の有効性の評価<em&gt; H。ピロリ</em同所性マウスモデルにおける膀胱癌の治療のための治療ツールとして&gt;タンパク質HP-NAP

要約

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

要約

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

概要

膀胱癌は、米国¹で約75,000の新たな症例は毎年で、尿生殖路の最も一般的な癌の一つです。再発の高い割合は、膀胱癌治療のための最も高価な癌のいずれかを行う生涯フォローアップを必要とします。高品位NMIBC金標準的な治療はBCG膀胱内での免疫療法に続いて、トランス尿道的切除です。 BCGの抗腫瘍活性の正確なメカニズムは完全には解明されないままであるが、それは、Tヘルパー（TH）1と、細胞傷害性T（TC）1細胞が濃縮された細胞性免疫応答の活性化のために重要であることが認められています治療²の成功。

BCGはNMIBCのための選択の治療法が残っているという事実にもかかわらず、治療に反応しない患者の割合が高いです。しかも、それは多くの副作用を引き起こす可能性があります。処理された腫瘍の約70％は、筋肉侵襲性の形態に〜15％の進捗状況をいくつかの時間後に再発し、病気。 BCG治療に関連する他の副作用は排尿障害、膀胱炎や腎感染^3-6を含みます。

新たな治療戦略の開発は、最初のin vitroでの評価以下、考慮に前臨床モデルの使用を取る必要があります。これは、その微小環境大幅に処理し、その開発と応答性に影響を与えることができる腫瘍に特に関連します。

過去10年間、私たちはHP-NAP、細菌ヘリコバクター·ピロリによって産生されるタンパク質の免疫調節活性の複数の側面に対処している、最初に多形核細胞（PMNの^）7の内皮接着を促進することができるように同定しました。構造的には、HP-NAPは、飢餓状態の条件（DPS）ファミリー⁸下のDNA保護タンパク質に属し、12量体シェル内に配置された12の同一のサブユニットから構成されています。

我々は、HP-NAPであることが実証されていますインビトロおよびインビボの両方で ^9~10、のTh1表現型へのTリンパ球の分化を駆動するための責任強い免疫調節活性を有するToll様受容体（TLR）2アゴニスト。この活動のおかげで、HP-NAPは、アレルギー性喘息¹¹のマウスモデルにおいて、より有益なTh1応答にTh2免疫応答をリダイレクトすることができます。

HP-NAPのにTh1依存性の抗腫瘍性を評価するために、我々は、BCG投与の影響を評価するためのオドネルと同僚¹²によって、数年前に開発膀胱癌のマウスモデルを利用しました。

このプロトコルでは、我々はHP-NAPは、膀胱癌に対する強力な抗腫瘍ポテンシャルを持っていること、およびHP-NAP投与の有効性は、（インターフェロンを生産両方のTh1とTc1のリンパ球、腫瘍および所属リンパ節内に、有意な蓄積と平行していることを実証しますIFN）は^13-γ 。 HP-NAP-処置したマウスから単離された腫瘍は、より多くの壊死および未処理の対応物より少ない血管新生を示しました。

本報告書では、動物の準備、それらの尿道カテーテル、膀胱粘膜への細胞の付着、および腫瘍細胞の注射のために必要な化学燃焼を詳述、stepbystepプロトコルを提供します。また、膀胱癌の治療のために開発された任意の治療薬の原型とみなすことができるHP-NAPの局所投与を記載しています。制御とHP-NAP-処置動物から単離された腫瘍を比較することによって得られた証拠はないだけで、HP-NAPは、膀胱癌免疫療法のための優れた候補だけでなく、実験設定の一般的な有効性とすることができるという事実を強調しています。

プロトコル

動物取扱すべての手順は、保健のイタリア省（DM 2011分の204-B）によって承認されています。

1.動物

1. microisolationフィルターと個別換気ケージに生後8週間のC57BL6 / J雌マウスを育てます。
   注：その外部泌尿生殖器装置の解剖学的立体構造が男性よりカテーテル簡単に描画するため、女性が好ましいです。

2.細胞培養

1. 加湿5％CO ₂中、37℃で10％熱不活化ウシ胎児血清および50μg/ mlのゲンタマイシンを補充したRPMI 1640培地中のマウスの尿路上皮癌細胞株MB49を維持します。
2. 80％のコンフルエンスにT-75フラスコ中MB49細胞を成長させます。トリプシン処理し、0.5×10 ⁵で再懸濁-マウスでは、移植前にPBSを150μlあたり0.5×10 ^6個の細胞。

3.膀胱内腫瘍インプラント

1. （それぞれ、33ミリグラム/ kgおよび20mg / kg）麻酔薬のzoletilとxylorのミックスを使用して、マウスを麻酔、腹腔内に注射しました。
2. 仰臥位で動物を置き、スコッチテープでパッドに後ろ足を固定します。足は十分に可視およびカテーテルの挿入のために簡単にアクセス尿道口をレンダリングするために分離しなければなりません。
3. 注：カテーテルは、24 G小児静脈カテーテルは、8〜10週齢のマウスに適しています。カテーテルの選択は、尿道壁とカテーテルとの間の液体の漏れを回避するために非常に重要です。大きな穴カテーテルは大きくなったり、古いマウスを使用する必要があります。
4. 小さなニッパーを使用して、尿道の外側部分の一方の端をつまんで、マウスの「ヘッドエンド」に向かって非常に軽くねじります。このアクションは、尿道口を露出させます。
5. カテーテルの内部針を外し、45°の角度で尿道に後者を挿入し、少し指向マウスの「末尾」に向けました。カテーテルの入り口を無理に押し込まないでください。それは尿道の内側にスリップまで抵抗の場合には、ちょうど、非常に静かにカテーテルをねじります。カテーテルの約0.5〜0.8センチメートルが尿道内にある場合には、慎重にマウスの尾にカテーテル平行に配置し、それを完全に挿入します。
6. 1mlシリンジを使用して、カテーテル内に挿入しなければならないそれらの針は、滅菌PBSの200-300μLを注入することにより、残存尿から膀胱を洗浄し、膀胱からすべての液体を吸引します。
7. 注：PBSを注入すると、膀胱がいっぱいになり、腫れがマウスの後ろ足の間に表示されます。これは、カテーテルが正しいことを確認します。ほとんどのカテーテルは、注入量を計算するときに考慮しなければならないデッドボリュームを有しています。
8. 滅菌1mlシリンジを使用して、0.1 N HClを200μLを注入します。その壁全体を燃焼させるために膀胱を埋めます。 10秒後、すぐにすべての酸を除去し、neutrali滅菌シリンジで0.1 N NaOHを200μLを注入することによりぜ。細胞（0.5×10 ^6）の最大数の注入の場合には、酸性化工程は不要です。
9. 吸引し、すべての残液と直ちに滅菌PBS300μlの空洞を洗浄します。
10. 吸引によって膀胱を空にし、MB49細胞（範囲0.5×10 ⁵から0.5×10 ^6）を含むPBSを150μlを注入膀胱に。細胞の漏れを回避するために、カテーテルに組み立てられた注射器を残します。これは、スコッチテープでパッドにそれを固定することにより、シリンジを確保することをお勧めします。
11. 1時間後、静かに尿道からカテーテルを抽出し、彼らが目を覚ましまで白熱灯の下で、ケージ内にマウスを置きます。これは通常、治療の終了後1及び2時間の間に発生します。

HP-NAPの4膀胱内デリバリー

1. 注：細胞の点滴注入後、少なくとも3日、それを開始することが可能です治療。
2. ステップ3.1から3.4に記載されているようにカテーテルを挿入します。この段階では、HClを用いて膀胱壁を燃焼させる必要がありません。
3. 1ミリリットル注射器を用いて、滅菌PBSの200〜300μLを注入することにより、残留尿から膀胱を洗浄し、膀胱からすべての液体を吸引します。
4. 膀胱内に150μlのPBSあたりHP-NAP50μgのを注入します。タンパク質溶液の漏れを回避するためにカテーテルに取り付けたシリンジのままにしておきます。スコッチテープでパッドにそれを固定することにより、注射器を固定します。
5. 彼らが目を覚ましまで、白熱灯の下で、1時間後、静かに尿道からカテーテルを抽出し、ケージ内にマウスを置きます。

5.腫瘍外植片および組織学的分析

1. 処理の終わりに、動物を犠牲に仰向けの位置にそれらを配置し、スコッチテープでパッドに後ろ足を固定します。
2. 手術用メスを用いて、皮膚を​​通して約1.52センチメートル長い縦切開を作ります腹膜は、マウスの「ヘッドエンド」にちょうど外性器の上に出発します。膀胱を損傷する危険性を最小限に抑えるために、カットの深さに特に注意を払います。
3. 膀胱は、カットの中央左に配置されますと、腫瘍は濃いピンク/バイオレット質量として表示されます。その切除の際に、組織学的ケージに膀胱全体を配置し、パラフィンに包埋する前に、10％緩衝ホルマリンで固定します。
4. 組織学的および免疫組織化学的分析のために、標準的なミクロトームを用いて膀胱（46ミクロン厚）の連続切片を準備します。
5. ヘマトキシリン/エオシンを持つセクションを染色し、腫瘍の大きさ（DのXD ^2）、コンピュータ支援画像解析装置を用いて、断面積あたりの壊死の割合を決定するための計算を進めます。
6. 血管計数は、標準的な免疫ペルオキシダーゼ技術を用いて、内皮マーカーCD31 / PECAMためのセクションを染色することによって進行します。セクションをスキャン最高の血管密度の領域を特定するために（4×）、低消費電力をトン。この領域内では、高出力（20×）で5つの別々のランダムな分野で個々の微小血管をカウントします。

結果

図1は、カテーテル法を示す図です。マウスは、カテーテルを挿入し、0.5×10 ⁶ MB49細胞を点滴注入されます。 HP-NAPによる治療は、膀胱壁に付着し、増殖することを可能にするために、3日目の腫瘍細胞の注射後に開始されます。対照群に属する全ての動物は腫瘍を発症します。それらのいくつかは、尿道の閉塞による13日間の期間の終了前に死亡することがあります。

ディスカッション

癌治療の進歩の大部分は、臨床試験を開始する前に、動物モデルでテストを必要とします。動物モデルを利用して、 インビボでの腫瘍生物学を研究する可能性は、異なる治療法の評価を可能とする、癌の発病を調査する研究者のための重要なツールです。同所モデルは、腫瘍モデルを設定し、それらが天然に存在する腫瘍¹⁶の環境を模倣するためにするための細胞株の膨大な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System