin, eşik kırmızı kanalı seçmek için (255). Düşük eşik değeri floresan yoğunluğu (Şekil 4B 100 ve 170 arasında değişmektedir/ Strong>).
    3. Özgün adı (Şekil 4C) için "cellsegm" ekleyerek, yeni bir TIF dosya olarak görünür kırmızı kanalda sadece (Yakalama komutu) ile bu görünümü kaydedin. Genel raster grafik editörü yazılımı kullanarak, onun gri tonlama ters ve yukarıdaki gibi 300 dpi çözünürlüğü ayarlamak, ve RGB (Şekil 4D) olarak yeniden kaydedin.
      NOT: Otomatik FluoRender tarafından oluşturulan klasörler (proje) silin ve ileride başvurmak için uygulanan eşiği kaydedin.
  3. Mikrogliyal soma segmentasyonu ve morfometri:
    1. Alan ölçümü için GFP + hücre somata belirlemek için, otomatik yoğunluk ölçümleri ve eşik yetenekleri yanı sıra, eşik-tabanlı nesne sayma ve ölçümü ile görüntü analiz yazılımı kullanın. "Cellsegm" TIF dosyasını açın ve rescaling yöntemi (spline) ve kırmızı kanalı seçin (RGB kırmızı sekmesini tıklatın). "Renkli görünüm kanalı" seçimi kaldırarak görselleştirme geliştirin (kırmızı RG sağ tıklayınB sekmesi) ve "renkleri tamamlayacak" seçerek (Resim / gri tonlama ters ve beyaz arka plan (Şekil 4E) üzerinde siyah / gri hücreleri görmek için) Resmi ayarlayın.
    2. Tüm görüntü (Kalibrasyon, Hızlı Kalibrasyon) boyunca yatay bir çizgi çizerek, yaşa bağlı olarak 1,4-1,7 mm görüntüyü ayarlayın.
    3. Yoğunluk eşikleme (Şekil 4B) uygulayarak Segment bireysel hücre somata. Bunun için, kırmızı RGB kanalında iş ve Eşik Yoğunluk fonksiyonu açın (Object sayın; "sayım update" komutunu seçerek) ayrı somata temsil faiz (ROI) her eşiklenir bölge için iki boyutlu parametreleri izlemek için.
    4. 255 seviyeleri düşük% 50-60 seçme ve görsel eşik renk maskesi (mavi) ve hücre soma çevre (gri) içinde arasındaki örtüşme değerlendirerek nihai eşik değeri detaylandırarak, yoğunluk histogram yoğunluk eşiği tanımlayın tek tek hücreler (FŞEKIL 4E).
    5. Ölçümler% 10'dan daha az (İkili Araç Çubuğu ve Açıklamalı Ölçüleri kullanın) farklı ise 10 hücrelerinde segmentasyon önce bölgeyi ölçerek ve daha sonra lizozomal boyutlarını temsil ve seçilen eşik aralığı kabul hücre soma maskeleri doğruluğunu tahmin edin.
    6. Manuel birden çok hücre bulunur ve doğrudan hücreler (Şekil 4F) görselleştirmek için ikili açma / kapama geçiş yaparken, bu elementler (İkili Araç Çubuğu denetimleri veya Nesne Kataloğu kullanarak ortadan kaldırmak veya ayrı ROI) ayırmak lizozomal ROI'ları belirlemek.
    7. Lizozomal alanları büyük ve daha küçük 50-60 mikron 2 aktif mikroglia karşılık gelen hücre somata ayrımcılık ve Alan Kısıtlama kullanarak, sırasıyla mikroglia devre dışı etmek ile ROI olarak mikrogliyal hücreleri sınıflandırır.
      NOT: Her bir hücre lizozomal alt küme farklı yalancı bir ikili tabaka ile tespit edilir, ve daha sonra diğer morfolojik parametrelerin karakterize edilebilir (perimeter, dairesellik, vb) yanı sıra ayrık retinal sektörlerde (Şekil 4G) içinde sayısal olarak. Bir ND2 dosyası olarak analiz görüntüyü kaydedin.
    8. Lizozomal maske ve tek xy -point görüntü yazdırarak, bireysel aktive mikroglial hücrelerinde süreci ve dallanma karmaşıklığı doğrulayın (Şekil 4H kontrast% 50 arttı). El ile doğrudan hücre soma uzanan süreçleri saymak ya da çardak (İkili Araç Çubuğu ve Açıklamalı Ölçüleri kullanın) kapsayan poligonun çapını ölçün.
      Not: Aktif hücre süreçleri eksikliği ya da birkaç ayı (<4) ve kısa (<2x lizozomal çap) olanları, bir dallanmış ve detaylı mili ihtiva aktif olmayan hücre süreçlerinin aksine, (> 3-10x lizozomal çap) göreceli olarak çevrelerinde küçük soma.
    9. El ile, bu nedenle de tarafından tespit edilmemiş olan algılanma limitinin altındadır; somata daha küçük <20 um 2 ve / veya GFP ekspresyonu ile hücreleri tanımlamakyoğunluklu bir eşikleme. Elle tespit elemanları saymak için Detaylandırmalar içinde Taksonomi komutunu kullanın.

Sonuçlar

Bizim son in vivo çalışmalar görselleştirmek ve geç nörodejenerasyona 59 kronik glokom ve ilişkilerinin erken aşamalarında kinetik ve OSB ve retinal mikrogliyal değişiklikler kalıplarını izlemek için bu canlı görüntü toplama ve analiz yöntemleri kullanılır. Burada bireysel genç heterozigot Cx3CR1-GFP DBA / 2J retina merkezi retina (Şekil 5) geniş bir alan boyunca mikrogliyal hücreleri görselleştirmek için bir cSLO görüntü elde etme protokolünü göst...

Tartışmalar

Nörodejeneratif bir hastalık sırasında mikrogliyal hücre sayısı ve morfolojik aktivasyon canlı izleme hücre özelliklerinin ayrıntılı görselleştirme izin non-invaziv görüntüleme yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir. Görüntüleme sonra, mikroglial hücreler Mikroglia aktivitesi için çıktılan olarak lizozomal boyutu ve / veya işlem karmaşıklığını değerlendirmek için çok sayıda eşik adımlarının kullanımı ile morfometrik analiz için (bölünmüş) izole edilmelidir. Bu protoko...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ miceThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 and 00582Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringeBD, East Rutherford, NJ305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tabletsSigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 and P4417Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/PumpGaymar Industries, Orchard Park, NYTP-650
Cotton-tipped applicatorsFisher Scientific, Pittsburgh, PA23-400-100
Tropicamide 1%Bausch & Lomb, Rochester, NYNDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick centerCantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UKG003709Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer softwareHeidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CAVersion 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Redmond, WAVersion 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, San Jose, CAVersion CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, University of UtahVersion 2.13Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Melville, NYVersion 4.30.01

Referanslar

  1. Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. . Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  7. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57 (6), 563-581 (1999).
  8. Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763 (2012).
  9. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
  10. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  11. Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
  12. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  13. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  14. Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  16. Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
  17. Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
  18. Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1393-1415 (2012).
  19. Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
  20. Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
  21. Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
  22. Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61 (1), 10-23 (2013).
  23. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
  24. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910 (2011).
  25. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
  26. Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
  27. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
  28. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  29. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
  30. Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
  31. Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
  32. Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
  33. Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
  34. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  35. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
  36. Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
  37. Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
  38. Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
  39. Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
  40. Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
  41. Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
  42. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  43. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
  44. Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
  45. Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
  46. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  47. Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
  48. Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
  49. Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
  50. Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
  51. Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
  52. Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
  53. Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
  54. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
  55. Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
  56. Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
  57. Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
  58. Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
  59. Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 99N robilimmikrogliyan rodejenerasyonglokomretinaoptik sinir bakonfokal taray c laser oftalmoskopicanl g r nt analizie ikleme ile segmentasyonuh cre morfometri CX3CR1DBA 2J

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır