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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose sind zentrale Antworten auf chronische Neurodegeneration. Hier stellen wir Verfahren zur in-vivo-Langzeit-Visualisierung der Netzhaut CX3CR1-GFP + Mikroglia-Zellen durch konfokale Ophthalmoskopie und zum Schwellenwert und morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung von deren Aktivierung. Wir überwachen Mikroglia Veränderungen während der frühen Stadien der altersbedingten Glaukom.

Zusammenfassung

Mikroglia, die CNS-Resident neuroimmune Zellen sind, verwandeln ihre Morphologie und Größe in Reaktion auf ZNS-Schäden, die Umstellung auf einen aktivierten Zustand mit unterschiedlichen Funktionen und Genexpressionsprofilen. Die Rolle der Mikroglia-Aktivierung in den Bereichen Gesundheit, Verletzungen und Krankheiten bleiben unvollständig aufgrund ihrer dynamischen und komplexen Regulation in Reaktion auf Veränderungen in ihrer Mikroumgebung zu verstehen. Daher ist es entscheidend, nicht invasiv überwachen und Änderungen Mikroglia-Aktivierung über die Zeit im intakten Organismus zu untersuchen. In-vivo-Studien der Mikroglia-Aktivierung durch technische Einschränkungen, um Tracking-Mikroverhalten, ohne die Umwelt CNS verzögert. Dies hat eine besondere Herausforderung gewesen, während der chronischen Neurodegeneration, in denen langfristige Veränderungen müssen verfolgt werden. Die Netzhaut, ein CNS Orgel zu nicht-invasiven Live-Bildgebung zugänglich und bietet ein leistungsfähiges System zur Visualisierung und Charakterisierung der Dynamik der Mikroglia-Aktivierung bei chronischen Erkrankungen.

in vivo-Abbildung von Netzhaut Mikroglia, mittels konfokaler Ophthalmoskopie (cSLO) und CX3CR1 GFP / + Reporter Mäusen zu Mikroglia mit zellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Außerdem beschreiben wir Methoden, um monatlich Änderungen der Zellaktivierung und Dichte in großen Zell-Untergruppen (200-300 Zellen pro Retina) zu quantifizieren. Wir bestätigen den Einsatz von Somal Bereich als nützliches Maß für Live-Tracking von Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut durch die Anwendung automatisierter Schwelle basierte morphometrische Analyse von in vivo Bilder. Wir nutzen diese Live-Bildaufnahme und analysiert Strategien, um die dynamischen Veränderungen in Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose während frühen Stadien der Netzhautdegeneration in einem Mausmodell für chronische Glaukom zu überwachen. Dieser Ansatz sollte sinnvoll, die Beiträge der Mikroglia zu neuronalen und axonalen Rückgang der chronischen ZNS-Störungen, die die Netzhaut und Sehnerv beeinträchtigen untersuchen.

Einleitung

Mikroglia Neuroimmun-Zellen, die ausschließlich in dem Zentralnervensystem (ZNS) gespeichert sein, da die frühe embryonale Entwicklung und im Erwachsenenalter. Ausgestattet mit einem komplexen Repertoire von Rezeptoren sind Mikroglia-Aktivität und regionale Heterogenität ihrer bidirektionalen Wechselspiel mit dem benachbarten Neuronen, Glia, Bluthirnschranke und Infiltrieren neuroinflammatory Zellen 1,2 geregelt. Basal Mikroglia-Funktionen tragen zur physiologischen Wartung und Reparatur, da sie probieren ihr Gebiet für Störungen in Homöostase 3,4. Während CNS Verletzungen oder Erkrankungen, sind Mikroglia die Ersthelfer zu neuronalen Signale, die dann ausgelöst werden den Übergang zu einer reaktiven Phänotyp, als "aktivierte Mikroglia 2,5-7. Mikroglia-Aktivierung beinhaltet einen komplizierten Zyklus von Gen- und Proteinexpression, die Zelle soma und Prozessgrößenänderung und Umbau 6-9 gekoppelt sind. Mikroglia-Aktivierung sowie Zellverteilung undClustering kann die lokale Erhöhung der gesamten Anzahl der Zellen (bezeichnet als Mikrogliose) begleitet werden. Dies kann von Zellproliferation und Selbsterneuerung, mit oder ohne Einstellung von Blut abgeleiteten Monozyten 3,4,7,10-14 führen. In einer breiten Palette von altersabhängig, chronische Erkrankungen des ZNS, anhalt Mikrogliose und Mikroglia-Aktivierung parallel zur Krankheitsprogression 15-19. Wie Mikroglia Auswirkungen Neurodegeneration, bleibt unklar, vor allem weil sie sowohl neuroprotektive und schädlichen Rollen, die vielfältigen Beiträge zur Krankheitsbeginn und Verlauf haben können, zu spielen. Live-Imaging-Studien zu verstehen, chronische ZNS-Erkrankung ausgerichtet haben Mikroglia-Verhalten in der geschädigten ZNS von Tiermodellen und Menschen überwacht und nachgewiesen, dass Mikroglia Veränderungen nachweisbar sind zu Beginn in einem frühen Krankheitsstadien 15-17,19,20. Daher ist es entscheidend, Ansätze zu erkennen und zu überwachen Mikroglia-Aktivierung in vivo zu entwickeln.

Nicht-invasive detection regionaler Veränderungen in der Hirn Mikroglia-Aktivierung wurde als ein wichtiger Indikator für die in vivo neurodegenerative Krankheitsprogression festgelegt, mit der molekularen Bildgebung oder Biolumineszenz und Positronenemissionstomographie oder Magnetresonanztomographie 18,21,22. Diese hoch quantitative und nicht-invasive molekulare und nukleare bildgebende Verfahren zu erkennen Gliose mit regionalen Auflösung. Alternativ hat Zwei-Photonen-konfokale Bildgebung in CX3CR1 GFP / + Mäusen, die Beobachtung der Gehirn Mikroglia mit zellulärer Auflösung 3,4,9,20,23-28 erlaubt. , Begrenzt jedoch dieser Ansatz langfristige und wiederholte Beobachtung von chronischen Mikro Änderungen angesichts der potenziellen Gefahr von ihr Verhalten sogar minimal-invasiven bildgebenden Verfahren 29 zu stören. Alternativ kann die Netzhaut bietet optimale Voraussetzungen für direkte, in vivo Visualisierung und wiederholte Überwachung von Mikroglia in ihrer intakten ZNS Nische ganz Alterung, nach einer akuten Verletzung, undmöglicherweise bei chronischen neurodegenerativen Erkrankungen. So haben neuere Studien die Machbarkeit der hochauflösenden Abbildung von Netzhaut Mikroglia, die GFP durch Anpassung der konfokalen Scanning Laser Ophthalmoskopie (cSLO) an image Live CX3CR1 GFP / + Mäusen nachgewiesen. Dies wurde verwendet, um Veränderungen in wöchentlichen GFP + Zellzahlen in einzelnen Mäusen für bis zu 10 Wochen Spurfolge akut induzierten Verletzung oder Augenhypertension 30-36.

Wir haben diesen Ansatz erweitert, um langfristige Bildgebung über mehrere Monate durchzuführen, und quantitativ Veränderungen in Mikroglia-Aktivierung auf Basis von soma Größe unter Verwendung morphometrische Analyse verfolgen. Somal Größe wurde als nützliche Metrik der Mikroglia-Aktivierung in Live-Imaging-Studien unter Verwendung von Zwei-Photonen-konfokale Mikroskopie in Rindenscheiben in vivo Bildgebung von CX3CR1-GFP + Mikroglia 9 durchführen definiert. Diese und andere Studien zeigten auch die Korrelation zwischen Somal Größe und die Höhe der Iba1 Proteinexpression, which auch steigt mit Aktivierungs 9,37. Somit können aktivierte Mikroglia im lebenden Mäusen identifiziert werden, und deren Anzahl und Verteilung über die Zeit überwacht während CNS Gesundheit und Krankheit.

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur cSLO Livebildaufnahme und Analyse auf Mikroglia-Zellzahlen, die Verteilung und morphologischen Aktivierung während der retinalen Ganglienzellen (RGC) Degeneration (Figur 1) zu überwachen. Somit verwendet diese Studie: 1) ein Mausmodell der geerbten Glaukom (DBA / 2J), die altersabhängige Sehnerv und Netzhautdegeneration und erfährt zeigt bemerkenswerte Variabilität in den Krankheitsverlauf zwischen 5 und 10 Monaten 38,39, 2) monatlich cSLO in vivo-Bildgebung für die Langzeit Visualisierung von GFP + -Zellen in der Netzhaut und des Sehnervs unmyelinated heterozygoter CX3CR1 GFP / + DBA / 2J-Mäusen im Alter von 3-5 Monaten, 3) Live-Bildanalyse durch Segmentierung und Schwellwertbildung, um die Zell somata und messen zu isolieren dieIR-Bereich. Diese Strategien angewendet werden, um die Kinetik der retinalen Mikrogliaaktivierung Zustände während der frühen Stadien der chronischen Glaukoms beurteilen.

Protokoll

In vivo wird in pathogenfreien Einrichtungen unter Verwendung von Protokollen von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Utah bestätigt Bildgebung durchgeführt.
ANMERKUNG: Diese Bildgebungsprotokoll für Reportermäusen, bei denen retinale Mikroglia und infiltrierenden Monozyten / Makrophagen exprimieren grün fluoreszierenden Protein (GFP) unter der Kontrolle des Fractalkin Rezeptor Locus (CX3CR1) verwendet.

1. In Vivo Imaging von Retinal GFP + Mikroglia durch konfokale Scanning Laser Ophthalmoskopie (cSLO)

  1. Schalten Sie den Wassergesteuerten Heizsystem, eingestellt, während Verfahren stabilisieren Maus Temperatur zwischen 35-37 ° C, und verbinden zwei Heizkissen.
    1. Starten des konfokalen Laser-Scanning-Ophthalmoskop (cSLO) System (2A). Öffnen Sie die cSLO Programm, geben Sie die Informationen, die die einzelnen Maus identifizieren und legen Sie einen Hornhautkrümmung von 2 mm (Patientendaten-Menü).
  2. Bereiten Sie sich auf imaging. Sicher passen einen sauberen 55º Weitfeld-Objektivlinse auf dem Sockel. Bereiten Sie den Augenspiegel Imaging-Plattform durch die Sicherung ein Heizkissen mit sauberem Papier bedeckt. Verwenden Sie Clips, um das Kissen und Papier glätten und sie davon abzuhalten, Blockieren der Bewegung der Objektivlinse.
  3. Betäuben die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1,3% 2,2,2-Tribromethanol und 0,8% tert.-Amylalkohol (250 mg / kg Körpergewicht; 0,5 ml / 25 g Körpergewicht) mit Hilfe eines 30½ G-Nadel in eine 1-ml-Einweg ausgestattet Spritze. Rückgabe Maus in seinen Käfig, hielt über einem Heizkissen.
    HINWEIS: Die Lieferung der Betäubung durch Injektion gegen Einatmen erleichtert das Positionieren der Maus für die Bildgebung und ungehinderten Zugang zu den Augen, frei von Nasenkegel und Schläuche.
  4. Sobald das Tier nicht mehr bewegt und ist nicht mehr auf Schwanz kneifen, induziert Pupillenerweiterung mit Tropicamide und Phenylephrin (jeweils 0,5%), indem Sie den Tieranfällig und für beide Augen mit den Tropfen für 7 min.
  5. Nach 5 min pschnüren Sie die Maus anfällig auf die Mitte des Augenspiegels Plattform und fit Kontaktlinsen über den Augen, die Anwendung minimalem Druck.
    HINWEIS: Kontaktlinsen sind klein und zerbrechlich, aber kann man vorsichtig mit den Fingern gehandhabt werden, obwohl Pinzette kann stattdessen 40 verwendet werden. Die Verwendung von Kontaktlinsen ist optional, aber empfohlen, da es minimiert Augentrockenheit und bewahrt Hornhauttransparenz während der Bildgebung.
  6. Nach 7 min, richten die Maus mit dem rechten Auge gegenüber der Objektivlinse und der Bahn parallel zu der Objektivlinse, wobei das Tier in der Nähe der Kante der Plattform (2B) ungehemmt. Um Bilder vergleichbarer Sättigung und Orientierung zu sammeln, konstant zu halten den Abstand vom Auge zum Objektivlinse sowie die Ausrichtung des Auges zu dem Lichtweg gesamten Imaging-Sitzungen. Clip lange Schnurrhaare stören Beobachtung des Auges.
    HINWEIS: Für die nächsten 8-10 min, wird die Maus nicht bewegen oder blinken, und wird Luft unter leichtem Zuggen, die von der cSLO Eye Tracking ART (automatische Echtzeit) Modus, der den Scan-Kopf-Platzierung gemäß Fundus Sehenswürdigkeiten mit hohem Kontrast passt verfolgt werden. Vergangenheit dieser Zeit Mäusen beginnen keuchend und blinkt, so dass Abbildungs ​​unpraktisch.
  7. Wenn Bildgebung wird ohne Verwendung von Kontaktlinsen durchgeführt wird, gelten PBS Tropfen in beide Augen alle 2-3 min, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern.
  8. Sammeln Sie ein Fundusbild des retinalen Gefäßsystems und Papille, das sich auf die inneren Netzhaut.
    1. Wählen Sie den Infrarot-Modus (IR) und passen Sie die Einstellungen bis 820 nm Anregung, 100% Laserleistung, 40-60% Sensitivität (2C).
    2. Arbeiten im Hochgeschwindigkeitsmodus (12,6 Bilder / s), suchen Sie das Auge mit dem Joystick, um den Augenspiegel fahren. Bei geringer Vergrößerung, überprüfen Sie die Hornhaut und Linse für Verletzungen oder Deckkraft, und verstehen sich inklusive der Studie Augen mit Defekten oder Verletzungen, die beeinflussen, die Abbildung der Netzhaut (3A).
    3. Suchen Sie den Papillenfläche (die Oberflächeder Sehnervenkopf, ONH), indem das Ziel näher zum Auge, dann die Bildmitte auf sie und sperren Sie diese Position durch Schrauben Sie den Joystick. Diese Ausrichtung des Auges auf dem Augen ist der Schlüssel zu erhalten, selbst konzentrieren und Emission über das Bild.
    4. Visualisieren Sie die inneren Ebenen der Netzhaut sowie der ONH, unter Verwendung der großen Blutgefäße auf der Glaskörper Oberfläche der Netzhaut als Referenzbrennebene (59 und 60 D) oder tiefer (55 D) liegt in den Augen, die ausgegraben Optik Discs. Die optimale Schwerpunkt sollte lösen zirkulierenden Blutzellen in großen Blutgefäßen, mit ihrem Lumen und Wände deutlich verschieden.
    5. Optimieren Sie die Bildsättigung durch Anpassung der Regler an der Touchscreen-Bedienfeld, bis ein weißes Halo der gleichmäßigen Ausleuchtung reicht in den meisten der 55º Fundus Feld um die Papille (mit leichten Überbelichtung). Next, senken Sie die Sättigung, um den Kontrast zu optimieren, bis Blutzellen, die sich entlang der großen Gefäße eindeutig geklärt werden. Wenn SchwerdunkelBereiche bestehen bleiben, nicht wegen Netzhautschäden, richten Sie den Blick auf die Kamera, bis ein gleichmäßig helles Bild erhalten wird. Diese Anpassung ist von grundlegender Bedeutung, um reproduzierbare Sätze von Bildern in Lage und Qualität zu erfassen.
    6. Sammeln eines hochauflösenden Infrarotbild der zentralen Netzhaut (1,4-1,7 mm im Durchmesser, in Abhängigkeit von Alter), im Durchschnitt von 30 Bildern in Echtzeit (4,7 B / s; normalisiert), um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern (2D ).
  9. Sofort erwerben ein Fluoreszenzbild von GFP + Mikroglia und / oder der Infiltrations Monozyten an der inneren Ebene der Netzhaut und dem Sehnervenkopf lokalisiert.
    HINWEIS: Die Optimierung des IR Fundusbild der Netzhaut bestimmt die Auflösung der Fluoreszenzbild von GFP + Zellen sowie das Ausmaß der inneren Netzhaut überspannt. Die Nichtbeachtung der inneren Ebenen der Netzhaut, die durch schlechte Auflösung des Gefäßsystems detektiert werden kann konzentrieren, werden in gedimmten GFP + Zellen Blick (3B) zur Folge haben. Nicht IR satu einstellenration ordnungsgemäß und einheitlich wirkt sich auf die Fluoreszenzbild (FA), die Einführung artifactual Variationen in GFP + Zellen Intensität und Größe (3C).
    1. Swich auf Bildgebungsmodus (FA) in der Touchscreen-Panel Fluoreszenz, mit blau, 488 nm Laseranregung (460 bis 490 nm-Sperrfilter-Set) und Übernahme-Einstellungen (100% Laserleistung und 100-125% Sensitivität), die gehalten werden, konstant für alle Mäuse (2E).
    2. Sammeln Sie ein einzelnes xy-Punkt zweidimensionalen Fluoreszenzbild der Netzhaut und ein Fundusbild sofort erfassen zu identischen Position (100x Scandurchschnitt; 55º Scanwinkel für beide Bilder, 2F).
    3. Nehmen Sie ein Multibild durch Auswahl von "Verbundwerkstoff" in der Systemsteuerung (2G) und Bewegen der Augenspiegel rechts und links, Schwenken der Netzhaut über den Nasen-Zeitachse (Abbildung 2 H).
      HINWEIS: Nach dem Scannen eines einzelnen Bildes xy-Punkt (100x skann Durchschnitt), die Software automatisch Durchschnittswerte neue Scans der gleichen und neue Bereiche (mit einem grünen Kreis umschrieben während optimale Scan oder rot, wenn der Scan nicht durchführbar ist) und Stiche alle xy-Positionen in Echtzeit. Das resultierende zusammengesetzte Bild umfasst 1,5-1,7 mm auf der horizontalen Achse x 3-4 mm in der vertikalen Achse (55º x 120-124º Scanwinkel).
  10. Vollständige Abbildung von jeder Maus innerhalb von 15 Minuten nach Narkoseeinleitung, vor Blinken und Bewegung neu gestartet.
  11. Kontaktlinsen entfernen, Hydrat Augen mit PBS und zurück das Tier in das erwärmte Käfig, Kontrolle Verhalten bis zur vollständigen Wiederherstellung der Beweglichkeit.
  12. Für Langzeitstudien mit intermittierender cSLO-Imaging-Sitzungen in der gleichen einzelnen Maus, wiederholen Imaging nicht weniger als 3 Tage auseinander, um die kumulative Toxizität der Anästhesie sowie Hornhautreizungen zu vermeiden.

2. Live-Bildverarbeitung und -analyse

  1. Sequential Bildausrichtung:
    1. Ausrichtendie Fundusbilder für eine Zeitreihe von dem gleichen Auge mit dem Gefäßsystem und Sehnervenkopf als Wahrzeichen. Öffnen Sie alle Bilder in einem kommerziellen Diashow integriert Programm, indem jedes Bild über die vorhergehende, bis ihre Papillen ausrichten auf der xy-Ebene (die obere Bild erscheint semi-transparent, während sie gezogen), und drehen Sie das obere Bild, bis sein Hauptblutgefäße überschneiden sich mit dem Gefäßsystem an das Bild unten (Fokus auf Schiffen am weitesten von der Papille). Nehmen Sie den Drehwinkel für jedes Bild, und speichern Sie diese Zeitreihe für die Zukunft, die Verfolgung der Maus und Augen Identität.
    2. Ausrichten der entsprechenden Reihe von einzelnen xy-Punkt-Fluoreszenzbilder durch Anwenden der aufgezeichneten Winkel zur XY Drehung zu jedem Zeitpunkt zu korrigieren, unter Verwendung eines Rastergrafikeditorprogramm. Darüber hinaus passen Auflösung auf 300 dpi (ohne Skalierung) und Hintergrund (im RGB-Modus, wählen Sie Levels und probieren Sie die Lumen eines Blutgefäßes als schwarz). Speichern Sie diese Bilderals TIF-Dateien, Hinzufügen "ausgerichtet", ihren Namen.
  2. Mikrogliazellen Segmentierung:
    1. Um GFP + Zellen zu identifizieren in der zentralen Netzhaut, in FluoRender öffnen Sie die "ausgerichtet" TIF-Datei, die der frühesten Zeitpunkt / age. Vergrößern Sie das Bild auf den Bildschirm passen, dann definieren Sie die Render-Ansicht (Composite, orthogonale, interpoliert) und seine Eigenschaften (0,58 Gamma, Sättigung 255, 255 Leuchtdichte, 195 Alpha und 1.00 Shading), die Auswahl sowohl die RG-Kanäle sichtbar (ausblenden B-Kanal durch einen Doppelklick auf das im Arbeitsbereich-Rahmen; 4A).
    2. Um einzelne Zellen, Schwellen den roten Kanal wählen (müssen auf dem Arbeitsbereich Rahmen markiert), durch die Erhöhung der niedrigen Schwelle, bis die Mehrzahl der Zellen maskiert (weiß) mit Mindestüberlappung und Zellprozesse (cyan), während die hohe Schwelle konstant (255). Der niedrige Schwellwert variiert zwischen 100 und 170, abhängig von der Fluoreszenzintensität (4B </ Strong>).
    3. Speichern Sie diese Ansicht mit den roten Kanal sichtbar (Capture-Befehl) als neue TIF-Datei, Hinzufügen "cellsegm" in seinen ursprünglichen Namen (4C). Mit einem generischen Rastergrafik-Editor-Software, invertieren ihre Graustufen und passen Auflösung auf 300 dpi, wie oben, und wieder speichern als RGB (4D).
      Hinweis: Der Ordner (Projekte) automatisch von FluoRender erstellt Löschen, und speichern Sie die Anwendung Schwelle für die Zukunft.
  3. Mikroglia soma Segmentierung und Morphometrie:
    1. Um GFP + Zellen somata für Bereich Quantifizierung zu identifizieren, verwenden Sie Bildanalyse-Software mit automatischer Intensitätsmessungen und Schwellen Fähigkeiten sowie Schwellenbasierten Objektzählung und Messung. Öffnen Sie die "cellsegm" TIF-Datei, und wählen Sie die Skalierung Verfahren (Spline) und den roten Kanal (klicken Sie auf Registerkarte rot in RGB). Verbessern Sie die Visualisierung durch Abwahl "view-Kanal in der Farbe" (Rechtsklick auf das rote RGB tab), und wählen Sie "ergänzen Farben" (Bild / Anpassen Image), um die Graustufen umzukehren und sich die Zellen in grau / schwarz auf weißem Hintergrund (4E).
    2. Kalibrieren Sie das Bild, um 1,4 bis 1,7 mm, je nach Alter, durch Ziehen einer horizontalen Linie über das gesamte Bild (Kalibrierung, Schnellkalibrierung).
    3. Segment Einzelzelle somata indem Intensitätsschwellenwertbildung (4B). Dazu Arbeit auf dem roten RGB-Kanal und öffnen Sie die Schwellenintensität Funktion (Object Count; Auswählen "count Update" -Befehl), um zweidimensionale Parameter für jeden Schwellenwert Region of Interest (ROI) zu verfolgen, die einzelne somata.
    4. Definieren die Intensitätsschwelle in dem Intensitätshistogramm durch Auswahl der niedrigsten 50-60% der 255 Ebenen und die Endversion Schwellenwert durch visuelle Beurteilung der Überlappung zwischen dem Schwellenwert Farbmaske (blau) und Zellsoma Perimeter (grau) in Einzelzellen (FBBILDUNG 4E).
    5. Schätzen Sie die Genauigkeit der Zelle soma Masken, um die Somal Dimensionen durch Messen der Fläche vor und nach der Segmentierung in 10 Zellen stellen und die ausgewählte Schwellenbereich an, wenn die Messwerte für weniger als 10% (mit dem Binary Toolbar und kommentierte Messungen).
    6. Manuell identifizieren Somal ROIs, die mehrere Zellen schließen und trennen diese Elemente (Beseitigung oder separaten ROIs mit den Binary Toolbar Kontrollen oder Objektkatalog), während das Umschalten Ein / Aus den binären, um die Zellen (4F) direkt visualisieren.
    7. Klassifizieren Mikroglia als ROIs mit somal Bereiche größer und kleiner als 50-60 & mgr; m 2 zu Zelle unterscheiden somata entsprechend aktivierte Mikroglia und deaktiviert Mikroglia jeweils mithilfe Raumeinschränkung.
      HINWEIS: Jede Zelle Somal Teilmenge mit einem anderen pseudocolored binären Schicht identifiziert, und kann weiter für andere morphologische Parameter charakterisiert werden (PERIMEter, Kreisförmigkeit, etc.), als auch in diskreten retinalen Sektoren (Figur 4G) quantifiziert. Speichern Sie das Bild analysiert als ND2 Datei.
    8. Stellen Sie sicher, den Prozess und die Komplexität Verzweigung in Einzel aktivierten Mikrogliazellen, durch Überlagerung der Somal Maske und die einzelnen xy -Punkt Bild (Kontrast erhöht 50%; 4H). Manuelles zählen die direkt aus der Zelle soma Verlängerung Prozesse oder messen Sie den Durchmesser des Polygons umfasst die Laube (verwenden Sie die Binary Toolbar und kommentierte Messungen).
      HINWEIS: Aktivierte Zellen fehlt Prozesse oder tragen wenigen (<4) und kurz (<2x somal Durchmesser) diejenigen, im Gegensatz zu nicht-aktivierten Zellprozesse, die eine verzweigte und umfangreiche Dorn umfassen (> 3-10x somal Durchmesser) rund um ihre relativ kleine soma.
    9. Manuell identifizieren Zellen mit somata kleiner als <20 & mgr; m 2 und / oder der GFP-Expression unter der Nachweisgrenze, die daher durch in unerkannt sindIntensitätsschwellen. Verwenden Sie den Befehl Taxonomy in Annotations manuell identifizierten Elemente zu zählen.

Ergebnisse

Unsere bisherigen in vivo Studien verwendet diese spannungs Bildaufnahme- und Analyseverfahren, zu visualisieren und zu verfolgen, die Kinetik und Muster der ONH und retinale Mikroänderungen während der frühen Stadien der chronischen Glaukoms und ihre Beziehung zu spät Neurodegeneration 59. Hier veranschaulichen wir cSLO Bildaufnahme-Protokoll zu Mikrogliazellen in einem großen Bereich der zentralen Netzhaut in einzelnen jungen heterozygot CX3CR1-GFP DBA / 2J Retinae (Abbildung 5)

Diskussion

Echtzeitüberwachung von Mikroglia-Zellzahl und Morphologie Aktivierung während einer neurodegenerativen Erkrankung ist die Verwendung von nicht-invasive Bildgebungsverfahren, das die detaillierte Darstellung von Zellfunktionen ermöglichen. Nach der Bilderzeugung muss Mikroglia-Zellen isoliert werden (segmentiert) für morphometrische Analyse durch Verwendung von mehreren Schwellen Schritte Somal Größe und / oder Prozesskomplexität als Positionsanzeigen für Mikroglia-Aktivierung zu bewerten. In diesem Protokoll be...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ miceThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 and 00582Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringeBD, East Rutherford, NJ305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tabletsSigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 and P4417Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/PumpGaymar Industries, Orchard Park, NYTP-650
Cotton-tipped applicatorsFisher Scientific, Pittsburgh, PA23-400-100
Tropicamide 1%Bausch & Lomb, Rochester, NYNDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick centerCantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UKG003709Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer softwareHeidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CAVersion 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Redmond, WAVersion 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, San Jose, CAVersion CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, University of UtahVersion 2.13Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Melville, NYVersion 4.30.01

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