Оценка эффективности<em&gt; Н. пилори</em&gt; Белок HP-NAP как лечебное средство для лечения рака мочевого пузыря в Ортотопическая мышиной модели

Резюме

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Аннотация

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Введение

Рак мочевого пузыря является одним из самых распространенных видов рака мочеполовой тракт, с почти 75000 новых случаев каждый год в США ^1. Высокие темпы рецидива нуждаются в пожизненной последующей деятельности, что делает рак один из самых дорогостоящих видов рака для лечения мочевого пузыря. Золотым стандартом лечения для полноценного NMIBC транс уретры резекция с последующим внутрипузырной иммунотерапии БЦЖ. Хотя точный механизм противоопухолевой активности БЦЖ остается полностью выяснены, считается, что активация клеточного иммунного ответа, обогащенной Т-хелперов (Th) 1 и цитотоксических Т (Тс) 1 клетки имеет решающее значение для Успех терапии ^2.

Несмотря на то, что БЦЖ остается препаратом выбора для NMIBC, высокая доля пациентов не реагируют на терапию; Кроме того, это может вызвать ряд побочных эффектов: около 70% пролеченных опухолей повторяются через какое-то время, и ~ 15% прогресса в мышечно-инвазивного видеБолезнь. Другие побочные эффекты, связанные с лечением БЦЖ включают дизурия, цистит и почечную инфекцию ^3-6.

Разработка новых терапевтических стратегий необходимо принимать во внимание использование доклинических моделях, после первоначального пробирке оценки в; Это особенно актуально в опухолях которых микросреда может существенно повлиять на их развитие и реагирования на обращения.

За последнее десятилетие, мы обратились несколько аспектов иммунной модуляции деятельностью HP-NAP, белок, вырабатываемый бактерией Helicobacter Pylori, изначально определены как способные стимулировать эндотелия адгезию полиморфноядерных клеток (PMNs) ^7. Конструктивно HP-NAP относится к ДНК-белок защиты при условиях голодали (DPS) семейства ⁸ и состоит из 12 идентичных субъединиц, расположенных в виде dodecameric оболочки.

Мы показали, что НР-НПДToll-подобный рецептор (TLR) 2 агонистом, с сильным иммуномодулирующее активностью, ответственной за рулем дифференцировку Т-лимфоцитов в сторону фенотипа Th1, как в пробирке и в естественных ^9-10. В силу этого активности, HP-NAP способен перенаправить иммунный ответ Th2 в более выгодным ответ Th1 в мышиной модели аллергической астмы ^11.

Чтобы оценить Th1-зависимого потенциал анти-опухоли HP-NAP, мы воспользовались мышиной модели рака мочевого пузыря, разработанной несколько лет назад О'Доннел и коллег ¹² для оценки влияния администрации БЦЖ.

С этого протокола, мы показали, что НР-NAP имеет большой потенциал анти-опухолевого против рака мочевого пузыря, и что эффективность управления HP-NAP параллельно значительное накопление в пределах опухоли и регионарных лимфатических узлов, обоих Th1 и Tc1 лимфоцитов, продуцирующих интерферон ( ИФН) -γ ¹³ . Опухоли, выделенные из HP-NAP-обработанных мышей показали более некроз и меньше васкуляризации, чем необработанные аналога.

Настоящий доклад обеспечивает протокол stepbystep, подробно подготовку животных, их уретры катетеризации, необходимого для прикрепления клеток к слизистой оболочки мочевого пузыря химический горение, и инъекции опухолевых клеток. Мы также описывают местное применение HP-NAP, что можно рассматривать как прототип любых терапевтических агентов, разработанных для лечения рака мочевого пузыря. Доказательства, полученные путем сравнения опухоли, выделенные из контроля и HP-NAP лечение животных подчеркивает не только тот факт, что HP-NAP может быть хорошим кандидатом для иммунотерапии рака мочевого пузыря, но и вообще эффективность экспериментальной установки.

протокол

Все процедуры для обработки животного были утверждены Министерством здравоохранения Италии (DM 204/2011-Б).

1. Животные

1. Растут C57BL6 / J самок мышей до 8-недельного возраста в отдельности вентилируемых клетках с microisolation фильтров.
   Примечание: Женщины являются предпочтительными, поскольку анатомическое конформации их внешнего мочеполовой аппарат оказывает катетеризации легче, чем у мужчин.

2. Культура клеток

1. Поддержание мыши уротелиальную клеточной линии карциномы MB49 в RPMI 1640 среде, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и 50 мкг / мл гентамицина при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO _2.
2. Растут MB49 клетки в Т-75 колб до 80% слияния. Trypsinize и ресуспендируют в 0,5 × 10 ⁵ - 0,5 × 10 ⁶ клеток на 150 мкл PBS перед имплантацией в мышей.

3. Внутрипузырная опухоли Имплантат

1. Обезболить мышей, используя смесь в zoletil анестетиков и xylor (33 мг / кг и 20 мг / кг, соответственно), вводили внутрибрюшинно.
2. Поместите животных в лежачем положении и зафиксировать задние ноги на площадку скотчем. Лапы должны быть достаточно отделены, чтобы оказать проход уретры хорошо видимый и легко доступный для вставки в катетер.
3. Примечание: Для катетеризации, 24 г педиатрической венозный катетер подходит для 8 до 10 недель-старых мышей. Выбор катетера очень важно, чтобы избежать утечки жидкости между стенкой уретры и катетера. Большие катетеры расточки должна использоваться для больших или старых мышей.
4. С помощью небольшой щипцы, щепотка один край наружной части уретры и крутить его очень осторожно к "головной части" мышей. В этом случае за мочеиспускательного канала.
5. Удалить внутреннюю иглу катетера и вставки последних в мочеиспускательный канал под углом 45 °, слегка ориентированныхк "хвосте" мышей. Не заставить вход катетера; в случае сопротивления, просто крутить катетер очень осторожно, пока она не скользит внутри мочеиспускательного канала. При приблизительно 0,5-0,8 см катетера в мочеиспускательный канал, тщательно место катетера параллельно хвоста мышей и вставить его полностью.
6. Использование 1 мл шприц, иглы, который должен быть вставлен в катетере, мыть мочевого пузыря от остаточной мочи путем введения 200-300 мкл стерильной PBS и аспирации всей жидкости из мочевого пузыря.
7. Примечание: При инъекции PBS, мочевого пузыря будет заполнить и отек будет виден между задних ног у мышей; это подтверждает, что катетеризация является правильным. Большинство катетеры имеют мертвый объем, который необходимо учитывать при расчете объема впрыска.
8. Используя стерильный шприц 1 мл, вводят 200 мкл 0,1 N HCl. Заполните пузыря, чтобы сжечь всю свою стену. После 10 сек, удалить все кислоту и сразу neutraliZE путем инъекции 200 мкл 0,1 N NaOH со стерильным шприцем. В случае инъекции наибольшее количество клеток (0,5 × 10 ^6), стадии подкисления не требуется.
9. Отберите все остаточную жидкость и немедленно промойте полость 300 мкл стерильной PBS.
10. Опорожнить мочевой пузырь путем аспирации, и вводят 150 мкл PBS, содержащие клетки MB49 (диапазон 0,5 × 10 ⁵ - 0,5 · 10 ⁶⁾ в мочевой пузырь. Оставьте шприц, смонтированный на катетере, чтобы избежать утечки клеток. Лучше, чтобы обеспечить шприц, фиксируя его на площадку скотчем.
11. После 1 часа, осторожно извлечь катетер из уретры, и поместить мышей в клетке, под лампы накаливания, пока они не будить: это обычно происходит между 1 и 2 ч после окончания лечения.

4. Внутрипузырная Доставка HP-NAP

1. Примечание: По крайней мере, через 3 дня после закапывания клеток, можно начатьЛечение.
2. Катетер, как описано в шагах от 3,1 до 3,4. На этой стадии, не нужно, чтобы сжечь стенки мочевого пузыря с HCl.
3. Используя 1 мл шприц, мыть мочевого пузыря от остаточной мочи путем введения 200-300 мкл стерильной PBS и аспирации всей жидкости из мочевого пузыря.
4. Вводят 50 мкг HP-NAP в 150 мкл PBS в мочевой пузырь. Оставьте шприц прикреплен к катетеру, чтобы избежать утечки раствора белка. Безопасный шприц, фиксируя его на площадку скотчем.
5. После 1 часа, осторожно извлечь катетер из уретры и место мышей в клетке, под лампы накаливания, пока они не будить.

5. Опухоль Экспланты и Гистологический анализ

1. В конце лечения, жертвовать животных, поместите их в положении лежа позиции и зафиксировать задние ноги на площадку скотчем.
2. Использование хирургического скальпеля, сделать вертикальный разрез длиной около 1,52 см через кожу ибрюшины, начиная чуть выше наружных половых органов в "головном конце" мышей. Чтобы свести к минимуму риск повреждения мочевого пузыря, обратить особое внимание на глубину реза.
3. Мочевого пузыря будет располагаться в центральной левой части разреза и опухоль будет видна как темная масса розовый / фиолетовый. По его удаления, поместите всю мочевого пузыря в гистологической клетке и зафиксировать 10% буферном формалине, прежде чем вложение в парафин.
4. Для гистологических и гистохимических иммунной анализа, подготовки серийных срезов мочевого пузыря (46 мкм толщиной) с использованием стандартного микротом.
5. Пятно секции гематоксилином / эозином и приступить к расчету размера опухоли (D ж ^ ²⁾ и определения процентного содержания некроза в площади поперечного сечения с помощью компьютера помощь анализатора изображений.
6. Для подсчета сосуда, перейдите окрашиванием разделы для эндотелия маркер CD31 / PECAM, используя стандартную технику иммунопероксидазой. Сканирование разделыт малой мощности (4 ×), чтобы определить область наибольшей плотности сосудов. В этом регионе, рассчитывать индивидуальные микрососудов в пяти отдельных случайных полей при высокой мощности (20 ×).

Результаты

Рисунок 1 показывает технику катетеризации; мыши катетер и привили с 0,5 × 10 ⁶ клеток MB49. Лечение HP-NAP запускается через 3 дня после инъекции опухолевых клеток, чтобы дать им возможность приложить к стенке мочевого пузыря и размножаются. Все животные, принадлежащие к контрол?...

Обсуждение

Большинство достижений в лечении рака требуют испытания на животных моделях перед началом клинических испытаний. Возможность изучения биологии опухоли в естественных условиях, воспользовавшись животных моделях, представляет собой важнейшую инструмент для исследователей, изуч...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System