Avaliação da Eficácia da<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP como uma ferramenta terapêutica para o tratamento de cancro da bexiga em um Modelo murino Orthotopic

Resumo

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Resumo

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Introdução

O câncer de bexiga é um dos cânceres mais comuns do trato urogenital, com cerca de 75.000 novos casos por ano nos EUA ^1. As altas taxas de recorrência ao longo da vida exigem acompanhamento, o que torna o câncer de bexiga um dos cancros mais caras para tratar. O tratamento padrão ouro para o alto grau NMIBC é a ressecção trans-uretral, seguida de imunoterapia intravesical com BCG. Embora o mecanismo exacto da actividade anti-tumoral de BCG continua a ser totalmente elucidado, admite-se que a activação de uma resposta imune mediada por células enriquecida em células T auxiliares (Th) e um T citotóxicas (Tc) um células é crucial para o sucesso da terapia de ^dois.

Apesar do fato que a BCG continua a ser o tratamento de escolha para NMIBC, uma elevada proporção de pacientes não responde à terapia; além disso, pode provocar um número de efeitos secundários: cerca de 70% dos tumores tratados recorrer após algum tempo e ~ 15% para a forma de progresso músculo-invasiva dadoença. Outros efeitos secundários associados com o tratamento com BCG incluem disúria, cistite e infecção renal ^3-6.

O desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas deve levar em consideração a utilização de modelos pré-clínicos, seguindo in vitro de avaliação inicial; isto é particularmente relevante em tumores cuja microambiente pode influenciar significativamente o seu desenvolvimento e capacidade de resposta ao tratamento.

Ao longo da última década, têm abordado vários aspectos da actividade de modulação imunitária de HP-PNA, uma proteína produzida pela bactéria Helicobacter pylori, inicialmente identificados como capazes de promover a adesão endotelial de células polimorfonucleares (PMN) ^7. Estruturalmente, HP-NAP pertence à proteína-protegendo o DNA sob condições de privação (DPS) da família ⁸ e é composto por 12 subunidades idênticas dispostas em um shell dodecameric.

Nós demonstramos que a HP-NAP éum receptor de tipo Toll (TLR) 2 agonista, com uma forte actividade de imuno-regulação responsáveis ​​por dirigir a diferenciação de linfócitos T no sentido do fenótipo Th1, tanto in vitro como in vivo ^9-10. Em virtude desta actividade, HP-NAP é capaz de redirecionar a resposta imune Th2 na resposta mais benéfico Th1 em um modelo murino de asma alérgica ^11.

Para avaliar o potencial anti-tumoral Th1-dependente de HP-NAP, aproveitamos um mouse modelo de cancro da bexiga desenvolvido há vários anos por O'Donnel e colegas ¹² para avaliar o impacto da vacina BCG.

Com este protocolo, demonstramos que a HP-NAP tem um potencial anti-tumoral forte contra o cancro da bexiga e que a eficácia da administração de HP-NAP é paralela à acumulação significativa, dentro de nós tumorais e linfonodos regionais, de ambos os linfócitos Th1 e Tc1 produtoras de Interferon ( IFN) -γ ¹³ . Os tumores isolados de camundongos tratados com HP-NAP mostrou mais de necrose e menor vascularização do que a contrapartida não tratada.

O presente relatório proporciona um protocolo stepbystep, detalhando a preparação dos animais e dos respectivos cateterismo uretral, a queima química necessária para a fixação de células à mucosa da bexiga, e a injecção das células tumorais. Nós também descrevem a administração tópica de HP-PNA que pode ser considerada como um protótipo de quaisquer agentes terapêuticos desenvolvidos para o tratamento de cancro da bexiga. A prova obtida através da comparação de tumores isolados de controle e-tratados com NAP HP animais enfatiza não só o fato de que a HP-NAP pode ser um bom candidato para imunoterapia do cancro de bexiga, mas também a eficácia geral da montagem experimental.

Protocolo

Todos os procedimentos para lidar com os animais foram aprovados pelo Ministério italiano da Saúde (204/2011-B DM).

1. Os animais

1. Crescer camundongos fêmeas C57BL6 / J 8 semanas de idade em gaiolas ventiladas individualmente com filtros microisolation.
   Nota: As fêmeas são preferidos devido à conformação anatómica do seu aparelho de uro-genital externa torna o cateterismo mais fácil do que nos machos.

2. Cultura celular

1. Manter a linha celular de carcinoma urotelial rato MB49 em RPMI 1640 meio suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor e 50 ng / ml de gentamicina, a 37 ° C em 5% humidificada de CO _2.
2. Cultivar células MB49 em frascos T-75 a 80% de confluência. Tripsinizar e ressuspender em 0,5 × 10 ^5-0,5 x 10 ⁶ células por 150 ul de PBS antes da implantação em ratos.

3. Intravesical tumor Implant

1. Anestesiar ratos, utilizando uma mistura de anestésicos e o Zoletil xylor (33 mg / kg e 20 mg / kg, respectivamente), injectada intraperitonealmente.
2. Coloque os animais em decúbito dorsal e corrigir as patas traseiras para a almofada com fita adesiva. Patas têm de ser suficientemente separadas para processar o meato uretral bem visíveis e facilmente acessível para a inserção do cateter.
3. Nota: Para a cateterismo, um cateter venoso pediátrica 24 G é adequado para ratinhos 8 a 10 semanas de idade. A escolha do cateter é muito importante a fim de evitar a fuga de líquido entre a parede da uretra e do cateter. Cateteres furo maior deve ser utilizado para ratinhos maiores ou mais velhos.
4. Usando uma pequena pinça, beliscar uma borda da parte externa da uretra e torcê-lo muito suavemente em direção ao "fim cabeça" dos ratinhos. Esta ação expõe o meato uretral.
5. Retirar a agulha do cateter interno e inserir este último na uretra com um ângulo de 45 °, orientada ligeiramenteno sentido da "extremidade posterior" dos ratinhos. Não force a entrada do cateter; em caso de resistência, basta girar o cateter muito suavemente, até que desliza para dentro da uretra. Quando cerca de 0,5-0,8 cm do cateter na uretra é, colocar cuidadosamente o cateter paralelo para a cauda dos ratos e inseri-lo completamente.
6. Usando uma seringa de 1 ml, a agulha de que tem de ser inserido no cateter, lava-se a partir de urina residual da bexiga através da injecção de 200-300 ul de PBS estéril e aspirar o líquido a partir da bexiga.
7. Nota: Ao injetar PBS, a bexiga vai encher-se e um inchaço será visível entre as patas traseiras dos ratos; isto confirma que o cateterismo é correto. A maioria dos cateteres têm um volume morto que tem de ser considerada quando se calcula o volume de injecção.
8. Usando uma seringa esterilizada de 1 ml, injectar 200 ul de 0,1 N de HCl. Preencha a bexiga a fim de queimar toda a sua parede. Após 10 segundos, retire todo o ácido e imediatamente neutralize por injecção de 200 uL de NaOH 0,1 N, com uma seringa estéril. No caso de injecção de maior número de células (0,5 x 10 ^6), o passo de acidificação não é necessária.
9. Aspire todo o líquido residual e imediatamente lavar a cavidade com 300 � de PBS estéril.
10. Esvaziar a bexiga por aspiração, e injectar 150 ul de PBS contendo células MB49 (intervalo de 0,5 x 10 ^5-0,5 x 10 ⁶⁾ no interior da bexiga. Deixar a seringa montada no cateter a fim de evitar a fuga de células. É melhor para garantir a seringa, fixando-lo à almofada com fita adesiva.
11. Após 1 hora, extrair suavemente o cateter da uretra, e colocar os murganhos na gaiola, sob uma lâmpada incandescente até despertaram: este ocorre geralmente entre 1 e 2 horas após o fim do tratamento.

4. Entrega de Intravesical HP-NAP

1. Nota: pelo menos 3 dias após a instilação de células, é possível começar atratamento.
2. Cateterize como descrito nas etapas 3.1 a 3.4. Nesta fase, não é necessário para queimar a parede da bexiga com HCl.
3. Usando uma seringa de 1 ml, lava-se a partir de urina residual da bexiga através da injecção de 200-300 ul de PBS estéril e aspirar o líquido a partir da bexiga.
4. Injectar 50 ug de HP-NAP por 150 ul de PBS para dentro da bexiga. Deixar a seringa ligado ao cateter para evitar fugas da solução de proteína. Fixe a seringa, fixando-lo à almofada com fita adesiva.
5. Após 1 hora, extrair suavemente o cateter da uretra e colocar os murganhos na gaiola, sob uma lâmpada incandescente, até que acordado.

5. tumor explantes e da análise histológica

1. No final do tratamento, sacrificar os animais, colocá-los em posições supina e corrigir as patas traseiras para a almofada com fita adesiva.
2. Usando um bisturi cirúrgico, fazer uma incisão vertical sobre a 1,52 centímetros de comprimento através da pele e doperitônio, começando logo acima genitália externa para o "fim cabeça" dos ratinhos. Para minimizar o risco de danificar a bexiga, preste especial atenção para a profundidade do corte.
3. A bexiga será posicionado no centro-esquerda do corte e do tumor será visível como uma massa rosa / violeta escuro. Após a sua excisão, colocar toda a bexiga numa gaiola histológica e fixar em 10% de formalina tamponada antes de ser embutido em parafina.
4. Para análise histológica e histoquimica imune, preparar secções em série da bexiga (46 uM de espessura) usando um micrótomo padrão.
5. Corar as secções com hematoxilina / eosina e prosseguir com o cálculo do tamanho do tumor (D xd ²⁾ e determinar a porcentagem de necrose por área transversal usando um computador assistida analisador de imagem.
6. Para a contagem navio, proceder por coloração das secções para o marcador endotelial CD31 / PECAM, usando uma técnica de imunoperoxidase padrão. Digitalizar as seções umt baixa potência (4 x) para identificar a área de maior densidade vascular. Dentro desta região, contar microvasos individuais em cinco campos aleatórios separados em alta potência (20 ×).

Resultados

A Figura 1 mostra a técnica de cateterização; o mouse é cateterizada e instilada com 0,5 × 10 ⁶ células MB49. O tratamento com HP-NAP foi iniciado 3 dias após a injecção de células tumorais, para lhes permitir fixar à parede da bexiga e proliferar. Todos os animais que pertencem ao grupo de controlo desenvolver o tumor; alguns deles podem morrer, antes do final do período de 13 dias, devido à oclusão da uretra.

Após a primeira injecção com HP-PNA,...

Discussão

A maioria dos avanços na terapia do cancro requerem testes em modelos animais antes de começar testes clínicos. A possibilidade de estudar a biologia do tumor in vivo, aproveitando-se de modelos animais, representa uma ferramenta crucial para os pesquisadores que investigam patogênese do câncer, permitindo a avaliação de diferentes abordagens terapêuticas. Modelos ortotópicos sendo o padrão-ouro ^14-15, tanto por causa da enorme quantidade de linhas celulares disponíveis para configurar um ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System