Évaluation de l&#39;efficacité de la<em&gt; H. pylori</em&gt; Protéines HP-NAP comme outil thérapeutique pour le traitement du cancer de la vessie dans un modèle murin orthotopique

Résumé

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Résumé

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Introduction

Cancer de la vessie est l'un des cancers les plus fréquents de l'appareil génito-urinaire, avec près de 75 000 nouveaux cas chaque année aux Etats-Unis ^1. Les taux élevés de récidive nécessitent tout au long du suivi, ce qui rend le cancer de la vessie l'un des cancers les plus coûteuses à traiter. Le traitement de référence pour la haute qualité CVSEM est la résection trans-urétrale, suivie par immunothérapie intravésicale avec le BCG. Bien que le mécanisme précis de l'activité anti-tumorale de BCG doit encore être élucidé, il est admis que l'activation d'une réponse immunitaire à médiation cellulaire enrichie en lymphocytes T auxiliaires (Th) et une T cytotoxiques (Tc) une des cellules est essentiel pour la réussite de la thérapie ^2.

Malgré le fait que le BCG reste le traitement de choix pour CVSEM, une forte proportion de patients ne répondent pas à la thérapie; En outre, il peut causer un certain nombre d'effets secondaires: environ 70% des tumeurs traitées réapparaissent après un certain temps et ~ 15% progrès à la forme du muscle-invasivemaladie. D'autres effets secondaires associés au traitement par le BCG comprennent dysurie, cystite et une infection des reins ^3-6.

Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques doit prendre en considération l'utilisation de modèles précliniques, après évaluation initiale in vitro; ceci est particulièrement pertinent dans les tumeurs dont microenvironnement peut influencer de manière significative leur développement et leur réponse au traitement.

Au cours de la dernière décennie, nous avons abordé plusieurs aspects de l'activité de modulation immunitaire de HP-NAP, une protéine produite par la bactérie Helicobacter pylori, initialement identifiée comme capable de favoriser l'adhésion endothéliale de polynucléaires (PMN) ^7. Structurellement, HP-NAP appartient à la protéine d'ADN-protecteur dans des conditions affamés (DPS) de la famille ⁸ et se compose de 12 sous-unités identiques disposées dans une enveloppe dodecameric.

Nous avons démontré que HP-NAP estun récepteur de type Toll (TLR) 2 agoniste, avec une activité immuno-modulation fort responsable de la conduite de la différenciation des lymphocytes T vers le phénotype Th1, à la fois in vitro et in vivo ^10/09. En vertu de cette activité, HP-NAP est capable de rediriger la réponse immunitaire Th2 en réponse Th1 la plus bénéfique dans un modèle murin d'asthme allergique ^11.

Pour évaluer le potentiel anti-tumoral Th1 dépendante de HP-NAP, nous avons profité d'un modèle murin de cancer de la vessie développé il ya plusieurs années par O'Donnel et ses collègues ¹² pour évaluer l'impact de l'administration du BCG.

Avec ce protocole, nous démontrons que HP-NAP a un potentiel anti-tumoral puissant contre le cancer de la vessie et que l'efficacité de l'administration HP-NAP est parallèle à l'accumulation importante, dans les noeuds de la tumeur et les ganglions lymphatiques régionaux, à la fois des lymphocytes de type Th1 et Tc1 produire de l'interféron ( IFN) -γ ¹³ . Les tumeurs isolées de souris HP-NAP-traités ont montré une nécrose plus et moins vascularisation de la contrepartie non traitée.

Le présent rapport fournit un protocole de stepbystep, détaillant la préparation des animaux, leur cathétérisme urétral, la combustion chimique nécessaire pour la fixation des cellules de la muqueuse de la vessie, et l'injection de cellules tumorales. Nous décrivons également l'administration topique de HP-NAP qui peut être considéré comme un prototype de tous les agents thérapeutiques développées pour le traitement du cancer de la vessie. Les preuves obtenues en comparant les tumeurs isolées de contrôle et HP-NAP-animaux traités souligne non seulement le fait que HP-NAP pourrait être un bon candidat pour l'immunothérapie du cancer de la vessie, mais aussi l'efficacité générale de l'installation expérimentale.

Protocole

Toutes les procédures de manipulation des animaux ont été approuvés par le ministère italien de la Santé (DM 204/2011-B).

1. Les animaux

1. Cultivez souris femelles C57BL6 / J 8 semaines d'âge dans les cages individuellement ventilées avec des filtres de microisolation.
   Note: Les femelles sont préférés car la conformation anatomique de leur appareil uro-génital externe rend le cathétérisme plus facile que chez les hommes.

2. Culture cellulaire

1. Maintenir la lignée cellulaire de carcinome urothélial de la souris MB49 en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé à la chaleur et 50 ug / ml de gentamicine à 37 ° C humidifié à 5% de CO _2.
2. Cultiver les cellules MB49 dans des flacons T-75 à 80% de confluence. Trypsiniser et remettre en suspension à 0,5 x 10 ⁵ à 0,5 x 10 ⁶ cellules par 150 pi de PBS avant l'implantation chez la souris.

3. intravésicale tumeur Implant

1. Anesthésier les souris en utilisant un mélange des anesthésiques et Zoletil Xylor (33 mg / kg et 20 mg / kg, respectivement), injecté par voie intraperitoneale.
2. Placez les animaux dans une position couchée et fixer les pattes de derrière pour le tampon avec du scotch. Pattes doivent être suffisamment séparés pour rendre le méat urétral bien visible et facilement accessible pour l'insertion du cathéter.
3. Remarque: Pour le cathétérisme, un cathéter veineux pédiatrique 24 G est adapté pour les souris 8 à 10 semaines-vieux. Le choix du cathéter est très important afin d'éviter les fuites de liquide entre la paroi de l'urètre et du cathéter. Cathéters plus larges de forage doivent être utilisés pour les souris plus grands ou plus.
4. En utilisant une petite pince, pincez un bord de la partie externe de l'urètre et de le tordre très doucement vers la "tête" de la souris. Cette action expose le méat urétral.
5. Retirer l'aiguille du cathéter interne et insérer celle-ci dans l'urètre d'un angle de 45 °, légèrement orientéevers la "queue" de la souris. Ne pas forcer l'entrée du cathéter; en cas de résistance, il suffit de tourner le cathéter très doucement, jusqu'à ce qu'il glisse à l'intérieur de l'urètre. Quand environ 0,5-0,8 cm du cathéter est dans l'urètre, placer soigneusement le cathéter parallèle à la queue des souris et insérez-le complètement.
6. En utilisant une seringue de 1 ml, l'aiguille de laquelle doit être insérée dans le cathéter, laver la vessie de l'urine résiduelle en injectant 200 à 300 ul de PBS stérile et aspirer tout le liquide de la vessie.
7. Remarque: Lors de l'injection du PBS, la vessie se remplira et un gonflement sera visible entre les pattes arrières des souris; ceci confirme que le cathétérisme est correcte. La plupart des cathéters ont un volume mort qui doit être considéré dans le calcul du volume d'injection.
8. En utilisant une seringue de 1 ml stérile, injecter 200 pi de HCl 0,1. Remplissez la vessie afin de brûler toute sa paroi. Après 10 sec, retirer tout l'acide et neutrali immédiatementze par injection de 200 ul de NaOH 0,1 N avec une seringue stérile. En cas d'injection du plus grand nombre de cellules (0,5 x 10 ^6), l'étape d'acidification est pas nécessaire.
9. Aspirer tout le liquide résiduel et rincer immédiatement la cavité avec 300 pi de PBS stérile.
10. Vider la vessie par aspiration, et injecter 150 pi de PBS contenant des cellules MB49 (gamme 0,5 x 10 ⁵ à 0,5 × 10 ⁶⁾ dans la vessie. Laisser la seringue monté sur le cathéter afin d'éviter la fuite des cellules. Il est préférable de fixer la seringue en le fixant sur le tampon avec du scotch.
11. Après 1 heure, extrait doucement le cathéter à partir de l'urètre, et de placer les souris dans la cage, sous une lampe à incandescence jusqu'à leur réveil: cela se produit habituellement entre une et deux heures après la fin du traitement.

4. Livraison intravésicale de HP-NAP

1. Remarque: Au moins 3 jours après l'instillation de cellules, il est possible de commencer latraitement.
2. Cathétériser la manière décrite dans les étapes 3.1 à 3.4. A ce stade, il ne faut pas brûler la paroi de la vessie avec HCl.
3. En utilisant une seringue de 1 ml, laver la vessie de l'urine résiduelle en injectant 200 à 300 ul de PBS stérile et aspirer tout le liquide de la vessie.
4. Injecter 50 pg de HP-NAP par 150 ul de PBS dans la vessie. Laisser la seringue fixée au cathéter pour éviter une fuite de la solution de protéine. Fixer la seringue en la fixant à la pastille avec du scotch.
5. Après 1 heure, extrait doucement le cathéter de l'urètre et de placer les souris dans la cage, sous une lampe à incandescence, jusqu'à ce qu'ils se réveillent.

5. Tumeur explants et de l'analyse histologique

1. A la fin du traitement, sacrifier les animaux, les placer dans les positions couchée et fixer les pattes de derrière pour le tampon avec du scotch.
2. Avec un scalpel chirurgical, faire une incision verticale d'environ 1,52 cm de long à travers la peau et de lapéritoine, en commençant juste au-dessus des organes génitaux externes de la "tête" de la souris. Pour minimiser le risque d'endommager la vessie, accorder une attention particulière à la profondeur de la coupe.
3. La vessie sera placé dans le centre-gauche de la coupe et la tumeur sera visible comme une masse rose / violet foncé. Lors de son excision, placer toute la vessie dans une cage histologique et fixer 10% de formol tamponné avant de l'intégrer dans de la paraffine.
4. Pour l'analyse histologique et histochimique immunitaire, préparer des coupes en série de la vessie (46 um d'épaisseur de) en utilisant un microtome standard.
5. Colorer les sections avec hématoxyline / éosine et procéder au calcul de la taille de la tumeur (D xd ²⁾ et déterminer le pourcentage de la nécrose par zone transversale en utilisant un analyseur d'image assistée par ordinateur.
6. Pour récipient comptage, procéder par coloration des sections pour le marqueur endothelial CD31 / PECAM, en utilisant une technique d'immunoperoxydase standard. Scannez les sections d'unt faible puissance (4 ×) pour identifier la zone de la densité vasculaire plus élevé. Dans cette région, compter microvaisseaux individuels dans cinq champs aléatoires distincts à haute puissance (20 ×).

Résultats

La figure 1 illustre la technique de cathétérisation; la souris est sondé et inculqué avec 0,5 × 10 ⁶ cellules MB49. Le traitement avec HP-NAP est démarré 3 jours après l'injection des cellules tumorales, pour leur permettre de fixer sur la paroi de la vessie et proliférer. Tous les animaux appartenant au groupe de contrôle développer la tumeur; certains d'entre eux peuvent mourir avant la fin de la période de 13 jours en raison de l'occlusion de l'urètre.

Discussion

La majorité des avancées dans le traitement du cancer nécessitent des essais sur des modèles animaux avant de commencer les essais cliniques. La possibilité d'étudier la biologie des tumeurs in vivo, profitant de modèles animaux, représente un outil essentiel pour les chercheurs de l'enquête pathogenèse du cancer, permettant l'évaluation des différentes approches thérapeutiques. Orthotopiques modèles restent l'étalon-or ^14-15, à la fois en raison de l'énorme quant...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System