Valutazione dell&#39;efficacia della<em&gt; H. pylori</em&gt; Proteine ​​HP-NAP come strumento terapeutico per il trattamento del cancro della vescica in un ortotopico Modello murino

Riepilogo

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Abstract

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Introduzione

Il cancro della vescica è uno dei tumori più comuni del tratto urogenitale, con circa 75.000 nuovi casi ogni anno negli Stati Uniti ^1. Alti tassi di recidiva richiedono un follow-up per tutta la vita, il che rende il cancro della vescica uno dei tumori più costoso da trattare. Il trattamento gold standard per l'alta qualità NMIBC è la resezione trans-uretrale, seguita da immunoterapia intravescicale con BCG. Sebbene il meccanismo preciso della attività anti-tumorale di BCG rimane da chiarire, si ammette che l'attivazione di una risposta immune cellulo-mediata arricchito in T helper (Th) 1 e T citotossici (Tc) 1 cellule è fondamentale per il successo della terapia ^2.

Nonostante il fatto che BCG rimane il trattamento di scelta per NMIBC, un'alta percentuale di pazienti non rispondono alla terapia; inoltre può causare una serie di effetti collaterali: circa il 70% dei tumori trattati ripresentarsi dopo qualche tempo e ~ 15% di avanzamento al modulo muscolo-invasivo dellamalattia. Altri effetti indesiderati associati al trattamento con BCG comprendono disuria, cistiti e infezioni renali ^3-6.

Lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche deve prendere in considerazione l'uso di modelli preclinici, dopo valutazione iniziale in vitro; questo è particolarmente rilevante nei tumori le cui microambiente possono influenzare in modo significativo il loro sviluppo e la risposta al trattamento.

Negli ultimi dieci anni, abbiamo affrontato molteplici aspetti dell'attività immunomodulante di HP-NAP, una proteina prodotta dal batterio Helicobacter pylori, inizialmente identificato come in grado di promuovere l'adesione endoteliale di cellule polimorfonucleati (PMN) ^7. Strutturalmente, HP-NAP appartiene alla proteina-DNA protezione in condizioni di fame (Dps) famiglia ⁸ e si compone di 12 subunità identiche disposte in un guscio dodecameric.

Abbiamo dimostrato che HP-NAP èun recettore Toll-like (TLR) 2 agonisti, con una forte attività immunomodulante responsabile per guidare la differenziazione dei linfociti T verso il fenotipo Th1, sia in vitro che in vivo ^9-10. In virtù di tale attività, HP-NAP è in grado di reindirizzare la risposta immunitaria Th2 nella risposta Th1 più vantaggioso in un modello murino di asma allergica ^11.

Per valutare il potenziale anti-tumorale Th1-dipendente di HP-NAP, abbiamo approfittato di un modello murino di cancro alla vescica sviluppato diversi anni fa da O'Donnel e colleghi ¹² per valutare l'impatto della gestione BCG.

Con questo protocollo, dimostriamo che HP-NAP ha un forte potenziale antitumorale contro il cancro alla vescica e che l'efficacia della somministrazione di HP-NAP parallelo l'accumulo significativo, all'interno dei nodi del tumore e linfonodi regionali, di entrambi i linfociti Th1 e Tc1 produzione di interferone ( IFN) -γ ¹³ . Tumori isolati da topi HP-NAP-trattati hanno mostrato più di necrosi e meno vascolarizzazione rispetto alla controparte non trattato.

La presente relazione fornisce un protocollo passo per passo, in dettaglio la preparazione degli animali, la cateterizzazione uretrale, la combustione chimica necessaria per il fissaggio delle cellule di mucosa vescicale, e l'iniezione delle cellule tumorali. Noi descriviamo anche la somministrazione topica di HP-NAP che può essere considerato come un prototipo di agenti terapeutici sviluppati per il trattamento del cancro della vescica. Le prove ottenute confrontando i tumori isolati dal controllo e HP-NAP-animali trattati non solo sottolinea il fatto che HP-NAP potrebbe essere un buon candidato per l'immunoterapia del cancro della vescica, ma anche l'efficacia generale del set up sperimentale.

Protocollo

Tutte le procedure per la movimentazione degli animali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (204/2011-B DM).

1. Gli animali

1. Grow C57BL6 / J topi femmina a 8 settimane di età in gabbie a ventilazione individuale con filtri microisolation.
   Nota: Le femmine sono preferiti perché la conformazione anatomica del loro apparato uro-genitale esterno rende la cateterizzazione più facile che nei maschi.

Culture 2. Cella

1. Mantenere il mouse uroteliale linea cellulare di carcinoma MB49 in RPMI 1640 supplementato con mezzo di siero bovino fetale inattivato al calore 10% e 50 ug / ml di gentamicina a 37 ° C in umidificata al 5% CO _2.
2. Crescere cellule MB49 in T-75 palloni al 80% di confluenza. Trypsinize e risospendere a 0.5 × 10 ^5-0,5 × 10 ⁶ cellule per 150 ml di PBS prima dell'impianto in topi.

3. intravescicale Tumore Implant

1. Anestetizzare topi utilizzando una miscela del Zoletil anestetici e xylor (33 mg / kg e 20 mg / kg, rispettivamente), iniettata per via intraperitoneale.
2. Mettere gli animali in posizione supina e fissare le zampe posteriori per il pad con lo scotch. Zampe devono essere sufficientemente separati per rendere il meato ben visibile e facilmente accessibile per l'inserimento del catetere uretrale.
3. Nota: per la cateterizzazione, un catetere venoso pediatrico 24 G è adatto per 8 a 10 settimane di età topi. La scelta del catetere è molto importante al fine di evitare infiltrazioni di liquidi tra la parete ed il catetere uretrale. Grandi cateteri calibro devono essere usati per i topi più grandi o più anziani.
4. Usando un piccolo pinza, un pizzico uno spigolo della parte esterna dell'uretra e ruotarlo molto dolcemente verso il "lato testa" dei topi. Questa azione espone il meato uretrale.
5. Rimuovere l'ago interno del catetere e inserire quest'ultimo nell'uretra con un angolo di 45 °, leggermente orientataverso la "coda" dei topi. Non forzare l'ingresso del catetere; in caso di resistenza, basta ruotare il catetere molto delicatamente, fino a farlo scivolare all'interno dell'uretra. Quando circa 0.5-0.8 cm del catetere è nell'uretra, posizionare accuratamente il catetere parallelo alla coda dei topi e inserirla completamente.
6. Usando una siringa da 1 ml, l'ago che deve essere inserito nel catetere, lavare la vescica da urina residua iniettando 200-300 ml di PBS sterile e aspirare tutto il liquido dalla vescica.
7. Nota: Quando si somministra PBS, la vescica si riempirà e un gonfiore sarà visibile tra le zampe posteriori dei topi; Questo conferma che la cateterizzazione sia corretto. La maggior parte dei cateteri hanno un volume morto che deve essere considerato nel calcolo del volume di iniezione.
8. Usando una siringa sterile da 1 ml, iniettare 200 ml di 0,1 N HCl. Riempire la vescica al fine di bruciare tutta la sua parete. Dopo 10 secondi, rimuovere tutto l'acido e neutrali subitoze iniettando 200 ml di 0,1 N NaOH con una siringa sterile. In caso di iniezione del maggior numero di cellule (0,5 x 10 ^6), la fase di acidificazione non è necessaria.
9. Aspirare tutto il liquido residuo e sciacquare immediatamente la cavità con 300 ml di PBS sterile.
10. Svuotare la vescica tramite aspirazione, e iniettare 150 ml di PBS contenenti cellule MB49 (range 0,5 × 10 ⁵ - 0,5 x 10 ⁶⁾ nella vescica. Lasciare la siringa assemblata al catetere per evitare la fuoriuscita di cellule. E 'meglio per garantire la siringa fissandolo al pad con lo scotch.
11. Dopo 1 ora, estrarre delicatamente il catetere dall'uretra, e posizionare i topi nella gabbia, sotto una lampada a incandescenza finché si svegliano: questo avviene di solito tra 1 e 2 ore dopo la fine del trattamento.

4. Consegna intravescicale di HP-NAP

1. Nota: Almeno 3 giorni dopo instillazione cella, è possibile iniziare latrattamento.
2. Cateterizzare come descritto ai punti da 3.1 a 3.4. In questa fase, non è necessario per bruciare la parete della vescica con HCl.
3. Usando una siringa da 1 ml, lavare la vescica da urina residua iniettando 200-300 ml di PBS sterile e aspirare tutto il liquido dalla vescica.
4. Iniettare 50 mg di HP-NAP per 150 l di PBS nella vescica. Lasciare la siringa attaccata al catetere per evitare perdite della soluzione proteica. Fissare la siringa fissandolo al pad con lo scotch.
5. Dopo 1 ora, estrarre delicatamente il catetere dall'uretra e posizionare i topi nella gabbia, sotto una lampada ad incandescenza, fino si svegliano.

5. tumorale espianti e analisi istologica

1. Alla fine del trattamento, sacrificare gli animali, metterli in posizione supina e fissare le zampe posteriori per il pad con lo scotch.
2. Usando un bisturi chirurgico, fare un'incisione verticale lunga circa 1,52 centimetri attraverso la pelle e laperitoneo, a partire proprio sopra genitali esterni alla "testata" dei topi. Per minimizzare il rischio di danneggiare la vescica, prestare particolare attenzione alla profondità del taglio.
3. La vescica sarà posizionato nel centro-sinistra del taglio e il tumore sarà visibile come una massa di colore rosa / viola scuro. Al momento della sua escissione, posizionare l'intera vescica in una gabbia istologico e fissare nel 10% formalina tamponata prima inclusione in paraffina.
4. Per analisi istologiche e istochimiche immunitario, preparare sezioni seriali della vescica (46 micron di spessore) con un microtomo standard.
5. Macchiare le sezioni con ematossilina / eosina e procedere con il calcolo della dimensione del tumore (D xd ²⁾ e determinando la percentuale di necrosi per area della sezione trasversale utilizzando un computer assistita analizzatore di immagini.
6. Per il conteggio nave, procedere colorazione delle sezioni per il marcatore endoteliale CD31 / PECAM, utilizzando una tecnica dell'immunoperossidasi standard. Eseguire la scansione delle sezioni di unat bassa potenza (4 ×) per identificare la zona di massima densità vascolare. All'interno di questa regione, contare i singoli microvasi in cinque campi aleatori separati ad alta potenza (20 ×).

Risultati

La Figura 1 mostra la tecnica di cateterizzazione; il mouse è cateterizzato e instillato con 0,5 × 10 ⁶ MB49 cellule. Il trattamento con HP-NAP è iniziato 3 giorni dopo l'iniezione di cellule tumorali, per consentire loro di attaccare alla parete della vescica e proliferare. Tutti gli animali appartenenti al gruppo di controllo sviluppano tumore; alcuni di essi possono morire prima della fine del periodo di 13 giorno a causa dell'occlusione dell'uretra.

Discussione

La maggior parte dei progressi nella terapia del cancro richiede test su modelli animali prima di iniziare le sperimentazioni cliniche. La possibilità di studiare biologia tumorale in vivo, approfittando di modelli animali, rappresenta uno strumento fondamentale per i ricercatori che studiano patogenesi del cancro, consentendo la valutazione dei diversi approcci terapeutici. Modelli ortotopico rimangono il gold standard ^14-15, sia per l'enorme quantità di linee cellulari disponibili per imposta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System