In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Resumo

Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.

Resumo

A microglia, que são células do SNC neuroimunes residentes, transformar a sua morfologia e tamanho em resposta à lesão do SNC, a mudança para um estado activado com funções distintas e perfis de expressão de gene. Os papéis de ativação microglial na saúde, ferimentos e doenças ainda permanece incompreendida, devido à sua regulamentação dinâmico e complexo em resposta a mudanças no seu microambiente. Assim, é essencial monitorizar de forma não invasiva e analisar as alterações na activação da microglia ao longo do tempo no organismo intacto. Estudos in vivo de ativação microglial ter sido adiada por limitações técnicas ao comportamento microglial rastreamento sem alterar o ambiente CNS. Isso tem sido particularmente desafiador durante a neurodegeneração crónica, onde as mudanças de longo prazo devem ser rastreadas. A retina, um órgão do SNC passíveis de imagens ao vivo não-invasiva, oferece um sistema poderoso para visualizar e caracterizar as dinâmicas da activação da microglia durante a desordens crónicas.

a imagem in vivo de microglia da retina, utilizando oftalmoscopia confocal (cSLO) e CX3CR1 ^GFP ratos ^{/ +} repórter, para visualizar microglia com resolução de celular. Além disso, nós descrevemos métodos para quantificar as mudanças mensais de ativação celular e densidade em grandes subconjuntos de células (200-300 células por retina). Confirmamos o uso da área Somal como uma métrica útil para o rastreio ao vivo da ativação microglial na retina através da aplicação de morfometria baseada no limiar automatizada de imagens in vivo. Nós usamos estes aquisição de imagem ao vivo e analisa estratégias para monitorar as mudanças dinâmicas na ativação microglial e microgliose durante as fases iniciais de neurodegeneração da retina em um mouse modelo de glaucoma crônico. Esta abordagem deve ser útil para investigar as contribuições de microglia para declínio neuronal e axonal em doenças crônicas do sistema nervoso central que afetam a retina eo nervo óptico.

Introdução

A microglia são células neuroimunes que reside exclusivamente no sistema nervoso central (SNC) dado que o desenvolvimento embrionário inicial e durante a vida adulta. Equipado com um complexo repertório de receptores, atividade microglial e heterogeneidade regional são regulamentados pela sua interacção bidireccional com os neurônios vizinhos, glia, barreira hemato-encefálica e infiltração de células neuroinflamatórias ^1,2. Funções microgliais basais contribuem para a manutenção e reparação fisiológica, uma vez que provar seu território para perturbações na homeostase ^3,4. Durante lesão ou doença do SNC, microglia são os primeiros a responder aos sinais neuronais que então desencadeiam a sua transição para um fenótipo reativa, denominado "microglia ^2,5-7 ativado. Ativação Microglia envolve um ciclo intrincado da expressão do gene e da proteína, que são acoplados a soma celular e processo de redimensionamento e remodelação ^6-9. Activação da microglia, bem como células e redistribuiçãoaglomeração, pode ser acompanhada pelo aumento global local no número de células (denominada microgliose). Isto pode resultar de proliferação celular e de auto-renovação, com ou sem o recrutamento de monócitos sanguíneos derivados de ^3,4,7,10-14. Em uma ampla gama de doenças crónicas do SNC, dependentes da idade, sustentada microgliose e ativação da microglia doença paralelo progressão ^15-19. Como microglia impacto neurodegeneração permanece obscuro, principalmente porque eles jogam ambos os papéis neuroprotectoras e deletérios que podem ter diversas contribuições para o início da doença e progressão. Estudos de imagem ao vivo que visam a compreensão de doenças crônicas CNS têm monitorado o comportamento microglial no sistema nervoso central danificada de modelos animais e seres humanos, e demonstrou que alterações microgliais são detectáveis ​​início em fases precoces da doença ^15-17,19,20. Assim, é crítico para o desenvolvimento de abordagens para detectar e monitorizar a activação da microglia in vivo.

Dete não-invasivocção de mudanças regionais na ativação da microglia cérebro foi estabelecido como um importante indicador de vivo de progressão da doença neurodegenerativa, usando a imagem latente molecular ou bioluminescência e tomografia por emissão de pósitrons ou ressonância magnética ^18,21,22. Estes métodos de imagem molecular e nuclear altamente quantitativos e não-invasivos detectar gliosis com resolução regional. Alternativamente, dois fótons de imagem confocal em CX3CR1 ^{GFP / +} ratinhos permitiu a observação de microglia do cérebro com resolução celular ^{3,4,9,20,23-28.} No entanto, esta abordagem limita a longo prazo e observação repetida de alterações microgliais crônicas, dado o risco potencial de perturbar o seu comportamento por meio de procedimentos de imagem cerebral, ainda que minimamente invasivos ^29. Alternativamente, a retina oferece as condições ideais para a visualização direta, em vivo e monitoramento repetida de microglia em seu nicho CNS intacta durante todo o envelhecimento, após a lesão aguda, epotencialmente durante doenças neurodegenerativas crónicas. Assim, estudos recentes têm demonstrado a viabilidade de imagem de alta resolução de microglia da retina que expressam GFP através da adaptação do oftalmoscópio de varredura confocal laser (cSLO) a imagem ao vivo CX3CR1 ^{GFP / +} camundongos. Este foi usado para controlar as alterações semanais em números GFP + células em ratinhos individuais por até 10 semanas após a lesão induzida de forma aguda ou hipertensão ocular ^30-36.

Nós estendemos essa abordagem para realizar imagem de longo prazo ao longo de vários meses, e quantitativamente acompanhar as mudanças na ativação da micróglia com base no tamanho soma usando análises morfométricas. Tamanho Somal foi definida como uma métrica útil da activação da microglia, em estudos de imagem ao vivo utilizando dois fotões microscopia confocal em fatias corticais para executar imagiologia in vivo de CX3CR1-GFP + microglia ^9. Estes e outros estudos também demonstraram a correlação entre o tamanho Somal e os níveis de expressão da proteína Iba1, which também aumenta com a activação ^9,37. Assim, a microglia activada pode ser identificado em ratinhos vivos, e os seus números e de distribuição monitorizada ao longo do tempo durante a saúde e doença do SNC.

Este protocolo descreve métodos para cSLO aquisição e análise de imagens ao vivo para monitorizar o número de células microgliais, distribuição e morfologia durante a activação de células ganglionares (RGC) degeneração da retina (Figura 1). Assim, este estudo utiliza: 1) um modelo de mouse glaucoma herdado (DBA / 2J) que sofre nervo óptico dependente da idade e neurodegeneração da retina e mostra variabilidade notável na progressão da doença entre 5 e 10 meses de idade ^38,39, 2) mensal cSLO imagiologia in vivo para a visualização de longo prazo de células GFP + na retina e nervo óptico não mielinizadas de heterozigotos CX3CR1 ^{GFP / +} DBA / 2J com idade de 3-5 meses, 3) análise de imagens ao vivo por segmentação e limiar para isolar células e medida somata aIR área. Essas estratégias são aplicados para avaliar a cinética de activação da microglia da retina estados durante os estágios precoces de glaucoma crónico.

Protocolo

Imagem in vivo é realizado em instalações isentos de agentes patogénicos usando protocolos aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso do animal Institucional na Universidade de Utah.
NOTA: Este protocolo de imagem é usado para ratinhos repórter em que a microglia da retina e monócitos / macrófagos que se infiltram expressar a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do locus do receptor de fractalcina (CX3CR1).

1. In vivo de imagens de Retinal GFP + Microglia por laser confocal Ophthalmoscopy (cSLO)

1. Ligue o sistema de aquecimento controlado por água, ajustado para estabilizar a temperatura rato entre 35-37 ºC durante o procedimento, e conectar duas almofadas de aquecimento.
   1. Inicie o sistema confocal oftalmoscópio de varredura a laser (cSLO) (Figura 2A). Abra o programa cSLO, digite as informações que irá identificar o rato individual e definir uma curvatura corneana de 2 mm (menu de Dados do Paciente).
2. Prepare-se para imaGing. Firmemente caber uma lente objetiva de 55º de campo amplo limpa em seu soquete. Prepare a plataforma de imagem oftalmoscópio, garantindo uma almofada de aquecimento coberta com papel limpo. Use grampos para achatar o bloco de papel e mantê-los de bloquear o movimento da lente objectiva.
3. Anestesiar o rato por injecção intraperitoneal de 1,3% de 2,2,2-tribromoetanol e 0,8% de álcool terc-amílico (250 mg / kg de peso corporal; 0,5 ml / 25 g de peso corporal) com uma agulha de 30½ L equipado com um 1 ml descartável seringa. Retorno do mouse para sua gaiola, mantidos sobre uma almofada de aquecimento.
   NOTA: A entrega do anestésico por injecção contra inalação permite fácil posicionamento do mouse para a imagem latente eo acesso sem obstáculos aos olhos, livre de hastes e tubos.
4. Uma vez que o animal pára de se mover e não responde a cauda pitada, induzir a dilatação da pupila com Tropicamida e fenilefrina (0,5% cada), posicionando o animal propenso e cobrindo ambos os olhos com as gotas para 7 min.
5. Após 5 min, pate o mouse de bruços no centro da plataforma oftalmoscópio, e as lentes de contato se ajustar ao longo ambos os olhos, aplicando pressão mínima.
   NOTA: As lentes de contato são pequenos e frágeis, mas podem ser tratadas com cuidado com os dedos, embora fórceps pode ser usado em vez ^{de 40.} O uso de lentes de contato é opcional, mas recomendado, pois minimiza a secura dos olhos e preserva a transparência da córnea durante o exame.
6. Após 7 min, orientar o rato com o olho direito voltado para a lente objectiva e a órbita paralela à lente objectiva, mantendo o animal desenfreada perto da borda da plataforma (Figura 2B). Para a coleta de imagens de saturação e orientação comparável, manter constantemente a distância do olho para lentes objetivas, bem como o alinhamento do olho para o caminho da luz em toda sessões de imagem. Clipe longos bigodes que interferem com a observação do olho.
   NOTA: Para a próxima 8-10 min, o mouse não irá mover ou piscar, e vai respirar com movimento suavementos, que são rastreados pelo cSLO Eye Tracking ART modo (automático tempo real), que ajusta a posição da cabeça de digitalização com base em pontos de referência de fundo de olho com alto contraste. Passado esse tempo, os ratos começam a arfando e piscando, tornando impraticável imagem.
7. Se formação de imagens é realizada sem a utilização de lentes de contacto, aplicar gotas de PBS para ambos os olhos cada 2-3 min para impedi-los de secagem.
8. Coletar uma imagem fundo da vasculatura da retina e disco óptico, com foco na retina interna.
   1. Escolha do modo de infravermelhos (IR) e ajustar as configurações a 820 nm de excitação, 100% da potência do laser, 40-60% de sensibilidade (Figura 2C).
   2. Trabalhando em modo de alta velocidade (12,6 frame / seg), localize o olho usando o joystick para conduzir o oftalmoscópio. Em baixa ampliação, inspecionar a córnea eo cristalino por lesão ou opacidade, e excluir os olhos de estudo com defeitos ou danos que afetarão imagem da retina (Figura 3A).
   3. Localizar a área do disco óptico (a superfície dea cabeça do nervo óptico, ONH), trazendo o objectivo mais perto do olho, em seguida, centrar a imagem sobre ela e bloquear esta posição, enroscando o joystick. Este alinhamento do olho para o oftalmoscópio é a chave para obter até mesmo se concentrar e emissão através da imagem.
   4. Visualizar os planos internos da retina, bem como o ONH, utilizando os principais vasos sanguíneos localizados na superfície vítrea da retina como um plano de referência focal (59 e 60 D), ou mais profundo (55 D) nos olhos mostrando escavado óptica discos. O foco ideal deve resolver células circulantes no sangue dentro de grandes vasos sanguíneos, com sua luz e paredes que são claramente distintos.
   5. Otimizar saturação da imagem, ajustando a marcação do painel de controle da tela de toque, até que um halo branco de iluminação uniforme se estende na maior parte do campo 55º fundo de olho em torno do disco óptico (usando ligeira superexposição). Em seguida, abaixe a saturação para otimizar o contraste até que as células do sangue que se deslocam ao longo dos grandes vasos pode ser claramente resolvido. Se escuro focaláreas persistirem, não devido a danos na retina, realinhar o olho para a câmera até que a imagem é obtida uniformemente brilhante. Este ajustamento é fundamental para capturar reprodutíveis conjuntos de imagens em posição e qualidade.
   6. Recolha uma imagem IR de alta-resolução da retina central (1,4-1,7 mm de diâmetro, dependendo da idade), uma média de 30 imagens em tempo real (4,7 quadros / seg; normalizado), para melhorar a relação sinal-para-ruído (Figura 2D ).
9. Imediatamente, adquirir uma imagem de fluorescência de GFP + microglia e / ou infiltração de monócitos localizadas nos planos interiores da retina e a ONH.
   NOTA: Optimização da imagem IR fundo da retina determina a resolução da imagem de fluorescência de GFP + células, bem como a extensão da retina interna calibrados. A falta de foco nos planos internos da retina, que pode ser detectada por má resolução da vasculatura, resultará em GFP + células vistas esmaecidos (Figura 3B). A falha em ajustar IR saturação correcta e uniforme afeta a imagem de fluorescência (FA), apresentando variações de artefatos em GFP + intensidade célula e tamanho (Figura 3C).
   1. Swich a fluorescência modo de imagem (FA) no painel de tela sensível ao toque, usando o azul, 488 nm de excitação laser (460-490 nm conjunto filtro de barreira), e as configurações de aquisição (100% de potência do laser e 100-125% de sensibilidade), que são mantidos constante para todos os ratinhos (Figura 2E).
   2. Coletar uma imagem bidimensional de fluorescência da retina único ponto-xy, e imediatamente capturar uma imagem de fundo de olho na posição idêntica (100x média de digitalização; 55º ângulo de leitura para ambas as imagens; Figura 2F).
   3. Capturar uma imagem de multiponto, selecionando "composto" no painel de controle (Figura 2G) e movendo-se o direito oftalmoscópio e à esquerda, deslocar a retina ao longo do eixo nasal-temporal (Figura 2H).
      Nota: Após uma única imagem de xy ponto-digitalizar (100x spode calcular a média), o software automaticamente médias novos scans da mesma e de novas áreas (circunscritas com um círculo verde durante a digitalização ideal, ou vermelho quando a verificação é inviável), e todos os pontos-posições xy em tempo real. A imagem composta resultante abrange 1,5-1,7 mm no eixo horizontal x 3-4 mm no eixo vertical (55º x 120-124º ângulo de leitura).
10. Imagem completa de cada rato dentro de 15 minutos após a indução da anestesia, antes de piscar e movimento é reiniciado.
11. Retirar as lentes de contato, hidrato olhos com PBS e devolver o animal para sua gaiola aquecida, verificando o comportamento até a recuperação completa da mobilidade.
12. Para os estudos longitudinais usando sessões intermitentes cSLO-imagem no mesmo ratinho individual, repetir imagiologia não menos de 3 dias de intervalo, para evitar a toxicidade cumulativa de anestesia, assim como a irritação da córnea.

2. Ao vivo Processamento de Imagem e Análise

1. Sequential alinhamento de imagem:
   1. Alinharas imagens de fundo de olho para uma série cronológica do mesmo olho usando a vasculatura e disco óptico como pontos de referência. Abra todas as imagens em um programa de apresentação slide-show comercial, arrastando cada imagem sobre o anterior até que seus discos óticos alinhar no plano XY (a imagem aparece top semi-transparente, sendo arrastados), e depois gire o topo até à sua imagem vasos sanguíneos principais sobrepõem-se com o sistema vascular na imagem abaixo (foco em navios mais distante a partir do disco óptico). Grave o ângulo de rotação para cada imagem e salvar esta série temporal para referência futura, mantendo o controle de mouse e olho identidade.
   2. Alinhar a correspondente série de imagens de fluorescência de ponto único xy, aplicando o ângulo gravado para corrigir a rotação XY em cada ponto de tempo, usando um programa de edição gráfico de varredura. Além disso, ajustar a resolução para 300 dpi (sem redimensionamento) e fundo (no modo RGB, selecione Níveis e provar o lúmen de um vaso sanguíneo como preto). Guarde estas imagenscomo arquivos TIF, acrescentando que "alinhado" aos seus nomes.
2. Segmentação de células microgliais:
   1. Para identificar GFP + células da retina central, aberto em FluoRender o "alinhado" arquivo TIF correspondente ao mais antigo ponto de tempo / idade. Ampliar a imagem para caber na tela, em seguida, definir a visão Render (composto, ortogonal, interpolados) e suas propriedades (0,58 gama, 255 ponto de saturação, luminância 255, 195 alfa e 1,00 sombreamento), a seleção de ambos os canais RG como visível (esconder B canal por duplo clique sobre ele no quadro Workspace; Figura 4A).
   2. Para selecionar células individuais, de limiar do canal vermelho (deve ser realçado no quadro Workspace), através do aumento do limiar baixo até que a maioria das células são mascarados (branco) com processos de sobreposição e celulares mínimos (ciano), mantendo o limite de alta constante (255). O valor de limiar baixo varia entre 100 e 170, dependendo da intensidade de fluorescência (Figura 4B </ Strong>).
   3. Salve esta visão com o canal vermelho visível apenas (comando Capture) como um novo arquivo TIF, acrescentando que "cellsegm" ao seu nome original (Figura 4C). Usando um software genérico raster editor gráfico, inverter a sua escala de cinzentos e ajustar a resolução para 300 dpi como acima, e salvar novamente como RGB (Figura 4D).
      NOTA: Elimine as pastas (projetos) automaticamente criada por FluoRender, e salvar o limiar aplicado para referência futura.
3. Segmentação soma microglial e morfometria:
   1. Para identificar GFP + somata celular para quantificação de área, use software de análise de imagem com medições automatizadas de intensidade e capacidades de limiar, bem como à base de limite de contagem de objetos e de medição. Abra o arquivo TIF "cellsegm", e selecione o método de escala (ranhura) e o canal vermelho (clique na guia vermelho em RGB). Melhorar a visualização, desmarcando "vista canal de cor" (clique com o RG vermelhoGuia B), e selecionando "complementar cores" (Imagem / Ajustar Imagem) para inverter a escala de cinzentos e ver as células em cinza / preto sobre o fundo branco (Figura 4E).
   2. Calibre a imagem para 1,4-1,7 mm, dependendo da idade, desenhando uma linha horizontal por toda a imagem (Calibração, Calibração Rápida).
   3. Segmento somata célula individual através da aplicação de intensidade de limiar (Figura 4B). Para isso, o trabalho sobre o canal RGB vermelho e abrir a função de limiar de intensidade (Contagem de objetos; selecionando comando "update contagem"), a fim de controlar os parâmetros bidimensionais para cada região thresholded de interesse (ROI) representando somata individual.
   4. Definir o limite de intensidade no histograma intensidade, selecionando o menor 50-60% dos níveis de 255, e refinar o valor final limiar por avaliar visualmente a sobreposição entre a máscara de cor limiar (azul) e do perímetro soma célula (cinza) em células individuais (Figura 4E).
   5. Estimar a precisão das máscaras soma célula para representar as dimensões Somal medindo a área antes e depois de segmentação em 10 células e aceitar o intervalo limite selecionado se as medidas diferem menos de 10% (use a barra de ferramentas binário e Medidas anotadas).
   6. Identificar manualmente ROIs Somal que incluem várias células e separar esses elementos (eliminar ou ROIs separadas usando os controles da barra de ferramentas binário, ou o Catálogo Object), enquanto alternar on / off do binário para visualizar diretamente as células (Figura 4F).
   7. Classificar células microgliais como ROIs com áreas Somal maior e menor do que 50-60 mm ² para discriminar somata célula correspondente a microglia ativada e desativada microglia respectivamente, usando zona de restrição.
      NOTA: Cada subconjunto Somal célula é identificada com uma camada de binário pseudocolored diferente, e podem ser adicionalmente caracterizados por outros parâmetros morfológicos (perimeter, circularidade, etc.), bem como quantificados no âmbito de sectores da retina discretos (Figura 4G). Salve a imagem analisada como um arquivo ND2.
   8. Verifique se o processo de ramificação e complexidade nas células microgliais ativadas individuais, através da sobreposição da máscara Somal ea imagem -ponto único xy (contraste aumentou 50%; Figura 4H). Contar manualmente os processos que se estendem diretamente do celular ou soma medir o diâmetro do polígono que abrange o mandril (use a barra de ferramentas binário e Medidas anotadas).
      NOTA: Activado células possuem processos ou suportar poucos (<4) e curto ( 3-10x diâmetro Somal) que circunda a sua relativamente pequena soma.
   9. Identificar manualmente células com somata menor do que ^<2 20 um e / ou expressão de GFP abaixo do limite de detecção, os quais são, por conseguinte, sem ser detectado por emthresholding intensidade. Use o comando Taxonomia em Anotações para contar elementos identificados manualmente.

Resultados

Nossos recente estudos in vivo utilizado aquisição e análise de imagens ao vivo esses métodos para visualizar e controlar a cinética e padrões de ONH e mudanças microgliais da retina durante as fases iniciais do glaucoma crônico e sua relação com a tarde neurodegeneração ^59. Aqui, ilustramos um protocolo de aquisição de imagem cSLO para visualizar as células microgliais através de uma grande área da retina central em jovens individuais heterozigotos CX3CR1-GFP DBA / 2J retina

Discussão

Monitorização vivo do número de células da microglia e activação morfológica durante uma doença neurodegenerativa requer a utilização de métodos de imagem não invasivos que permitem a visualização detalhada das características celulares. Depois de imagem, as células microgliais deve ser isolado (segmentado) para análises morfométricas pelo uso de múltiplos passos de limite para avaliar o tamanho Somal e / ou a complexidade do processo de leituras para a ativação da micróglia. Neste protocolo, descr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	000671 and 00582	Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe	BD, East Rutherford, NJ	305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T48402, 152463 and P4417	Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump	Gaymar Industries, Orchard Park, NY	TP-650
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	23-400-100
Tropicamide 1%	Bausch & Lomb, Rochester, NY	NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center	Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK	G003709	Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software	Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA	Version 1.7.1.0
PowerPoint	Microsoft, Redmond, WA	Version 14.4.3
Adobe Photoshop	Adobe, San Jose, CA	Version CS3
FluoRender	Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah	Version 2.13	Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C	Nikon, Melville, NY	Version 4.30.01