Evaluación de la eficacia de la<em&gt; H. pylori</em&gt; Proteína HP-PAN como herramienta terapéutica para el tratamiento de cáncer de vejiga en un modelo murino ortotópico

Resumen

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Resumen

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Introducción

El cáncer de vejiga es uno de los cánceres más comunes del tracto urogenital, con cerca de 75.000 nuevos casos cada año en los EE.UU. ^1. Las altas tasas de recurrencia requieren seguimiento de por vida, lo que hace que el cáncer de vejiga uno de los cánceres más costosas de tratar. El tratamiento estándar de oro para el alto grado CVNMI es la resección transuretral, seguida de inmunoterapia intravesical con BCG. Aunque el mecanismo exacto de la actividad anti-tumor de BCG aún no se ha aclarado completamente, se acepta que la activación de una respuesta inmune mediada por células enriquecido en T helper (Th) 1 y T citotóxicas (Tc) de las células 1 es crucial para el éxito de la terapia ^2.

A pesar de que la BCG sigue siendo el tratamiento de elección para CVNMI, una alta proporción de los pacientes no responden a la terapia; por otra parte, puede causar una serie de efectos secundarios: alrededor del 70% de los tumores tratados se repita después de algún tiempo y ~ 15% de avance a la forma del músculo invasivo de laenfermedad. Otros efectos secundarios asociados con el tratamiento con BCG incluyen disuria, cistitis y la infección renal ^3-6.

El desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas debe tomar en consideración el uso de modelos preclínicos, tras la evaluación inicial in vitro; esto es particularmente relevante en tumores cuya microambiente puede influir significativamente en su desarrollo y la capacidad de respuesta al tratamiento.

Durante la última década, hemos abordado varios aspectos de la actividad inmunomoduladora de HP-PAN, una proteína producida por la bacteria Helicobacter pylori, identificado inicialmente como capaz de promover la adhesión endotelial de las células polimorfonucleares (PMN) ^7. Estructuralmente, HP-PAN pertenece a la proteína DNA-protector en condiciones de hambre (AD) de la familia ⁸ y consta de 12 subunidades idénticas dispuestas en una cáscara dodecameric.

Hemos demostrado que HP-NAP esun receptor Toll-like (TLR) 2 agonista, con una fuerte actividad inmuno-modulación responsable de impulsar la diferenciación de los linfocitos T hacia el fenotipo Th1, tanto in vitro como in vivo ^9-10. En virtud de esta actividad, HP-PAN es capaz de redirigir la respuesta inmune Th2 en la respuesta más beneficiosa Th1 en un modelo murino de asma alérgica ^11.

Para evaluar el potencial antitumoral Th1 dependiente de HP-PAN, nos aprovechamos de un modelo de ratón de cáncer de vejiga desarrollado hace varios años por O'Donnel y sus colegas ¹² para evaluar el impacto de la administración de BCG.

Con este protocolo, nos demuestran que HP-PAN tiene un fuerte potencial antitumoral contra el cáncer de vejiga y que la eficacia de la administración de HP-PAN es paralela a la acumulación significativa, dentro del tumor y los ganglios linfáticos regionales, tanto de Th1 y Tc1 linfocitos que producen interferón ( IFN) -γ ¹³ . Los tumores aislados a partir de ratones tratados con HP-NAP mostraron necrosis más y menos vascularización que la contraparte no tratada.

El presente informe proporciona un protocolo stepbystep, que detalla la preparación de los animales, su cateterismo uretral, la quema químico requerido para la unión de las células a la mucosa de la vejiga, y la inyección de las células tumorales. También describimos la administración tópica de HP-NAP que se puede considerar como un prototipo de cualesquiera agentes terapéuticos desarrollados para el tratamiento de cáncer de vejiga. La evidencia obtenida mediante la comparación de los tumores aislados de control y HP-PAN-animales tratados enfatiza no sólo el hecho de que HP-PAN podría ser un buen candidato para la inmunoterapia del cáncer de vejiga, sino también la eficacia general del montaje experimental.

Protocolo

Todos los procedimientos de manipulación de los animales han sido aprobados por el Ministerio italiano de Salud (204/2011-B DM).

1. Los animales

1. Crecer ratones hembras C57BL6 / J a 8 semanas de edad en jaulas ventiladas individualmente con filtros microaislamiento.
   Se prefieren las hembras porque la conformación anatómica de su aparato uro-genital externa hace que el cateterismo más fácil que en los hombres: Nota.

2. Cultivo Celular

1. Mantener la urotelial ratón línea celular de carcinoma MB49 en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 50 mg / ml de gentamicina a 37 ° C en humidificado 5% CO _2.
2. Crecer células MB49 en matraces T-75 a 80% de confluencia. Trypsinize y resuspender en el 0,5 × 10 ^{5 a} 0,5 × 10 ⁶ células por 150 l de PBS antes de la implantación en ratones.

3. intravesical tumor Implante

1. Anestesiar ratones utilizando una mezcla de la Zoletil anestésicos y xylor (33 mg / kg y 20 mg / kg, respectivamente), inyectado por vía intraperitoneal.
2. Coloque los animales en posición supina y fijar las patas traseras a la plataforma con cinta scotch. Patas tienen que ser separados suficientemente para hacer que el meato uretral bien visible y fácilmente accesible para la inserción del catéter.
3. Nota: Para el cateterismo, un catéter venoso pediátrico 24 G es adecuado para ratones 8 a 10 semanas de edad. La elección del catéter es muy importante con el fin de evitar fugas de líquido entre la pared uretral y el catéter. Catéteres de calibre más grandes deben ser utilizados para los ratones más grandes o más.
4. Utilizando una pequeña pinza, apriete uno de los bordes de la parte externa de la uretra y girar suavemente hacia la "cabecera" de los ratones. Esta acción expone el meato uretral.
5. Retire la aguja interna del catéter e insertar este último en la uretra en un ángulo de 45 °, orientado ligeramentehacia la "cola" de los ratones. No fuerce la entrada del catéter; en caso de resistencia, simplemente gire el catéter con mucha suavidad, hasta que se desliza dentro de la uretra. Cuando aproximadamente 0,5-0,8 cm del catéter es en la uretra, colocar cuidadosamente el catéter paralelo a la cola de los ratones y se inserte completamente.
6. Usando una jeringa de 1 ml, la aguja de los cuales tiene que ser insertado en el catéter, lavar la vejiga de la orina residual mediante la inyección de 200-300 l de PBS estéril y aspirar todo el líquido de la vejiga.
7. Nota: Cuando la inyección de PBS, la vejiga se llenará y una hinchazón será visible entre las patas traseras de los ratones; esto confirma que el cateterismo es la correcta. La mayoría de los catéteres tienen un volumen muerto que debe ser considerado en el cálculo del volumen de inyección.
8. Usando una jeringa de 1 ml estéril, inyectar 200 l de HCl 0,1 N. Llene la vejiga para quemar toda su pared. Después de 10 segundos, retire todo el ácido y neutrali inmediatamenteze mediante la inyección de 200 l de NaOH 0,1 N con una jeringa estéril. En el caso de la inyección del mayor número de células (0,5 × 10 ^6), no se requiere la etapa de acidificación.
9. Aspire todo el líquido residual e inmediatamente echar la cavidad con 300 l de PBS estéril.
10. Vaciar la vejiga por aspiración, e inyectar 150 l de PBS que contienen células MB49 (rango de 0,5 × 10 ^{5 a} 0,5 × 10 ⁶⁾ en la vejiga. Deje la jeringa montada en el catéter para evitar la fuga de células. Es mejor para asegurar la jeringa fijándolo a la plataforma con cinta scotch.
11. Después de 1 hora, extraer suavemente el catéter de la uretra, y colocar los ratones en la jaula, bajo una lámpara incandescente hasta que despiertan: esto ocurre generalmente entre 1 y 2 horas después del final del tratamiento.

4. Entrega intravesical de HP-PAN

1. Nota: Por lo menos 3 días después de la instilación de células, es posible comenzar latratamiento.
2. Cateterizarse como se describe en los pasos 3.1 a 3.4. En esta etapa, no es necesario para quemar la pared de la vejiga con HCl.
3. Usando una jeringa de 1 ml, lavar la vejiga de la orina residual mediante la inyección de 200-300 l de PBS estéril y aspirar todo el líquido de la vejiga.
4. Inyectar 50 g de HP-PAN por 150 l de PBS en la vejiga. Deje la jeringa conectada al catéter para evitar la fuga de la solución de proteína. Asegure la jeringa fijándolo a la plataforma con cinta scotch.
5. Después de 1 hora, extraer suavemente el catéter de la uretra y colocar los ratones en la jaula, bajo una lámpara incandescente, hasta que se despiertan.

5. tumor explantes y el análisis histológico

1. Al final del tratamiento, sacrificar a los animales, colocarlos en posición supina y fijar las patas traseras a la plataforma con cinta scotch.
2. El uso de un bisturí quirúrgico, hacer una incisión vertical sobre 1,52 cm de largo a través de la piel y elperitoneo, empezando justo por encima de los genitales externos de la "cabecera" de los ratones. Para minimizar el riesgo de dañar la vejiga, prestar especial atención a la profundidad del corte.
3. La vejiga se colocará en el centro-izquierda de la corte y el tumor será visible como una masa de color rosa / violeta oscuro. Tras su escisión, coloque toda la vejiga en una jaula histológico y fijar en el 10% formalina tamponada antes de la incrustación en parafina.
4. Para análisis histológico e histoquímico inmune, preparar secciones en serie de la vejiga (46 micras de espesor) usando un microtomo estándar.
5. Tinción de las secciones con hematoxilina / eosina y proceder con el cálculo del tamaño del tumor (D xd ²⁾ y determinar el porcentaje de necrosis por área de sección transversal usando un analizador de imagen asistida por ordenador.
6. Para el conteo buque, proceder por la tinción de las secciones para el marcador endotelial CD31 / PECAM, utilizando una técnica de inmunoperoxidasa estándar. Analiza las secciones de unt baja potencia (4 ×) para identificar el área de mayor densidad vascular. Dentro de esta región, cuente microvasos individuales en cinco campos aleatorios independientes a alta potencia (20 ×).

Resultados

La Figura 1 muestra la técnica de cateterismo; el ratón se cateterizó y inculca con 0,5 × 10 ⁶ células MB49. El tratamiento con HP-NAP se inicia 3 días después de la inyección de las células tumorales, para que puedan adherirse a la pared de la vejiga y proliferar. Todos los animales pertenecientes al grupo de control se desarrollan el tumor; algunos de ellos pueden morir antes del final del período de 13 días debido a la oclusión de la uretra.

Despué...

Discusión

La mayoría de los avances en el tratamiento del cáncer requiere pruebas en modelos animales antes de comenzar los ensayos clínicos. La posibilidad de estudiar la biología del tumor in vivo, aprovechando modelos animales, representa una herramienta fundamental para los investigadores que investigan la patogénesis del cáncer, lo que permite la evaluación de los diferentes enfoques terapéuticos. Modelos ortotópico siguen siendo el estándar de oro ^14-15, tanto debido a la enorme cantidad de lí...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System