التصوير المباشر لالبطانة العصبية سيليا في البطينات الجانبية للدماغ الفأر

Summary

باستخدام عالية الدقة تدخل الفرق النقيض (DIC) المجهري، ويتجلى ملاحظة المجراة سابقا من ضرب أهداب بطانية عصبية متحركة تقع داخل البطينات الدماغية الماوس عن طريق الحية التصوير. هذه التقنية تتيح للتسجيل فريدة من نوعها تردد الهدبية الضرب والضرب زاوية وكذلك الكالسيوم داخل الخلايا خصائص التذبذب سرعة الخاصة بهم.

Abstract

خلايا البطانة العصبية Multiciliated خط البطينين في الدماغ الكبار. ويرتبط ظيفة غير طبيعية أو بنية أهداب بطانية عصبية مع مختلف عجز عصبي. التيار فيفو السابقين التصوير المباشر متحركة تقنية أهداب البطانة العصبية يسمح لدراسة تفصيلية لديناميات الهدبية بعد عدة خطوات. وتشمل هذه الخطوات: الفئران القتل الرحيم مع ثاني أكسيد الكربون وفقا لبروتوكولات جامعة الرعاية المؤسسية توليدو الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)؛ قطع القحف تليها إزالة المخ وسهمي تشريح الدماغ مع vibratome أو شفرة حادة للحصول على المقاطع رقيقة جدا من خلال البطينين الوحشي الدماغ، حيث يمكن تصور أهداب بطانية عصبية. حضانة شرائح الدماغ في لوحة من الزجاج السفلي مخصصة تحتوي على التعديل النسر المتوسطة (DMEM) / ارتفاع الجلوكوز، Dulbecco وعند 37 درجة مئوية في ظل وجود 95٪ / 5٪ O ₂ / CO ₂ مزيج أمر ضروري للحفاظ على الأنسجة على قيد الحياة خلالالتجربة. ثم يتم تسجيل الفيديو من الضرب أهداب باستخدام مجهر تدخل الفرق التباين العالي الدقة. ثم يتم الفيديو تحليل الإطار من جانب الإطار لحساب التردد الهدبية الضرب. وهذا يسمح تصنيف واضح للخلايا البطانة العصبية إلى ثلاث فئات أو أنواع على أساس تردد الهدبية الضرب وزاوية. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يسمح استخدام عالية السرعة تحليل التصوير مضان لتحديد خصائص فريدة من نوعها داخل الخلايا خصائص التذبذب الكالسيوم من خلايا البطانة العصبية فضلا عن تأثير كلاء الدوائية على التذبذبات الكالسيوم وتردد الهدبية الضرب. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو مناسبة للتصوير المناعي للهيكل الهدبية والهدبية البروتين توطين الدراسات. هذا مهم بشكل خاص في تشخيص المرض والنمط الظاهري الدراسات. ويعزى القيد الرئيسي لهذه التقنية إلى انخفاض في حي حركة أهداب متحركة كما تبدأ أنسجة المخ في الموت.

Introduction

أهداب هي عضيات القائم على أنيبيب الحسية التي تمتد من سطح الخلية إلى البيئة خارج الخلية. حسب منظمة أنيبيب، ويمكن تصنيف أهداب إلى نوعين - "9 + 0" أو "9 + 2". وظيفيا، استنادا إلى الحركة، ويمكن ان تصنف هذه كما متحركة أو غير متحركة أهداب ^1. أهداب الأساسي هو مصطلح يستخدم عادة للدلالة على "9 + 0" أهداب غير متحركة. هذه تسع الأنابيب الدقيقة صدرة موازية (الرمز بواسطة '9') وزوج المركزي من الأنابيب الدقيقة غائب داخل غمد المركزي (الرمز بواسطة '0'). ومع ذلك، بعض "9 + 0" أهداب، مثل أهداب العقدي، التي تنظم الجنين تجانب هم متحركة ^2. من ناحية أخرى، تتميز أهداب متحركة، بالإضافة إلى تسعة الحلل أنيبيب بالتوازي مع ذلك، عن طريق الزوج المركزي إضافي من الحلل أنيبيب والمرتبطة البروتينات داينين ​​السيارات لتسهيل الحركة. بالإضافة إلى ذلك، بعض "9+2 "أهداب مثل أهداب الشم غير قابلة للمتحرك ^3. وتتميز خلايا البطانة العصبية تبطن البطينات الدماغ والقناة المركزية للحبل الشوكي عن طريق أهداب متحركة التي تدفع السائل النخاعي (CSF) جنبا إلى جنب البطينين الدماغ ^4.

الهدف العام من هذه الطريقة هو تسهيل دراسة ديناميات أهداب والتشوهات الهيكلية متحركة. صحة الدماغ والتنمية تعتمد بشكل كبير على التداول بكفاءة CSF داخل البطينات الدماغية. على سبيل المثال، وتدفق CSF طبيعي وتوازن السوائل يتطلب الضرب الطبيعي والوظيفي أهداب بطانية عصبية ^5،6، والتي بدورها تلعب أدوارا حاسمة في تنظيم حركة الاتجاه الخلايا العصبية ووقف الهجرة الخلية ^7. على هذا النحو، غير طبيعي وظيفة الأهداب البطانة العصبية أو بنية يمكن أن يؤدي إلى تدفق CSF الشاذ، الذي يرتبط مع استسقاء الدماغ، وهي حالة طبية التي يوجد فيها تراكم غير طبيعي للCSF في بطينات بالمطر. هذا قد يسبب بالتالي زيادة الضغط داخل الجمجمة والتوسيع التدريجي من الرأس، والتشنج، رؤية النفق، والإعاقة العقلية ^8.

مزايا هذه التقنية على الطرق القائمة هو أنه سمح للمرة الأولى أن يقدم ثلاثة أنواع الخلايا البطانة العصبية متميزة: I، II، III و، على أساس فريد من نوعه تردد الهدبية الضرب والضرب زاوية. يتم ترجمة هذه خلايا البطانة العصبية في مناطق معينة في الدماغ البطينين. وعلاوة على ذلك، فإن آثار العمر وكلاء الدوائية مثل الكحول وcilostazol على تغيير الأنماط الخلوية البطانة العصبية أو تعريب بهم يمكن البرهنة، الذي لم يكن ممكنا من قبل هذا التصنيف من خلايا البطانة العصبية. Cilostazol هو المانع من الفوسفو-3، وهو الانزيم الذي يتأيض المخيم لAMP وينظم أيضا الكالسيوم داخل الخلايا ^9. باستخدام عالية السرعة تحليل التصوير مضان يسمح التصوير وقياس للداخل خلوية فريدة من نوعهاخصائص التذبذب الكالسيوم من الخلايا البطانة العصبية. على سبيل المثال، على حد سواء الكحول وcilostazol تغيير كبير في بطانية عصبية تردد الهدبية الضرب وكذلك الخلايا خصائص التذبذبات الكالسيوم، والذي بدوره يمكن أن يؤدي إلى تغيير في النخاعي استبدال حجم السوائل عن طريق أهداب بطانية عصبية ^10. باختصار، كانت هذه التقنية الرئيسية لتوفير أول دليل على ثلاثة أنواع متميزة من خلايا البطانة العصبية مع مختلف خصائص التذبذب الكالسيوم.

في المقطع التالي، وتقدم خطوة بخطوة محة مفصلة عن الإجراء، مع إيلاء اهتمام وثيق لإعداد الأنسجة والتعامل معها.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات للاستخدام الحيواني من لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة توليدو وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في المعاهد الوطنية للصحة ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. الدماغ استخراج، باجتزاء والأنسجة التحضير

1. تضحية من نوع السلالة البرية الماوس C57BL / 6 قبل القتل الرحيم بعمق مع CO ₂ اختناق لمدة 5 دقائق. أؤكد وفاة خلع عنق الرحم.
2. تنظيف رأس الفأر مع الايثانول 70٪.
3. أداء قطع القحف باستخدام مقص العقيمة وملقط عن طريق سحب لأول مرة خارج الجلد، بدءا من قمة الرأس إلى فضح الجمجمة.
4. ثم، عندما يتعرض الجمجمة، وإزالة الجمجمة عن طريق تقشير قطعة تلو قطعة العظم، بدءا من الجانب الخلفي والتحرك نحو الجانب الأمامي. الحرص على عدم تدمير البطينات الدماغية.
5. جمع الدماغ كله.
6. وضع الدماغ في 100 مم طبق بتري تحتوي على DMEM / ارتفاع الجلوكوز تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ محلول البنسلين / الستربتومايسين تحتوي على 10000 وحدة / مل من البنسلين و 10،000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين وقبل حرارة إلى 37 ° C.
7. شريحة الدماغ على المستوى السهمي متوسط ​​باليد بشفرة حادة، والحصول على أول 100-200 ملم قسم من كل شوط باستخدام vibratome.
8. شطف أنسجة المخ مع حرارة ما قبل 37 ° C الفوسفات مخزنة المالحة (1X PBS) حل.
9. المكان على الفور قسم الدماغ في DMEM / الإعلام السامية الجلوكوز مسبقا تحسنت إلى 37 درجة مئوية.

2. لايف التصوير تكوين وإعداد

1. وضع المقاطع أنسجة المخ في أطباق ثقافة أسفل الزجاج 30 ملم تحتوي على 1 مل من DMEM / وسائل الإعلام عالية الجلوكوز، ضبط بيئة غرفة مغلقة المجهر في 37 ° C، و 95٪ / 5٪ O ₂ / CO ₂ المحتوى (الشكل 1 ).
2. باستخدام 60X موضوعية عدسة الغمر النفط، وجمع خلايا البطانة العصبية / صور أهداب عن طريق وضع أول هبوط النفط في عدسة الهدف 60X، والتركيز على الخلايا مع مدينة دبي للإنترنت العادية التي تنتقل عن طريق الضوء.
3. ثم اتبع اتجاه حركة فقاعة DMEM كدليل لمكان وجود أهداب بطانية عصبية متحركة عن الضرب الهدبية خلق نوع من الحركة فقاعة في المنطقة. اختيار المنطقة التي تحتوي على الخلايا السليمة مع أهداب متحركة في البطين الجانبي للمخ باستخدام فلتر DIC. حالما يتم العثور على أهداب بطانية عصبية، وضبط ضوء والتركيز على الحصول على صورة مرضية.
4. تعيين المعلمات التصوير الحية وفقا لهدف معين باستخدام برامج التصوير Metamorph. في التظاهرة الحالية، والحصول على عشرين أربع صور بت مع binning مجموعة الكاميرا إلى 1 × 1 جنبا إلى جنب مع 60X موضوعي و5-10 مللي ثانية زمن التعرض.
5. جمع الصور DIC عن طريق فتح فتحة المجهر إلى المستوى الأمثل من أجل أن يكون الحد الأدنى لإكسبالوقت osure. مراقبة الصور الحية تيار إلى الكاميرا لتوفير الحصول على الصور سريع وفوري دون تأخير. حساب سرعة أهداب الضرب استنادا إلى متطلبات العصر التعرض الحد الأدنى للحصول على ما يكفي من النقيض من الصورة.

3. التصور البيانات وتحليل

1. حساب عدد من الضرب أهداب عن طريق حساب عدد من الضرب في 1 دقيقة. القيام بذلك عن طريق خفض سرعة الفيديو وحساب عدد دقات باستخدام عداد الخلية أو أداة مماثلة.
2. لحساب تواتر الضرب ومضاعفة زمن التعرض الذي يتم تسجيل الفيديو من قبل عدد من الأطر أو الوقت الفاصل بين الصور المكتسبة للحصول على عدد من ثانية. (مثال: زمن التعرض 5 ميللي ثانية 200 إطارات = 1000 ميللي ثانية أو 1 ثانية).
3. احسب عدد الضرب في ثانية واحدة للحصول على وتيرة والتي يتم التعبير عن عدد من الضرب في واحدة ثانية. القيام بذلك عن طريق قسمة عدد من الضرب أهداب أكثر من مرة بين ثانية واحدةفال (مثال: أهداب يدق 50 مرة في شريط فيديو 200 إطارات سجلت في وقت تعرض 5 ميللي ثانية أي 5 ميللي ثانية × 200 إطارات = 1 ثانية؛ تقسيم الآن 50 نبض ب 1 ثانية = 50 هرتز).
4. حساب الزاوية الهدبية الضرب من خلال تقييم المسار الذي اتخذه أهداب بطانية عصبية خلال كل من السكتات الدماغية القوة والانتعاش. تنفيذ هذا وفقا لطريقة وصفها سابقا، مع بعض التعديلات الطفيفة ^11. لوحظ حركة دقيقة من أهداب الفردي خلال دورة ضربات كاملة.
5. على ورقة خلات وضعت على الشاشة، ورسم خط أفقي على طول حافة البطانة العصبية وخط عمودي من خلال موقف خط الوسط من أهداب في بداية شوط القدرة.
6. رسم موقف دقيق للإطار هدب من جانب الإطار وهي تتحرك إلى الأمام خلال شوط القدرة. بطريقة مماثلة، رسم حركة أهداب أثناء السكتة الدماغية الانتعاش.
7. حساب الزاوية الهدبية الضرب من الانحراف إلى أقصى حد من هدب من خط الوسط خلال رانه السكتة الدماغية السلطة وكذلك السكتة الدماغية الانتعاش.

4. الكالسيوم تسجيل الإشارات

1. تشريح المخ بعد، وشطف لفترة وجيزة شريحة الدماغ مع 1X PBS أو PBS Dulbecco و(7.0 درجة الحموضة). إعداد جديدة فلوو-2 لتجنب مضان التبريد والحصول على نسبة جيدة إشارة إلى الضجيج.
2. إعداد 1 ملم حل سهم فلوو-2 الحل في dimethylsulfoxide (DMSO)، ومزيج دوامة الحل لمدة 5 دقائق على الأقل لضمان فلوو-2 تم ​​حل متجانس في DMSO.
3. تمييع الحل الأسهم فلوو-2 في 500 مل من DMEM / ارتفاع الجلوكوز تستكمل مع 2٪ B27 قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية إلى تركيز النهائي من 20 ملغ / مل.
   ملاحظة: B-27 هو الأمثل المصل خالية ملحق التي تحتوي على فيتامين A، كوكتيل المضادة للأكسدة والأنسولين المستخدمة لدعم استمرارية قصيرة أو طويلة الأجل للقرن آمون والخلايا العصبية CNS أخرى.
4. احتضان فورا شريحة الدماغ مع 20 ملغ / مل فلوو-2 لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C في لوحة من الزجاج السفلي.
5. لتحديد تركيز التحميل الأمثل للfluorophore الكالسيوم فلوو-2 وتجنب سمية خلية الصبغة الكالسيوم، وخلايا التحدي مع ATP، والتحقق من بقاء الخلية عن طريق تحديد مسار الوقت وحجم الذروة من إشارات الكالسيوم ردا على ATP.
6. تسجيل فيديو لالتذبذب الكالسيوم بمعدل القبض على 5 ميللي ثانية مدة لا تقل عن 1 ثانية (200 لقطة في الثانية)، مع الإثارة وانبعاث موجات من 488 نانومتر و 515 نانومتر، على التوالي (فيلم 2).
7. لتمييز إشارة الكالسيوم فلوو-2 من تألق ذاتي أو حركة القطع الأثرية، تأكد من أن شدة المنبعثة عند 515 نانومتر ويتم رصد كل على حدة.
   ملاحظة: فلوو-2 ليست fluoremetric الكالسيوم مناسبة لقياس الكالسيوم داخل الخلايا. ومع ذلك، فإنه هو صبغة دينامية الكالسيوم ممتازة للكشف عن تغيرات سريعة الكالسيوم، مثل التذبذبات الكالسيوم. لتقدير الكالسيوم أكثر دقة، يوصى FURA-2. ومع ذلك، فإن التغييرات ديناميكية للFURA 2 محدودة بسبب ratiometric لهاطبيعة الصبغة.
8. اتبع الصيغ المقدمة من قبل الشركة المصنعة لحساب القيم الكالسيوم داخل الخلايا الحرة بالضبط. مثال [كا ^2+] = K _د × (R - R _دقيقة) / (R _ماكس - R). حيث K _d هو ثابت التفكك للصباغة من الكالسيوم المفرج عنهم، R هو مضان محسوب في 488، وR _دقيقة وR _ماكس هي نسب مضان في الحد الأدنى والحد الأقصى للتركيز أيون ^12.

5. المناعي المجهري

1. إصلاح أقسام الدماغ مع الفوسفات مخزنة محلول ملحي يحتوي على 4٪ لامتصاص العرق (PFA) و 2٪ سكروز لمدة 10 دقيقة. بدلا من ذلك، وتحديد الدماغ كله مع 4٪ PFA ثم قسم إلى 50 ملم المقاطع باستخدام ناظم البرد.
2. غسل الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في كل مرة.
3. احتضان شريحة الدماغ مع solutiعلى 0.1٪ تريتون-X في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق، ثم شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في كل مرة.
4. احتضان شريحة المخ مع الأجسام المضادة الماوس الابتدائي، antiacetylated على تويولين، وتستخدم في التخفيف 1: 5000 في 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني 1X لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
5. غسل الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في كل مرة.
6. احتضان شريحة الدماغ في الضد الثانوية، فلوريسئين المضادة للماوس مفتش في التخفيف من 1: 500 في 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني 1X الحل لمدة 1 ساعة على RT.
7. قبل الملاحظة تحت المجهر الفلورسنت، مباين القسم مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لمدة 5 دقائق إلى وصمة عار على النواة (أو DNA) ^13. لتقليل photobleaching من والصورة الأقسام فورا مع الحد الأدنى من الوقت احتمال التعرض.

النتائج

قياس وظيفة الأهداب البطانة العصبية في دماغ الفأر الحي

يتم استخدام الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول لمراقبة وظيفة الأهداب البطانة العصبية وهيكل في أنسجة جديدة تشريح من مخ الفأر وكذلك لرصد ودراسة أهداب تردد الضرب. وصفت الخطوات ...

Discussion

هو موضح هنا هو بروتوكول لإعداد أنسجة المخ الماوس لكل من يعيش التصوير والفحص المجهري مضان التي توفر الملاحظة السريعة والحساسة وثيقة من أهداب بطانية عصبية داخل البطينات الدماغية. ولا تقتصر هذه التقنية إلى البطين الجانبي فقط؛ يمكن استخدامه لمراقبة أهداب في البطينات ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/HIGH GLUCOSE	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-SP
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-2395
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
Fluo-2	TEF Labs	#0200
DMSO
B27	Gibco	17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T7451	clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody	Vector Labs	FI-2000
Cell Culture plate	VWR Vista Vision	30-2041
Cover Slip (18 x 18)	VWR Vista Vision	16004.326
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200S
Cryostat	Leica Biosystems	Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	Nikon TE2000	60X oil
Microscope cover glass 24 x 60 mm2	VWR Vista Vision	16004-312
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
DAPI filter cube	Chroma Technology