تقييم فعالية<em&gt; H. بيلوري</em&gt; البروتين HP-NAP كأداة علاجية لعلاج سرطان المثانة في مثلي فأري موديل

Summary

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Abstract

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Introduction

سرطان المثانة هو واحد من أكثر أنواع السرطان شيوعا في الجهاز البولي التناسلي، مع ما يقرب من 75،000 حالة جديدة كل عام في الولايات المتحدة الأمريكية ^1. تتطلب معدلات عالية من تكرار مدى الحياة المتابعة، مما يجعل سرطان المثانة واحدة من أغلى أنواع السرطان لعلاج. علاج الذهب القياسية لعالية الجودة NMIBC هو بتر عبر الإحليل، تليها العلاج المناعي إينترفسكل مع BCG. على الرغم من أن الآلية الدقيقة للنشاط المضادة للورم من BCG يبقى أن توضح تماما، ومن المتفق عليه أن تفعيل استجابة بوساطة الخلايا المناعية المخصب في T المساعد (ث) 1 والسامة للخلايا T (ح) 1 الخلايا هو أمر حاسم ل نجاح العلاج ^2.

على الرغم من أن BCG يبقى العلاج الأمثل لNMIBC، وهي نسبة عالية من المرضى لا يستجيبون للعلاج. علاوة على ذلك، فإنه يمكن أن يسبب عددا من الآثار الجانبية: حوالي 70٪ من الأورام تعامل تتكرر بعد مرور بعض الوقت والتقدم ~ 15٪ إلى النموذج العضلات الغازية للالمرض. الآثار الجانبية الأخرى المرتبطة العلاج BCG تشمل عسر البول، التهاب المثانة والتهاب الكلى ^3-6.

تطوير استراتيجيات علاجية جديدة يجب أن تأخذ في الاعتبار استخدام نماذج ما قبل السريرية، بعد الأولي في المختبر التقييم؛ هذا أهمية خاصة في الأورام التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير تنميتها والاستجابة للعلاج المكروية.

على مدى العقد الماضي، ونحن قد تناولت جوانب متعددة من النشاط تحوير المناعة من HP-NAP، وهو بروتين تنتجه بكتيريا هيليكوباكتر بيلوري، حدد في البداية بأنه قادر على تعزيز التصاق الخلايا البطانية النوى (PMNs) ^7. هيكليا، HP-NAP ينتمي إلى البروتين لحماية الحمض النووي في ظل ظروف التجويع (DPS) الأسرة ⁽⁸⁾ ويتكون من 12 مفارز متطابقة مرتبة في قذيفة dodecameric.

لقد أثبتنا أن HP-NAP هومستقبلات تول مثل (TLR) 2 ناهض، مع نشاط تحوير المناعة القوي التي تقف وراء تمايز اللمفاويات التائية نحو النمط الظاهري TH1، سواء في المختبر والمجراة ^10/09. في فضيلة لهذا النشاط، HP-NAP غير قادرة على توجيه الاستجابة المناعية TH2 في الاستجابة أكثر فائدة TH1 في نموذج الفئران من الربو التحسسي ^11.

لتقييم القدرة المضادة للورم TH1 التي تعتمد من HP-NAP، اتخذنا الاستفادة من نموذج الفأر من سرطان المثانة وضعت قبل عدة سنوات من قبل أودونيل وزملاؤه ⁽¹²⁾ لتقييم أثر إدارة BCG.

مع هذا البروتوكول، علينا أن نبرهن على HP-NAP لديها امكانات المضادة للورم قوية ضد سرطان المثانة وأن فعالية إدارة HP-NAP يوازي تراكم كبير، داخل الورم والغدد الإقليمي العقد، كل من Th1 و TC1 الخلايا الليمفاوية إنتاج الانترفيرون ( IFN) -γ ¹³ . وأظهرت أورام معزولة من الفئران التي عولجت HP-NAP-مزيد من نخر والأوعية الدموية أقل من نظيره غير المعالجة.

يقدم هذا التقرير بروتوكول stepbystep، تفاصيل إعداد الحيوانات، قسطرة الإحليل، وحرق الكيميائية اللازمة لمرفق من الخلايا إلى الغشاء المخاطي المثانة، وحقن الخلايا السرطانية. نحن أيضا وصف الإدارة الموضعية من HP-NAP التي يمكن اعتبارها نموذجا أوليا من أي العوامل العلاجية المتقدمة لعلاج سرطان المثانة. الأدلة التي تم الحصول عليها عن طريق مقارنة أورام معزولة عن السيطرة وHP-المعالجة NAP الحيوانات ويؤكد ليس فقط حقيقة أن HP-NAP يمكن أن يكون مرشحا جيدا للعلاج مناعي سرطان المثانة، ولكن أيضا فعالية العامة للالتجريبية اقامة.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات من قبل وزارة الصحة الإيطالية (DM 204/2011-B).

1. الحيوانات

1. تنمو C57BL6 / J الفئران الإناث إلى 8 أسابيع من العمر في أقفاص التهوية بشكل فردي مع مرشحات microisolation.
   ويفضل الإناث لأن التشكل التشريحي للجهاز-البولية التناسلية الخارجية لها يجعل قسطرة أسهل مما كانت عليه في الذكور: مذكرة.

2. خلية ثقافة

1. الحفاظ على الماوس الظهارة البولية خط خلية سرطان MB49 في RPMI 1640 متوسطة تستكمل مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين على 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO _2.
2. زراعة خلايا MB49 في T-75 قوارير إلى 80٪ التقاء. يعرض للتريبسين و resuspend عند 0.5 × 10 ^5-0،5 × 10 ⁶ خلايا في 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل الزرع في الفئران.

3. إينترفسكل الأورام زراعة

1. تخدير الفئران باستخدام مزيج من zoletil التخدير وxylor (33 ملغ / كغ و 20 ملغم / كغم، على التوالي)، حقن داخل الصفاق.
2. وضع الحيوانات في موقف ضعيف وإصلاح رجليه الخلفيتين الى منصة مع الاسكتلندي. الكفوف وإلى أن يفصل بما فيه الكفاية لجعل الصماخ الإحليل مرئية بشكل جيد ويمكن الوصول إليها بسهولة لإدخال القسطرة.
3. ملاحظة: بالنسبة للقسطرة، 24 G القسطرة الوريدية للأطفال هي مناسبة للفئران 8-10 أسابيع من العمر. اختيار القسطرة مهم للغاية من أجل تجنب تسرب السائل بين الجدار مجرى البول والقسطرة. يجب استخدام القسطرة تجويف أكبر للفئران أكبر أو كبار السن.
4. باستخدام كلاب صغيرة، قرصة حافة واحدة من الجزء الخارجي من مجرى البول وتطويعه بلطف شديد نحو "نهاية الرأس" من الفئران. هذا العمل يعرض الصماخ الإحليل.
5. إزالة الإبرة الداخلية للالقسطرة وتضاف هذه الأخيرة في مجرى البول في زاوية من 45 درجة مئوية، موجهة قليلانحو "ذيل" من الفئران. لا قوة مدخل القسطرة. في حالة المقاومة، مجرد تحريف القسطرة بلطف شديد، حتى أنه ينزلق داخل مجرى البول. عندما حول 0،5-0،8 سم من القسطرة في مجرى البول، ضع بعناية بالتوازي القسطرة إلى ذيل الفئران وأدخله تماما.
6. باستخدام حقنة 1 مل، الإبرة التي لابد من إدراجها في القسطرة، وغسل المثانة من البول المتبقي عن طريق حقن 200-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة ونضح كل السائل من المثانة.
7. ملاحظة: عندما حقن PBS، فإن المثانة تملأ وسوف تورم تكون واضحة بين رجليه الخلفيتين من الفئران. هذا يؤكد أن القسطرة هي الصحيحة. معظم القسطرة لديها حجم القتلى التي يجب أخذها في الاعتبار عند حساب حجم الحقن.
8. باستخدام معقمة 1 مل حقنة، وضخ 200 ميكرولتر من 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. ملء المثانة من أجل حرق الجدار بأكمله. بعد 10 ثانية، وإزالة جميع الحامض وneutrali فورازي عن طريق حقن 200 ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم مع محقنة معقمة. في حالة حقن أكبر عدد من الخلايا (0.5 × 10 ^6)، ولا يشترط الخطوة التحميض.
9. نضح كل السائل المتبقي وعلى الفور بمسح تجويف مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة.
10. إفراغ المثانة بواسطة الشفط، وحقن 150 ميكرولتر من PBS تحتوي على خلايا MB49 (المدى 0.5 × 10 ^5-0،5 × 10 ⁶⁾ في المثانة. ترك الحقنة تجميعها لالقسطرة لتجنب تسرب الخلايا. فمن الأفضل لتأمين حقنة عن طريق تحديد إلى لوحة مع الاسكتلندي.
11. بعد 1 ساعة، واستخراج بلطف القسطرة من مجرى البول، ووضع الفئران في قفص تحت مصباح وهاج حتى مستيقظا: هذا يحدث عادة بين 1 و 2 ساعة بعد نهاية العلاج.

4. التسليم إينترفسكل من HP-NAP

1. ملاحظة: لا يقل عن 3 أيام بعد تقطير الخلية، فمن الممكن أن يبدأالعلاج.
2. يقثطر كما هو موضح في الخطوات 3،1-3،4. في هذه المرحلة، فإنه ليس من الضروري لحرق جدار المثانة مع حمض الهيدروكلوريك.
3. باستخدام حقنة 1 مل، وغسل المثانة من البول المتبقي عن طريق حقن 200-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة ونضح كل السائل من المثانة.
4. حقن 50 ميكروغرام من HP-NAP في 150 PBS ميكرولتر في المثانة. ترك الحقنة التي تعلق على القسطرة لتجنب تسرب من الحل البروتين. تأمين حقنة عن طريق تحديد إلى لوحة مع الاسكتلندي.
5. بعد 1 ساعة، واستخراج بلطف القسطرة من مجرى البول ووضع الفئران في قفص تحت مصباح وهاج، حتى يستيقظ.

5. الأورام إإكسبلنتس وتحليل النسيجي

1. في نهاية العلاج، والتضحية الحيوانات، ووضعها في مواقف مستلق وإصلاح رجليه الخلفيتين الى منصة مع الاسكتلندي.
2. باستخدام مشرط جراحي، وجعل شق عمودي عن 1.52 سم من خلال الجلد والبريتوني، بدأت للتو فوق الأعضاء التناسلية الخارجية إلى "نهاية الرأس" من الفئران. للحد من مخاطر الإضرار المثانة، إيلاء اهتمام خاص لعمق القطع.
3. سيتم وضع المثانة في يسار الوسط لقطع وسوف الورم تكون واضحة كما مظلمة كتلة الوردي / البنفسجي. على الختان لها، ضع المثانة بالكامل في قفص النسيجي وإصلاح في 10٪ من الفورمالين مخزنة قبل التضمين في البارافين.
4. لالنسيجية وتحليل النسيجية المناعي، وإعداد أقسام المسلسل من المثانة (46 سماكة ميكرون) باستخدام مشراح القياسية.
5. وصمة عار على المقاطع مع haematoxylin / يوزين والمضي قدما في حساب حجم الورم (D XD ²⁾ وتحديد نسبة نخر في منطقة مستعرضة باستخدام بمساعدة الكمبيوتر محلل الصورة.
6. لسفينة العد، المضي قدما في طريق تلطيخ أقسام للعلامة البطانية CD31 / PECAM، وذلك باستخدام تقنية المناعي القياسية. مسح المقاطع لر طاقة منخفضة (4 ×) لتحديد منطقة أعلى كثافة الأوعية الدموية. داخل هذه المنطقة، عد microvessels الفردية في خمسة حقول عشوائية منفصلة في قوة عالية (20 ×).

النتائج

ويبين الشكل (1) وتقنية القسطرة. ومقسطر الماوس وتغرس مع 0.5 × 10 ⁶ MB49 الخلايا. بدأ العلاج مع HP-NAP 3 أيام بعد حقن الخلايا السرطانية، لتمكينهم من تعلقها على جدار المثانة وتتكاثر. كل الحيوانات التي تنتمي إلى مجموعة مراقبة تطور الورم. البعض منهم قد يموتون قبل نهاي?...

Discussion

معظم السلف في علاج السرطان تتطلب اختبارات في النماذج الحيوانية قبل بدء التجارب السريرية. إمكانية دراسة بيولوجية الورم في الجسم الحي، والاستفادة من النماذج الحيوانية، يمثل أداة حاسمة للباحثين التحقيق التسبب بالسرطان، مما يتيح تقييم أساليب علاجية مختلفة. لا تز?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System