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요약

미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.

초록

CNS 상주 신경 면역 세포 인 미세 아교 세포는 별개의 기능 및 유전자 발현 프로파일과 액티브 상태로 전환하는, CNS 손상에 응답하여 자신의 형태와 크기를 변환. 건강, 상해 및 질병에 미세 아교 활성화의 역할은 불완전 인해 미세 환경의 변화에​​ 따라 자신의 역동적이고 복잡한 규정을 이해 남아 있습니다. 이에 따라, 비 침습적으로 모니터에 중요하며, 본래 유기체 경시 소교 활성의 변화를 분석한다. 생체 내에서 활성화를 소교 연구 CNS 환경을 바꾸지 않고 동작 추적 소교 기술적 한계에 의해 지연되어왔다. 이는 장기간 변화 추적해야 만성 신경 퇴화, 특히 도전 중에있다. 망막, 비 침습적 라이브 영상 의무가 중추 기관, 시각화 및 만성 질환 중 미세 아교 세포 활성화의 역학을 특성화 할 수있는 강력한 시스템을 제공합니다.

생체 내 이미징, 세포 해상도와 미세 아교 세포를 시각화, 공 촛점 검안경 (cSLO) 및 CX3CR1 GFP / + 기자 마우스를 사용하는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 대 세포 하위 집합의 세포 활성화와 밀도의 월별 변화 (망막 당 200-300 세포)를 정량화하는 방법을 설명합니다. 우리는 생체 화상의 자동 임계 값 기반 형태 계측 분석을 적용하여 망막 미세 아교 활성화의 실시간 추적을 위해 유용한 메트릭으로서 somal 영역의 사용을 확인한다. 우리는이 라이브 화상 취득을 사용 만성 녹내장의 마우스 모델에서 망막 신경 퇴행의 초기 단계에서 미세 아교 활성화 및 microgliosis의 동적 변화를 모니터링하기위한 전략을 분석한다. 이 방법은 망막과 시신경에 영향을 미치는 만성 중추 신경계 질환에서 신경 세포와 축삭 감소에 미세 아교 세포의 기여를 조사하는 데 유용합니다.

서문

미세 아교 세포는 독점적으로 초기 배아 발달 이후 성인기에 걸쳐 중추 신경계 (CNS)에있는 신경 면역 세포이다. 수용체의 복잡한 레퍼토리를 장착, 미세 아교 활동 및 지역 이질성이 인접 신경 아교 세포, 혈액 - 뇌 장벽 및 신경 염증성 세포 1,2 침투 자신의 양방향 상호 작용에 의해 조절된다. 그들이 항상성의 3,4의 섭동에 대한 자신의 영토를 샘플로 기저 소교 기능, 생리 유지 보수 및 수리에 기여한다. CNS의 부상 또는 질병 중, 미세 아교 세포는 반응 표현형에 자신의 전환을 트리거 신경 신호의 첫 번째 조치는 "미세 아교 세포 2,5-7 활성화 되나. 미세 아교 세포의 활성화는 세포 소마와 프로세스 크기 조정 및 6-9 리모델링에 연결되는 유전자 및 단백질 발현의 복잡한 사이클을 포함한다. 미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라, 셀 재분배클러스터링은, 셀의 수 (라 microgliosis)에서 로컬 전반적인 증가를 수반 할 수있다. 이것은 또는 혈액 유래 단핵구 3,4,7,10-14 모집없이 세포 증식과 자기 갱신에서 발생할 수 있습니다. 연령 의존적 만성 CNS 질병의 광범위한 범위에서 microgliosis 및 미세 아교 세포 활성화 평행 질병 진행을 유지 15-19. 어떻게 미세 아교 세포 충격 신경 퇴행하는 것은 그들이 질병의 발병과 진행에 다양한 기여를 할 수 있습니다 모두 신경과 해로운 역할을 주로하기 때문에, 확실하지 않다. 만성 중추 신경계 질환을 이해하기위한 라이브 영상 연구는 동물 모델과 인간의 손상된 중추 신경계의 소교 동작을 모니터링하고, 미세 아교 변경이 초기 질병 단계 15-17,19,20에서 검출 시작이라는 것을 증명하고있다. 따라서, 검출 및 생체 내에서 활성화를 소교 모니터링하는 방법을 개발하는 것이 중요하다.

비 침습적 DETE뇌 미세 아교 세포의 활성화에 지역 변경 ction의는 분자 영상 또는 생물 발광 및 양전자 방출 단층 촬영이나 자기 공명 영상 18,21,22를 사용하여, 신경 퇴행성 질병 진행의 생체 지표에 중요한로 설립되었다. 이러한 고도로 정량적 및 비 침습적 분자 핵 촬상 방법은 지역 신경교 증 해상도를 검출한다. 또한, CX3CR1 GFP / + 마우스의 두 광자 공 초점 영상은 세포 해상도 3,4,9,20,23-28와 뇌 미세 아교 세포의 관찰을 허용했다. 그러나이 방법은 심지어 최소 침습 뇌 영상 절차 (29)에 의해 행동을 방해의 잠재적 위험 주어진 장기 만성 소교 변화의 반복 관찰을 제한한다. 또한, 망막 급성 손상 후 생체 내 시각화 직접위한 최적의 조건, 노화에 걸쳐 자신의 본래 중추 신경계의 틈새에서 미세 아교 세포의 반복 모니터링을 제공하며,잠재적으로 만성 신경 퇴행성 질환 중. 따라서, 최근 연구에 촛점 이미지 스캐닝 레이저 검안경 (cSLO) 라이브 CX3CR1 GFP / + 마우스를 적응시킴으로써 GFP를 발현하는 망막 미세 아교 세포의 고해상도 영상의 가능성을 증명했다. 이것은 급성 유도 상해 또는 안구 고혈압 30-36 다음 최대 10 주 동안 개인 마우스의 GFP + 세포 수의 주간 변화를 추적하는 데 사용되었습니다.

우리는 몇 개월 이상 장기 촬상을 수행 한 정량적 형태 계측 분석을 사용하여 소마 크기에 기초하여 미세 아교 세포의 활성의 변화를 추적하기 위해이 방법을 확장 하였다. Somal 크기 CX3CR1-GFP + 9 미세 아교 세포의 생체 내 이미징 수행 피질 슬라이스 개의 광자 공 초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 실험의 미세 아교 세포 활성화의 유용한 메트릭으로 정의 하였다. 이들 및 다른 연구에서도 WH, somal 사이즈 Iba1 단백질 발현 수준 간의 상관 관계를 증명무형 문화 유산도 활성화 9,37 증가한다. 따라서, 활성화 된 미세 아교 세포는 살아있는 마우스에서 확인 될 수 있으며, 그 수 및 분포는 CNS 상태 및 질환의 시간 경과를 모니터링.

이 프로토콜은 cSLO 라이브 이미지 수집 및 분석을위한 방법은 미세 아교 세포 수, 망막 신경절 세포 (RGC) 변성 (그림 1) 동안의 분포와 형태 학적 활성을 모니터링에 대해 설명합니다. 따라서, 본 연구에서는 사용 : 1) 연령에 따라 시신경 및 망막 신경 퇴행 및 겪는 상속 녹내장 (DBA / 2J)의 마우스 모델의 나이 (38, 39)의 5 10개월 사이에서 질병의 진행에 놀라운 변화를 보여주고, 2) 월 장기 망막에 GFP + 세포의 시각화 3-5 개월 세포 인 somata 및 측정을 분리하는 분할 및 임계 3) 라이브 영상 분석 세 이형 Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J 마우스의 무수 시신경에 대한 cSLO 생체 내 이미징적외선 영역입니다. 이러한 전략은 만성 녹내장의 초기 단계에서 망막 미세 아교 활성화 상태의 동역학을 평가하기 위해 적용된다.

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프로토콜

생체 내 이미징은 유타 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 무균 시설에서 수행된다.
참고 :이 영상 프로토콜은 망막 미세 아교 세포 및 침투 단핵구 / 대 식세포가 fractalkine 수용체 궤적 (CX3CR1)의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 기자 마우스에 사용됩니다.

공 초점 주사 레이저 검안경으로 망막 GFP + 미세 아교 세포의 생체 내 이미징 1. (cSLO)

  1. 절차를 수행하는 동안 35 ~ 37 ºC 사이의 마우스 온도를 안정화 세트 물 제어 난방 시스템 켜기, 2 개의 가열 패드를 연결합니다.
    1. 공 초점 주사 레이저 검안경 (cSLO) 시스템 (그림 2A)를 시작합니다. 각각의 마우스를 확인하고 2mm (환자 데이터 메뉴)의 각막 곡률을 설정합니다 정보를 입력, cSLO 프로그램을 엽니 다.
  2. IMA 준비카. 안전하게 소켓에 깨끗한 55º 넓은 필드 대물 렌즈에 맞게. 깨끗한 종이로 덮여 가열 패드를 확보하여 검안경 이미징 플랫폼을 준비합니다. 패드와 용지를 납작하게하고, 대물 렌즈의 이동을 차단하는 그것들을 유지하는 클립을 사용.
  3. 1.3 % 2,2,2- tribromoethanol 0.8 % 급 - 아밀 알콜의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 (250 ㎎ / ㎏ 체중 0.5 ㎖ / 25g 체중) 1ml의 일회용 끼워 30½ G 바늘을 사용하여 주사기. 새장에 마우스를 반환, 가열 패드에 있었다.
    참고 : 흡입에 비해 주사 마취제의 전달 코 콘 튜브의 무료 영상과 눈에 탁 트인 액세스를위한 마우스, 쉽게 배치 할 수 있습니다.
  4. 동물이 이동 중지하고 꼬리 핀치에 응답하지되면 발생하기 쉬운 동물을 배치하고 7 분의 방울과 두 눈을 취재하여, Tropicamide 및 페닐 (0.5 % 각각)와 동공 팽창을 유도한다.
  5. 5 분, P 후최소한의 압력을 적용, 두 눈을 통해 검안경 플랫폼의 중심에 발생하기 쉬운 마우스, 맞는 콘택트 렌즈를 레이스.
    참고 : 집게 대신 40 사용할 수 있지만 콘택트 렌즈는 작고 연약하지만 조심스럽게 손가락으로 처리 할 수 있습니다. 그것은 눈 건조를 최소화하고 영상 중 각막의 투명성을 유지로 콘택트 렌즈의 사용은 선택 사항이지만 권장합니다.
  6. 7 분 후, 플랫폼 (도 2B)의 가장자리 근처 무제한 동물성 유지, 대물 렌즈와 대물 렌즈에 평행 한 궤도 대향 우안으로 마우스의 방향. 비교 채도와 방향의 이미지를 수집하기 위해, 항상 대물 렌즈의 눈으로부터의 거리뿐만 아니라, 세션에 걸쳐 이미징 광 경로에 눈의 정렬을 유지한다. 눈의 관찰을 방해 긴 수염 클립.
    참고 : 다음 8-10 분 동안, 마우스를 이동하거나 점멸, 부드러운 움직임과 의지 호흡하지 않을 것이다콘트라스트가 높은 안저 랜드 마크를 기반으로 스캔 헤드 위치를 조정 cSLO 눈 추적 ART (자동 실시간) 모드에 의해 추적 사항. 그 때 과거, 마우스는 이미지가 허무하게 헥헥 및 점멸하기 시작.
  7. 촬상 콘택트 렌즈를 사용하지 않고 수행되는 경우, PBS가 양쪽 눈으로 건조되는 것을 방지하기 위해 매 2-3 분 방울 적용.
  8. 망막 혈관 및 시신경 유두의 안저 화상을 수집 내측 망막에 초점을 맞추었다.
    1. 적외선 모드 (IR)를 선택하고 820 nm의 여기, 100 % 레이저 파워, 40 % -60 %의 민감도 (그림 2C)로 설정을 조정합니다.
    2. 고속 모드 (12.6 프레임 / 초)에서 작동 검안경을 구동하기 위해 조이스틱을 이용하여 눈의 위치를​​. 저배율에서 부상이나 불투명도의 각막과 렌즈를 검사하고, 망막 (그림 3A)를 이미징 영향을 미칠 것 결함이나 부상으로 연구 눈에서 제외합니다.
    3. 시신경 유두 면적 (의 표면을 찾습니다가까이 눈에 목표를 가져 와서 시신경, 시신경 유두는) 다음의 이미지 중심과 조이스틱을 돌려서이 위치를 잠급니다. 검안경으로 눈이 정렬도 얻을 이미지를 가로 질러 초점을 방출하는 열쇠입니다.
    4. 발굴 된 광섬유를 나타내는 눈 기준 초점면 (59, 60 D) 또는 깊이 (55 D)로서 망막 vitreal 표면 상에 위치 된 주요 혈관을 사용하여, 시신경 유두뿐만 아니라, 망막의 내측 평면을 시각화 디스크. 최적의 초점은 명확하게 구별되는 자신의 루멘과 벽, 주요 혈관 내에서 혈액 세포를 순환 해결해야한다.
    5. 균일 한 밝기의 흰색 할로 (약간의 노출 과다 사용) 시신경 주위 55º 안저 필드의 대부분에 걸쳐까지, 터치 스크린 제어 패널에 다이얼을 조정하여 화상의 채도를 최적화. 다음으로, 주요 혈관을 따라 이동하는 혈액 세포가 분명히 확인할 수있을 때까지 콘트라스트를 최적화하기 위해 채도를 낮추는. 초점 어두운 경우지역되지 인해 망막 손상, 균일하게 밝은 이미지가 얻어 질 때까지 카메라에 눈을 다시 정렬, 지속. 이 조정은 위치와 품질의 이미지의 재현 세트를 캡처하는 데 필수적입니다.
    6. 실시간 30 프레임 (47 프레임 / 초 정규화)를 평균화 (나이에 따라 직경 1.4-1.7 mm)을 중심 망막의 고해상도 IR 이미지 수집 신호 대 잡음비를 개선하기 위해, (도 2D ).
  9. 즉시, GFP + 미세 아교 세포 및 / 또는 시신경 유두 및 망막의 안쪽면에 국소 침윤 단핵구의 형광 화상을 취득.
    주 : 망막의 IR 안저 화상의 최적화 GFP + 세포의 형광 이미지의 해상도뿐만 아니라 내측 스팬 망막의 정도를 결정한다. 혈관의 가난한 해상도를 감지 할 수있는 망막의 안쪽면에 초점을하지 않을 경우, 흐리게 GFP + 세포 뷰 (그림 3B)가 발생합니다. IR 사투를 조정하지 않으면배급은 정확하고 균일하게 GFP + 세포의 강도와 크기 (그림 3C)에서 인공적인 변화를 도입, 형광 이미지 (FA)에 영향을줍니다.
    1. 유지 블루, 488 nm의 레이저 여기 (460-490 nm의 배리어 필터 세트), 및 수집 설정 (100 % 레이저 파워와 100~125% 감도)를 사용하여, 상기 터치 스크린 패널의 촬상 모드 (FA)을 형광하도록 Switch가 아래로 내려가 모든 마우스 (그림 2E)의 정수입니다.
    2. 하나의 XY 점, 망막의 bidimensional 형광 이미지를 수집하고 즉시 동일한 위치에 안저 이미지를 캡처 (100X 스캔 평균, 두 이미지를 55º 스캔 각도도 2 층).
    3. 코 - 시간 축 (그림 2H)에서 망막 패닝, 제어판 (그림 2G)에서 "복합"를 선택하고 검안경을 오른쪽으로 이동 왼쪽으로 다중 이미지를 캡처합니다.
      주 : 단일 XY 포인트 이미지를 스캔 한 후 (100 배의실시간으로 소프트웨어가 자동으로 최적의 스캔, 스캔이 실행할 수없는 경우 빨간색 동안 평균 녹색 원과 접하는 같은 새로운 영역 (새로운 검사) 및 스티치 모든 XY-위치) 평균 수 있습니다. 얻어진 합성 화상이 종축 (X 55º 120-124º 주사 각도)에 수평축 X 3-4mm 1.5-1.7 mm에 걸쳐있다.
  10. 깜박임 운동 다시 시작하기 전에 마취를 유도 한 후 15 분 이내에 각 마우스의 전체 영상.
  11. PBS로 콘택트 렌즈, 수화물 눈을 제거하고 운동의 전체 복구 될 때까지 동작을 확인, 그 예열 케이지에 동물을 반환합니다.
  12. 동일한 개인 마우스에서 간헐적 cSLO 이미징 세션을 사용하여 종 연구의 경우, 마취의 누적 독성뿐만 아니라 각막에 자극을 피하기 위해 더 적은 3 일 간격 이미지를 반복합니다.

2. 라이브 영상 처리 및 분석

  1. 순차 이미지 정렬 :
    1. 정렬랜드 마크로 혈관계 및 광학 디스크를 사용하여 같은 눈의 시계열위한 안저 화상. 상용 슬라이드 쇼 프리젠 테이션 프로그램에서, 자신의 광학 디스크 xy- 평면에 정렬 될 때까지 하나를 전 (상단 이미지를 드래그하면서 반투명 표시), 그때까지 상단 이미지를 회전을 통해 각각의 이미지를 드래그하여 모든 이미지를 열고 그 주요 혈관 (먼 시신경 유두에서 선박에 초점) 아래의 이미지에 혈관과 중복. 각 이미지의 회전 각도를 기록하고 마우스와 눈의 신원을 추적하는 데, 나중에 참조 할 수 있도록이 시계열을 저장합니다.
    2. 각 시점에서 XY 회전을 보정하는 기록 각도인가 래스터 그래픽 에디터 프로그램을 사용하여 단일의 XY 점 형광 화상의 대응하는 일련 맞추고. 또한, 300 (스케일링)없이 dpi의와 배경에 해상도를 조정 (RGB 모드, 레벨 선택과 검은 색으로 혈관의 내강 샘플). 이러한 이미지를 저장TIF 파일로, 자신의 이름으로 "정렬"을 추가.
  2. 소교 세포 분할 :
    1. FluoRender에서 열린 중앙 망막에 이른 시점 / 연령에 해당하는 "정렬"TIF 파일을 GFP + 세포를 식별합니다. 화면에 맞게 이미지를 확대 한 다음 (숨기기 볼과 RG 채널 모두를 선택, 렌더링 뷰 (복합, 직교는, 보간)과 속성 (0.58 감마, 255 포화 점, 255 휘도, 195 알파 1.00 음영)을 정의 두 번 클릭하여 작업 공간 프레임을하여 B 채널도 4A).
    2. 상수 높은 임계 값을 유지하면서 세포의 대부분은, 최소한의 중복 및 세포 프로세스 (시안) (흰색)을 마스크 때까지 낮은 임계 값을 증가시켜, (작업 공간 프레임에 강조해야 함) 개별 셀, 임계 빨강 채널을 선택하려면 (255). 낮은 임계치는 형광 강도 (도 4B <에 따라, (100) 및 (170) 사이에서 변화/ STRONG>).
    3. 원래 이름 (그림 4C)에 "cellsegm"을 추가, 새로운 TIF 파일로 볼 수 빨강 채널 만 (캡처 명령)이보기를 저장합니다. 일반 래스터 그래픽 편집기 소프트웨어를 사용하여, 자사의 그레이 스케일을 반전 상기와 같이 300 DPI에 해상도를 조정하고, RGB (그림 4D)로 다시 저장합니다.
      참고 : 자동 FluoRender에 의해 생성 된 폴더 (프로젝트)를 삭제하고, 나중에 참조 할 수 있도록 적용 임계 값을 저장합니다.
  3. 미세 아교 소마 세분화 및 형태 계측 :
    1. 영역 부량 GFP + 세포 인 somata를 식별하기 위해 자동화 된 세기 측정과 임계 기능뿐만 아니라, 임계 값 기반 객체 카운팅 및 측정과 이미지 분석 소프트웨어를 사용한다. "cellsegm"TIF 파일을 열고 스케일링 방법 (스플라인)과 빨강 채널을 선택 RGB (빨간색 탭을 클릭합니다). "색에보기 채널"을 선택 취소하여 시각화 개선 (빨간색 RG를 마우스 오른쪽 단추로 클릭B 탭) 및 "색상을 보완"을 선택 (이미지 / 그레이 스케일을 반전 흰색 배경 (그림 4E) 위에 검정색 / 회색 세포를 볼 수) 이미지를 조정합니다.
    2. 전체 이미지 (교정, 빠른 교정)을 가로 지르는 수평선을 그려, 나이에 따라 1.4-1.7 mm로 이미지를 보정합니다.
    3. 강도 임계 값 (그림 4B)을 적용하여 세그먼트 개별 세포 인 somata. 이를 위해, 빨간색 RGB 채널 작업과는 임계 강도 기능을 엽니 다 (객체 개수; "카운트 업데이트"명령을 선택) 개별 인 somata을 나타내는이자 (ROI)의 각 임계 된 지역 bidimensional 매개 변수를 추적하기 위해.
    4. 255 레벨 중 낮은 50~60% 선택 시각적 임계 색 마스크 (청색) 및 셀 소마 경계 (회색)에서 서로 중첩을 평가하여 최종 임계치 값을 정제하여, 휘도 히스토그램의 강도 임계치를 정의 각 셀 (Figure 4E).
    5. 측정은 10 % 미만 (이진 툴바 및 주석이 측정 값을 사용하여)을 다른 경우 10 세포에서 분할 전 면적을 측정하여 이후 somal 치수를 나타내며, 상기 선택된 임계 값 범위를 사용할 셀 소마 마스크의 정밀도를 추정한다.
    6. 수동으로 여러 셀을 포함하고 직접 세포 (그림 4 층)를 시각화하는 바이너리를 ON / OFF 전환하면서 이러한 요소 (이진 도구 모음 컨트롤, 또는 개체 카탈로그를 사용하여 제거하거나 별도의 ROI) 분리 somal의 ROI를 식별.
    7. somal 영역이 크고보다 작은 50 ~ 60 μm의 2가 활성화 된 미세 아교 세포에 해당하는 세포 인 somata를 차별 및 면적 제한을 사용하여, 각각 미세 아교 세포를 비활성화 할 수와 로아와 같은 미세 아교 세포를 분류.
      참고 : 각 셀 somal 부분 집합이 다른 모조 착색 이진 층으로 식별하고, 또한 다른 형태 학적 매개 변수에 대한 특징으로 할 수있다 (perime터, 원형 등)뿐만 아니라 이산 망막 섹터 (도 4G) 내에서 정량화. ND2 파일로 분석 된 이미지를 저장합니다.
    8. somal 마스크 및 단일 XY N'- 포인트 이미지를 오버레이하여 개별 활성 소교 세포에서 처리 및 분기 복잡성을 확인 (도 4H 대비 50 % 증가). 수동으로 직접 셀 소마에서 연장 프로세스를 계산 또는 아버 (이진 도구 모음 및 주석이 측정을 사용)를 포괄하는 다각형의 직경을 측정한다.
      주 : 활성 세포 프로세스 부족 또는 몇 베어 (<4) 및 짧은 (<2 배 somal 직경)들, 분지 및 광범위한 아버를 포함 비활성 셀 공정 대조적 (> 3-10x somal 직경) 비교적 그들의 주변 작은 소마.
    9. 따라서 수동에 의해 검출되지되는 검출 한계 아래 인 somata 미만 <20 ㎛의 2 및 / 또는 GFP 발현으로 세포를 식별긴장의 임계. 수동으로 식별 요소를 계산하는 주석의 분류 명령을 사용하십시오.

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결과

우리의 최근 생체 내에서 연구 시각화하고 늦게 신경 퇴행 59 만성 녹내장과의 관계의 초기 단계 반응 속도와 시신경 유두와 망막 미세 아교 변화의 패턴을 추적하는이 라이브 이미지 수집 및 분석 방법을 사용했다. 여기에서 우리는 개인의 젊은 이형 Cx3CR1-GFP의 DBA / 2J 망막의 중심 망막 (그림 5)의 넓은 지역에 걸쳐 미세 아교 세포를 시각화하는 cSLO 영상 획득 프로토콜?...

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토론

신경 퇴행성 질환 중 소교 세포의 수와 활성 형태의 실시간 모니터링은 세포 기능의 상세한 시각화를 허용 비 침습성 영상화 방법의 사용을 요구한다. 촬상 후, 소교 세포는 미세 아교 세포의 활성화를위한 판독 somal 같은 크기 및 / 또는 공정의 복잡성을 평가하기 위해 여러 단계의 임계치를 이용하여 형태 학적 분석을 위해 (분단) 고립되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 cSLO를 사용하여 라이...

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ miceThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 and 00582Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringeBD, East Rutherford, NJ305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tabletsSigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 and P4417Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/PumpGaymar Industries, Orchard Park, NYTP-650
Cotton-tipped applicatorsFisher Scientific, Pittsburgh, PA23-400-100
Tropicamide 1%Bausch & Lomb, Rochester, NYNDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick centerCantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UKG003709Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer softwareHeidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CAVersion 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Redmond, WAVersion 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, San Jose, CAVersion CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, University of UtahVersion 2.13Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Melville, NYVersion 4.30.01

참고문헌

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  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
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