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要約

ミクログリアの活性化および小膠は、慢性神経変性に重要な応答です。ここでは、in vivoで 、共焦点検眼鏡による網膜CX3CR1-GFP +ミクログリア細胞の長期的な可視化のための方法を提示し、閾値と形態計測のために識別し、それらの活性化を定量化するために分析します。我々は、年齢関連の緑内障の早期の段階でミクログリアの変化を監視します。

要約

CNS常駐神経免疫細胞であるミクログリアは、異なる機能や遺伝子発現プロファイルを用いて活性化状態に切り替え、CNS損傷に応答してその形態と大きさを変換します。健康、傷害および疾患におけるミクログリアの活性化の役割が不完全に、それらの微小環境の変化に応じて、そのダイナミックで複雑な規制に理解されたままです。これにより、非侵襲的にモニターするために重要であり、無傷の生物の経時ミクログリアの活性化の変化を分析します。ミクログリアの活性化のインビボ研究では、CNS環境を変えることなく、ミクログリアの行動を追跡することに技術的な限界により遅延されています。これは長期的な変化を追跡する必要があり、慢性神経変性、中に特に困難でした。網膜、非侵襲的なライブイメージングの影響を受けやすいCNS器官は、慢性障害時にミクログリアの活性化の動態を可視化し、特徴づけるための強力なシステムを提供しています。

、in vivoイメージング、携帯解像度でミクログリアを可視化するために、共焦点検眼鏡（cSLO）とCX3CR1 GFP / +レポーターマウスを使用する方法の概要を説明します。また、我々は大規模な細胞サブセットでの細胞の活性化および密度の月次変化（網膜あたり200〜300細胞）を定量化するための方法を記載しています。我々は、in vivoでの画像の自動化されたしきい値ベースの形態学的分析を適用することにより、網膜における小グリア細胞活性化のライブ追跡するのに有用な測定基準としてソマリ族領域の使用を確認します。我々は、これらのライブ画像の取得を使用して、慢性緑内障のマウスモデルにおける網膜神経変性の初期段階ミクログリア活性化および小膠細胞の動的変化を監視するための戦略を分析します。このアプローチは、網膜や視神経に影響を与える慢性CNS障害におけるニューロンおよび軸索の減少にミクログリアの貢献を調査するのに有用であるべきです。

概要

ミクログリアはもっぱら初期胚発生以来と成人期を通じて、中枢神経系（CNS）に存在する神経免疫細胞です。受容体の複雑なレパートリーを搭載し、ミクログリア活性および地域の異質性は、隣接するニューロン、グリア、血液脳関門および神経炎症細胞1,2浸潤との双方向の相互作用によって調節されています。基礎ミクログリア関数は、ホメオスタシス3,4における摂動のために自国の領土をサンプルとして、生理的なメンテナンスや修理に貢献しています。 CNS傷害または病気の間に、ミクログリアは、その後、反応性の表現型への移行を誘発する神経信号に第一応答者であり、「ミクログリア2,5-7活性化と呼ばれます。ミクログリアの活性化は、細胞体およびプロセスのサイズ変更に結合され、6-9の改造された遺伝子およびタンパク質発現の複雑なサイクルを伴います。ミクログリアの活性化、ならびに細胞の再分配とクラスタリングは、セルの数（と呼ばれる小膠）の局所的な全体的な増加を伴うことができます。これは、細胞増殖および自己再生から、または血液由来の単球の動員3,4,7,10-14ことなくもたらすことができます。年齢依存、慢性CNS疾患の広い範囲に、小膠細胞およびミクログリアの活性化、並列疾患進行15-19を持続。どのようにミクログリア衝撃神経変性は、彼らは、疾患の発症および進行に多様な貢献を有することができ、両方の神経保護および有害な役割を果たしている主な理由は、不明のままです。慢性CNS疾患を理解することを目的としたライブイメージング研究は、動物モデルおよびヒトの損傷したCNSにおける小膠細胞の挙動を監視し、ミクログリアの変化は疾患の初期段階で検出15-17,19,20始まりであることを実証しました。従って、 インビボでのミクログリアの活性化を検出し、監視するためのアプローチを開発することが重要です。

非侵襲的DETE脳のミクログリアの活性化の地域変化のctionは、分子イメージングまたは生物発光と陽電子放射断層撮影法または磁気共鳴画像18,21,22を用いて、神経変性疾患の進行のインビボ指標で重要なものとして設立されました。これらの高度に定量的および非侵襲的な分子と核イメージング法は、地域の分解能で神経膠症を検出します。あるいは、CX3CR1 GFP / +マウスにおける二光子共焦点イメージングは、細胞解像度3,4,9,20,23-28で脳のミクログリアの観察を可能にしました。しかし、この方法は、さらに低侵襲的脳イメージング手順29によってその動作を妨害する潜在的なリスクを考慮すると、長期的な慢性のミクログリアの変化の繰り返し観察を制限します。あるいは、網膜は、急性損傷後の、 生体内可視化と高齢化を通じて、その無傷のCNS ​​のニッチにおけるミクログリアの繰り返しモニタリングで 、直接に最適な条件を提供し、潜在的に慢性神経変性疾患中。したがって、最近の研究では、画像に共焦点走査型レーザー検眼鏡（cSLO）ライブCX3CR1 GFP / +マウスを適合させることにより、GFPを発現する網膜ミクログリアの高分解能イメージングの可能性を証明しています。これは、誘導された急性傷害または高眼圧症30-36以下の最大10週間、個々のマウスにおけるGFP +細胞数の毎週の変化を追跡するために使用されています。

我々は、数ヶ月にわたって長期撮影を行い、定量的形態計測分析を用いて、細胞体の大きさに基づいて、ミクログリアの活性化の変化を追跡するために、このアプローチを拡張しました。ソマリ族サイズがCX3CR1-GFP +ミクログリア9のインビボイメージングに実行するために、皮質切片における二光子共焦点顕微鏡を使用してライブイメージング研究におけるミクログリア活性化の有用な基準として定義しました。これらおよび他の研究はまた、WH、ソマリ族サイズとIBA1タンパク質発現のレベルの間の相関関係を示しましたICHはまた、活性化9,37とともに増加します。したがって、活性化ミクログリアは、生きたマウスにおいて同定することができ、それらの数および分布は、中枢神経系の健康と病気の間に経時的にモニター。

このプロトコルは、cSLOライブ画像の取得と分析のための方法は、ミクログリア細胞数、網膜神経節細胞（RGC）の変性（ 図1）の間に分布し、形態学的な活性化を監視することについて説明します。このように、本 ​​研究では使用しています。年齢依存性視神経と網膜神経変性を受け、年齢38,39の5と10ヶ月の間、疾患の進行の著しい変動を示し、継承緑内障（DBA / 2J）の1）マウスモデルを、2）毎月細胞細胞体と測定を分離するヘテロ接合CX3CR1 GFP / + DBA / 2Jマウスの網膜および無髄視神経におけるGFP +細胞の長期的な可視化高齢者3-5ヶ月のcSLO in vivoイメージング、セグメンテーションと閾値による3）ライブイメージング解析ザIR領域。これらの戦略は、慢性緑内障の初期段階網膜ミクログリアの活性化状態の動態を評価するために適用されます。

プロトコル

in vivoイメージングではユタ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して病原体を含まない施設で行われています。
注：このイメージングプロトコルは、網膜ミクログリアおよび浸潤単球/マクロファージは、フラクタルカイン受容体遺伝子座（CX3CR1）の制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するレポーターマウスのために使用されます。

走査型共焦点レーザー眼底検査により網膜のGFP +ミクログリアのin vivoイメージング 1.（cSLO）

  1. 手順の間に35〜37ºCの間のマウスの温度を安定させるために設定し、水制御された加熱システム、電源を入れ、2つの加熱パッドを接続します。
    1. 共焦点走査型レーザー検眼鏡（cSLO）システム（ 図2A）を起動します。 cSLOプログラムを開き、個々のマウスを識別し、2ミリメートル（患者データ]メニュー）の角膜曲率を設定します情報を入力します。
  2. IMAの準備エージング。しっかりとそのソケットのクリーン55º広視野の対物レンズを取り付けます。きれいな紙で覆われた加熱パッドを固定することにより、検眼鏡の撮影台を準備します。パッドや紙を平らにし、対物レンズの移動を阻止するからそれらを保つためにクリップを使用してください。
  3. 1.3％2,2,2-トリブロモエタノールおよび0.8％tert-アミルアルコールの腹腔内注射によりマウスを麻酔（250 mg / kg体重; 0.5ミリリットル/ 25グラム体重）を1mlの使い捨てに装着30½G針を使用して注射器。そのケージにマウスを返し、加熱パッド上に保持。
    注：吸入対注射による麻酔薬の送達はノーズコーンとチューブの自由、イメージングや目に遮るもののないアクセスのためのマウスの容易な位置決めを可能にします。
  4. 動物が移動を停止し、尾のピンチに反応しないすると、発生しやすい動物を配置し、7分間滴で両眼を覆うことにより、トロピカミドおよびフェニレフリン（0.5％ずつ）で瞳孔拡張を誘導します。
  5. 5分、pの後の検眼鏡プラットフォームの中心になりやすいマウスをレースし、最小限の圧力をかけ、両眼の上にコンタクトレンズを装着します。
    注：鉗子、代わりに40を使用することができるが、コンタクトレンズは、小型で壊れやすいが、慎重に指で取り扱うことができます。コンタクトレンズの使用は任意であるが、それは目の乾燥を最小限に抑え、撮像中に角膜の透明性を保持するようお勧めします。
  6. 7分後、プラットフォーム（ 図2B）のエッジ付近の気ままな動物を維持し、対物レンズと、対物レンズへの軌道と平行に向かって右目でマウスを向けます。同程度の飽和と向きの画像を収集するために、常に対物レンズに目からの距離だけでなく、イメージングセッション全体に光路に目の位置合わせを維持。目の観察を妨害する長いウィスカをクリップ。
    注：次の8-10分のために、マウスを移動したり、点滅、および穏やかな動きとなります息ませんコントラストの高い眼底ランドマークに基づいて、走査ヘッドの位置を調整cSLOアイトラッキング技術（自動リアルタイム）モードによって追跡されメント、。その時間を過ぎて、マウスは、イメージングが実用的でない、喘ぐと点滅し始め。
  7. イメージングは​​、コンタクトレンズを使用せずに行った場合、PBSを両眼に乾燥するのを防ぐために、すべての2~3分を廃棄適用します。
  8. 網膜血管系および視神経乳頭の眼底画像を収集し、内側の網膜に焦点を当てました。
    1. 赤外線モード（IR）を選択し、820 nm励起、100％のレーザーパワー、40〜60％の感度（ 図2C）に設定を調整します。
    2. 高速モード（12.6フレーム/秒）での作業、検眼鏡を駆動するために、ジョイスティックを使用して、目を探します。低倍率では、傷害や不透明性のため、角膜とレンズを検査し、網膜（ 図3A）イメージング影響する欠陥や損傷と研究の目から除外する。
    3. 視神経乳頭領域（の表面の位置を確認します近い目に目的を持って来ることにより、視神経乳頭、ONH）は、その上に画像を中心とジョイスティックをねじ込むことにより、この位置をロックします。検眼鏡の目のこ​​の位置合わせは、さらに、画像全体に焦点を当てると発光を得るための鍵となります。
    4. 出土光学系を示す目に基準焦点面（59,60 D）、または深い（55 D）のような網膜の硝子体表面上に位置し、主要な血管を使用して、ONHと同様に、網膜の内側の面を視覚化ディスク。最適な焦点は明らかに異なる彼らの内腔と壁と、主要な血管内の血液の循環細胞解決する必要があります。
    5. 均一な照明の白ハロ（わずかな露出オーバーを使用して）視神経乳頭の周り55º眼底フィールドのほとんどに及ぶまで、タッチスクリーンコントロールパネルのダイヤルを調整することにより、画像の鮮やかさを最適化します。次に、主要な血管に沿って移動する血​​液細胞が明確に解決することができるまで、コントラストを最適化するために彩度を下げます。焦点暗い場合領域は、網膜の損傷によるものではない永続化、均一に明るい画像が得られるまで、カメラに目を再調整します。この調整は、位置、品質の画像の再現性のあるセットをキャプチャするために基本的です。
    6. 信号対雑音比を改善するために、;（正規化された4.7フレーム/秒）（ 図2Dリアルタイムに30フレームを平均化する、中心網膜（年齢に応じて、直径1.4〜1.7ミリメートル）の高解像度のIR画像を集め）。
  9. すぐに、GFP +ミクログリアおよび/または網膜およびONHの内側面に局在浸潤単球の蛍光画像を取得。
    注：網膜のIR眼底画像の最適化は、GFP +細胞の蛍光画像の分解能を決定するだけでなく、内側の網膜の範囲がスパン。血管系の不十分な分解能で検出することができる網膜の内側の面に焦点を当てるに失敗すると、淡色表示GFP +細胞のビュー（ 図3B）になります。 IRサトゥを調整に失敗比が正しくかつ均一にGFP +細胞の強度とサイズ（ 図3C）での人為的変化を導入し、蛍光画像（FA）に影響を与えます。
    1. 維持されている青色、488nmレーザー励起（460から490 nmのバリアフィルタセット）を使用してタッチスクリーンパネルの蛍光撮影モード（FA）と、取得設定（100％レーザー出力および100から125までパーセント感度）に切替スイッチすべてのマウス（ 図2E）のための定数です。
    2. 単一のxy点、網膜の二次元蛍光画像を収集し、すぐに同一の位置に眼底画像を取り込む（100倍のスキャン平均;両方のイメージのために55º走査角; 図2F）。
    3. コントロールパネル（ 図2G）に「コンポジット」を選択し、検眼鏡の左右の移動、鼻、時間軸（ 図2H）を横切って網膜をパンニングによりマルチ画像をキャプチャします。
      注：単一のXY点画像をスキャンした後（100×S同じと新しい分野の）、ソフトウェアは自動的に平均化する新しいスキャン（スキャンが実行不可能である場合に最適なスキャン中に緑色の円に外接する、または赤）を平均化し、リアルタイムですべてのxy位置をステッチすることができます。得られた合成画像は、縦軸（55ºX120-124º走査角度）の横軸のx 3〜4ミリメートルで1.5〜1.7ミリメートルに及びます。
  10. 点滅動きを再起動する前に、麻酔を誘導した後、15分以内に各マウスの完全なイメージング。
  11. PBSでコンタクトレンズ、水和物の目を削除し、運動性の完全回復までの動作を確認し、その温めケージに動物を返します。
  12. 同じ個体のマウスで断続的cSLOイメージングセッションを使用して長期的な研究のために、麻酔の累積毒性、ならびに角膜の刺激を避けるために劣らず3日以上離れて撮影する繰り返します。

2.ライブ画像処理と解析

  1. シーケンシャルイメージの位置：
    1. 整列しますランドマークとしての血管系および視神経乳頭を使用して、同じ目の時系列のための眼底画像。そのまでのトップ画像を回転させ、その後、それらの光学ディスクがXY-平面上に整列するまで（ドラッグされている間、トップの画像が半透明表示されます）前の1つの上に、各画像をドラッグして、商業スライドショープレゼンテーションプログラムですべての画像を開きます。主要な血管が（視神経円板から最も遠い船に焦点を当て）下の画像上の血管系と重なります。各画像の回転角度を記録し、今後の参考のため、この時系列を保存し、マウスと目のアイデンティティを追跡します。
    2. ラスターグラフィックエディタプログラムを使用して、各時点でのXY回転を修正するために記録された角度を適用することによって、単一のXY点蛍光画像の対応する一連の位置を合わせ。さらに、300（リスケーリングなし）解像度と背景に解像度を調整（RGBモード、選択レベルで、黒などの血管の内腔をサンプリング）。これらの画像を保存しますTIFファイルとして、その名前に「整列」を追加します。
  2. ミクログリア細胞のセグメンテーション：
    1. 最も早い時点/時代に対応する「整列」TIFファイルFluoRenderで開いて、中心網膜におけるGFP +細胞を同定します。画面に合わせて画像をズームし、目に見える（非表示のように、両方のRGチャンネルを選択して、レンダービュー（コンポジット、直交、補間）とそのプロパティ（0.58ガンマ、255飽和点、255輝度、195アルファ1.00シェーディング）を定義ダブルクリックワークスペースフレームでそれをすることによってBチャネル; 図4A）。
    2. 細胞の大部分がマスクされるまで、高閾値を一定に保ちながら、最小の重なりや細胞プロセスと（白）（シアン）低閾値を増加させることにより、赤チャネルに（ワークスペースフレームで強調表示されなければならない）、個々の細胞、しきい値を選択するには（255）。低いしきい値は、蛍光強度（ 図4B <によっては、100と170の間で変化します/強いです>）。
    3. 元の名前（ 図4C）に「cellsegm」を追加し、新しいTIFファイルとして見える赤チャンネルのみ（キャプチャコマンド）と、このビューを保存します。一般的なラスタグラフィックエディタソフトウェアを使用して、そのグレースケールが反転し、上記のように300 dpiのに解像度を調整し、RGB（ 図4D）として再度保存します。
      注：自動的にFluoRenderによって作成されたフォルダ（プロジェクト）を削除して、今後の参考のために適用されたしきい値を保存します。
  3. ミクログリア細胞体のセグメント化と形態計測：
    1. エリア定量化のために、GFP +細胞の細胞体を同定するために、自動化された強度測定値としきい値機能だけでなく、しきい値ベースのオブジェクトのカウントと測定と画像解析ソフトウェアを使用しています。 「cellsegm「TIFファイルを開き、再スケーリング法（スプライン）と赤のチャンネルを選択します（RGBの赤いタブをクリックします）。 「色のビューチャンネル」を選択解除して可視化を向上させる（赤RGを右クリックし、Bタブ）と、「色を補完」を選択する（画像/グレースケールを反転し、白の背景（ 図4E）ブラックオーバー/グレーのセルを参照するように）画像を調整します。
    2. 画像全体（校正、クイックキャリブレーション）を横切って水平線を描くことによって、年齢に応じて1.4〜1.7ミリメートルにイメージを調整します。
    3. 強度閾値（ 図4B）を適用することにより、セグメント個々の細胞細胞体。このため、赤のRGBチャンネルの仕事とは、閾値強度機能を開きます（オブジェクト数、「カウント更新」コマンドを選択）は、個々の細胞体を表す関心（ROI）の各閾値領域を二次元のパラメータを追跡するために。
    4. 255レベルの最も低い50〜60％を選択し、目視で閾値カラーマスク（青）、および細胞体の周辺部（グレー）との間の重なりを評価することによって、最終的な閾値を精製して、輝度ヒストグラムにおいて強度閾値を定義します個々の細胞（Figure 4E）。
    5. 10細胞における分割前後の面積を測定することにより、ソマ​​リ族の寸法を表し、測定は（バイナリツールバーと注釈測定値を使用）10％未満で異なる場合に選択された閾値範囲を受け入れるように細胞体マスクの精度を推定します。
    6. 手動で複数のセルを含み、直接細胞（ 図4F）を可視化するためのバイナリのオン/オフを切り替えることながら、これらの要素は、（バイナリツールバーコントロール、またはオブジェクトカタログを使用して除去するか、別個のROI）を分離ソマリ族の関心領域を特定します。
    7. 活性化ミクログリアに対応するセルの細胞体を区別するために50〜60ミクロン2より大きく、小さいソマリ族の領域でのROIとしてミクログリア細胞を分類し、エリア制限を使用することにより、それぞれミクログリアを非アクティブ化。
      注：各セルのソマリ族のサブセットが異なる疑似カラーバイナリ層で識別され、さらに他の形態学的パラメータについて特徴付けることができる（perimeター、真円度等 ）、並びに個別の網膜セクタ（ 図4G）内で定量しました。 ND2ファイルとして解析した画像を保存します。
    8. プロセスを確認し、個々の活性化ミクログリア細胞が複雑に分岐、ソマリ族マスク、単一のxy -点の画像を重ね合わせることによって（コントラストが50％増加した。 図4H）。手動で直接細胞体から伸びる過程を数えるか、アーバー（バイナリツールバーと注釈測定値を使用）を包含する多角形の直径を測定します。
      注：活性化された細胞は、プロセスを欠いているか、分岐し、大規模なアーバー（> 3-10xソマリ族の直径）を含む非活性化細胞プロセスとは対照的に、いくつかの（<4）とショート（<2倍のソマリ族の直径）のものを負担する、比較的周囲小さなソーマ。
    9. 手動したがってinで検出されない検出限界以下に細胞体よりも小さい<20μmの2および/ ​​またはGFP発現を有する細胞を同定tensityのしきい値。手動で識別された要素をカウントするために注釈に分類コマンドを使用します。

結果

我々の最近のin vivoでの研究は、59後期神経変性に慢性緑内障およびそれらの関係の初期段階ONHおよび網膜ミクログリアの変化の速度とパターンを視覚化し、追跡するために、これらのライブ画像の取得及び分析方法を使用していました。ここでは、個々の若いヘテロ接合CX3CR1-GFPのDBA / 2J網膜における網膜中心（ 図5）の大領域にわたってミクログリア細胞を可視化?...

ディスカッション

神経変性疾患の間の小グリア細胞の数および形態学的活性化のライブモニタリングは、細胞機能の詳細な視覚化を可能にする非侵襲性の画像化方法を使用する必要があります。撮影後、ミクログリア細胞は、ミクログリアの活性化のための読み出しとしてソマリ族のサイズおよび/またはプロセスの複雑さを評価するために、複数のしきい値工程の使用により、形態学的分析のために（セグメ...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ miceThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 and 00582Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringeBD, East Rutherford, NJ305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tabletsSigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 and P4417Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/PumpGaymar Industries, Orchard Park, NYTP-650
Cotton-tipped applicatorsFisher Scientific, Pittsburgh, PA23-400-100
Tropicamide 1%Bausch & Lomb, Rochester, NYNDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick centerCantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UKG003709Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer softwareHeidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CAVersion 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Redmond, WAVersion 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, San Jose, CAVersion CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, University of UtahVersion 2.13Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Melville, NYVersion 4.30.01

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