Live-Imaging des Ependymale Cilia in der Seitenventrikel des Maus-Gehirn-

Zusammenfassung

Mit hochauflösenden Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie wird eine ex vivo Beobachtung des schlagenden motiler ependymaler Zilien innerhalb der Maus Hirnkammern entfernt von Live-Bildgebung nachgewiesen. Die Technik ermöglicht eine Aufnahme von der einzigartigen Zilienschlag Frequenz und Schlagwinkel sowie deren intrazellulären Calcium-Oszillation Stimulationseigenschaften.

Zusammenfassung

Multiciliated Ependymzellen säumen die Ventrikel im erwachsenen Gehirn. Abnormale Funktion oder Struktur ependymaler Zilien ist mit verschiedenen neurologischen Defiziten assoziiert. Die aktuelle ex vivo Echtzeit-Bildgebung von beweglichen ependymaler Zilien Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Dynamik ciliary folgenden mehreren Schritten. Diese Schritte umfassen: Mäuse Euthanasie mit Kohlendioxid nach Protokollen der University of Toledo Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC); Kraniektomie gefolgt von Gehirnentfernung und sagittal Gehirn Dissektion mit einem Vibratom oder scharfe Klinge sehr dünne Schnitte durch die Hirn Seitenventrikel, wo die ependymaler Zilien visualisiert werden können erhalten. Inkubation der Scheiben des Gehirns in einem angepassten Glasbodenplatte, die Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / Hoch Glucose bei 37 ° C in Gegenwart von 95% / 5% O ₂ / CO _{2 -Gemisch} ist wichtig, um das Gewebe am Leben zu halten währenddas Experiment. Ein Video der Zilien schlagen wird dann mit Hilfe eines hochauflösenden Differentialinterferenzkontrastmikroskop erfasst. Das Video wird dann Bild für Bild analysiert, um die Zilienschlag Frequenz zu berechnen. Auf diese Weise können unterschiedliche Einstufung der Ependymzellen in drei Kategorien oder Arten auf der Grundlage ihrer Zilienschlag Frequenz und Winkel. Weiterhin ermöglicht diese Technik die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzbildanalyse, um die einzigartigen intrazellulären Calciumschwingungseigenschaften Ependymalzellen sowie die Wirkung von pharmakologischen Mitteln auf den Calcium Schwingungen und Zilienschlag Frequenz charakterisieren. Außerdem eignet sich dieses Verfahren für Immunfluoreszenz-Bildgebung zum ziliaren Struktur und ciliary Proteinlokalisationsstudien. Dies ist besonders wichtig bei der Krankheitsdiagnose und Phänotyp Studien. Die Hauptbeschränkung der Technik wird auf die Abnahme in lebenden motile Zilien Bewegung zurückzuführen, wie das Hirngewebe und sterben ab.

Einleitung

Cilien sensorischen Mikrotubulus-basierten Organellen, die von der Zelloberfläche an die extrazelluläre Umgebung zu verlängern. "9 + 0" oder "9 + 2" - je nach ihrer Mikrotubuliorganisationszentrum kann Zilien in zwei Typen eingeteilt werden. Funktionell bezogen auf ihre Beweglichkeit, so können diese als bewegliche oder unbewegliche Zilien ¹ eingestuft werden. Primäre Zilien ist ein Begriff allgemein verwendet, bezeichnen "9 + 0" unbewegliche Zilien. Diese haben neun parallelen Dublett Mikrotubuli (hergestellt von "9" bezeichnet) und einer zentralen Paar von Mikrotubuli abwesend innerhalb der zentralen Hülse (durch "0" bezeichnet). , Einige "9 + 0" Zilien, wie Knoten Zilien, die Lateralität Embryo regulieren sind jedoch beweglich ^2. Auf der anderen Seite, motile Cilien gekennzeichnet, daß zusätzlich zu den neun parallelen Mikrotubuli Dubletts, durch einen zusätzlichen zentralen Paar Mikrotubuli Dubletts und Dynein Motorproteinen assoziiert Motilität erleichtern. Darüber hinaus sind einige "9+2 "Cilien wie olfaktorische Zilien sind unbewegliche ^3. Ependymzellen entlang der Hirnkammern und den Zentralkanal des Rückenmarks durch bewegliche Zilien, die den Liquor (CSF) entlang der Hirnkammern ⁴ zu treiben ist.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Erleichterung der Untersuchung der bewegliche Zilien Dynamik und strukturelle Anomalien. Gesundheit und Entwicklung des Gehirns stark von effizienten Verkehr von CSF in die Hirnkammern. Zum Beispiel normaler CSF Strömung und Flüssigkeitshaushalt erfordern normale Schläge und funktionellen ependymal Zilien ^5,6, was wiederum eine entscheidende Rolle spielen bei der Regulierung der Bewegungsrichtung des neuronalen Zellen und Stammzellmigration ^7. Als solche abnormale ependymal Zilien Funktion oder Struktur können zu abnorm CSF Strömung, die mit Hydrocephalus ist Blei, ein medizinischer Zustand, in dem es eine abnormale Ansammlung von CSF in den Ventrikeln des bregen. Dies kann folglich erhöhtem Hirndruck und progressive Erweiterung der Kopf, Krämpfe, Tunnelblick und geistige Behinderung ⁸ verursachen.

Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Verfahren ist, dass es zum ersten Mal, um drei verschiedene ependymalen Zelltypen zu melden gestattet: I, II und III, auf der Grundlage ihrer einzigartigen Zilienschlag Frequenz und Schlagwinkel. Diese Ependymzellen innerhalb bestimmter Regionen in die Hirnkammern lokalisiert. Weiterhin können die Wirkungen des Alters und pharmakologischen Mitteln wie Alkohol und Cilostazol auf die Änderung der ependymalen Zelltypen oder ihrer Lokalisierungen nachgewiesen werden, was nicht vor dieser Klassifizierung von Ependymalzellen war möglich. Cilostazol ist ein Inhibitor der Phosphodiesterase-3, ein Enzym, das cAMP zu AMP metabolisiert wird, und regelt intrazellulärem Calcium ^9. Mit High-Speed-Fluoreszenz-Imaging-Analyse ermöglicht die Abbildung und Quantifizierung der einzigartigen intrazellulärenCalcium Schwingungseigenschaften der Ependymzellen. Zum Beispiel werden sowohl Alkohol und Cilostazol deutlich die ependymaler Zilienschlag Frequenz sowie die intrazellulären Calcium-Oszillationen Eigenschaften, die wiederum könnte zu einer Veränderung in der Zerebrospinalflüssigkeit Volumenersatz von ependymaler Zilien ¹⁰ führen verändert. Zusammengefasst war diese Technik Schlüssel, um den ersten Beweis von drei verschiedenen Arten von ependymalen Zellen mit unterschiedlichen Calciumschwingungseigenschaften bereitzustellen.

Im folgenden Abschnitt wird eine ausführliche Schritt-für-Schritt-Überblick über das Verfahren zur Verfügung gestellt, aufmerksam auf Gewebe Herstellung und Handhabung.

Protokoll

Die Verfahren für Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der University of Toledo in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an den National Institutes of Health und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung zugelassen von Labortieren.

1. Gehirn Extraction, Schnitte und Gewebepräparation

1. Opfern Wildtyp-Maus-Stamm C57BL / 6 durch tief euthanizing mit CO ₂ Ersticken für 5 min. Versichern Tod durch zervikale Dislokation.
2. Reinigen Sie die Mauskopf mit 70% Ethanol.
3. Führen Kraniektomie mit sterilen Schere und Pinzette, indem zuerst die Haut abziehen, beginnend mit der Spitze des Kopfes, um den Schädel freizulegen.
4. Dann, wenn der Schädel freiliegt, Entfernen des Schädels durch Abziehen der Knochen Stück für Stück ausgehend von der hinteren Seite, und sich in Richtung der vorderen Seite. Seien Sie vorsichtig, nicht die Hirnkammern zu zerstören.
5. Sammeln Sie die ganze Gehirn.
6. Platzieren das Gehirn in einer 100 mm Petrischale mit DMEM / Hoch Glucose mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung, die 10.000 Einheiten / ml Penicillin und 10.000 & mgr; g / ml Streptomycin und vorgewärmtem auf 37 ° C.
7. Schneiden Sie das Gehirn auf der medianen Sagittalebene von Hand mit einer scharfen Klinge, und erhalten die ersten 100 bis 200 mm Abschnitt von jeder Hälfte mit einem Vibratom.
8. Spülen Sie das Hirngewebe mit vorgewärmter 37ºC phosphatgepufferter Salzlösung (1 × PBS) -Lösung.
9. Ab sofort stellen das Gehirn Abschnitt in DMEM / Hoch Glucose Medien auf 37 ° C vorgewärmt.

2. Live-Imaging Konfiguration und Setup

1. Zeigen die Gehirngewebeschnitte in 30 mm Glasbodenkulturschalen, die 1 ml DMEM / Hochglucosemedien. Passen des Mikroskops geschlossene Kammer Umgebung bis 37 ° C, 95% / 5% O ₂ / CO _{2 -Gehalt} (Abbildung 1 ).
2. Unter Verwendung eines 60X Ziel Ölimmersion, sammeln die Ependymzellen / Cilien Bilder, indem zunächst ein Öltropfen auf dem 60X Objektiv und Fokussierung auf die Zellen, die mit regelmäßigen Durchlicht DIC.
3. Dann folgen Sie die Richtung des DMEM Blasenbewegung als Leitfaden für die Position des beweglichen ependymaler Zilien als ciliary Schläge schaffen eine Art von Blasenbewegung in der Gegend. Wählen Sie einen Bereich enthält, gesunde Zellen mit beweglichen Zilien in lateralen Ventrikel des Gehirns mit Hilfe der DIC-Filter. Sobald die ependymaler Zilien gefunden werden, stellen Sie die Licht und konzentrieren, um ein zufriedenstellendes Bild zu erhalten.
4. Stellen Sie die Live-Bildaufnahmeparameter nach einem bestimmten Zweck mit Metamorph-Imaging-Software. In der vorliegenden Demonstration, zu erwerben vierundzwanzig-Bit-Bilder mit der Kamera Binning auf 1 x 1 in Verbindung mit 60X Ziel und 5-10 ms Belichtungszeit.
5. Sammeln Sie die DIC Bilder durch Öffnen des Mikroskopöffnung auf ein optimales Niveau, um eine Mindest exp habenosure Zeit. Beachten Sie Live-Bilder-Stream der Kamera, um schnelle und sofortige Bildaufnahme unverzüglich bereitzustellen. Berechnen der Geschwindigkeit der Zilien Schlagen basierend auf der Anforderung der minimalen Belichtungszeiten zur ausreichenden Bildkontrast zu erhalten.

3. Datenvisualisierung und -analyse

1. Berechnung der Anzahl der Zilien Schläge durch Zählen der Anzahl von Schlägen in 1 min. Dies geschieht durch Verringerung der Geschwindigkeit der Video- und Zählen der Anzahl von Schlägen mit einem Zellzähler oder ein ähnliches Werkzeug.
2. Um die Frequenz der Schläge zu berechnen, multiplizieren Sie die Belichtungszeit, bei der das Video wird durch die Anzahl der Frames oder Zeitraffer-Bilder erworben, um die Anzahl der Sekunden bekommen aufgezeichnet. (Beispiel: Belichtungszeit 5 ms 200 Frames = 1.000 ms oder 1 s).
3. Berechnung der Anzahl der Schläge in einer Sekunde, um die Frequenz, die als Anzahl der schlag pro sec ausgedrückt wird erhalten. Tun Sie dies, indem die Anzahl der Zilien Schläge über einen Ein-Sekunden-Zeit interval (Beispiel: Zilien schlägt 50 Mal in einem 200 Bilder Video bei Belichtungszeit von 5 ms, dh 5 ms x 200 Frames = 1 Sekunde aufgenommen, jetzt teilen 50 Schläge um 1 Sek = 50 Hz).
4. Die Zilienschlag Winkel zu berechnen durch die Auswertung der Weg durch die ependymaler Zilien genommen während sowohl die Leistung und Erholung Schlaganfälle. Ausführen dieser nach einem vorher beschriebenen Verfahren mit geringen Modifikationen ^11. Die genaue Bewegung einzelner Zilien wird während der gesamten Schlagzyklus beobachtet.
5. Auf ein Acetat Blatt über dem Monitor platziert, ziehen Sie eine horizontale Linie entlang der ependymaler Kante und einer vertikalen Linie durch die Mittellinie Position der Zilien zu Beginn des Arbeitstaktes.
6. Zeichnen Sie die genaue Position des cilium Rahmen für Rahmen, wie sie während des Arbeitshubs nach vorne bewegt. In ähnlicher Weise zeichnen die Bewegung der Flimmerhärchen in der Erholungs Schlaganfall.
7. Berechnen Sie die Zilienschlag Winkel von der maximalen Abweichung der cilium von der Mittellinie in ter Arbeitstakt als auch die Erholung Schlaganfall.

4. Calcium Signalaufzeichnung

1. Nach dem Schneiden des Gehirns, kurz abspülen Hirnschnitt mit 1x PBS oder Dulbeccos PBS (pH 7,0). Frisch Fluo-2 Bereiten Sie Fluoreszenzlöschung zu vermeiden und gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
2. Vorbereitung 1 mM Stammlösung von Fluo-2-Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO), zu vermischen und verwirbeln die Lösung für mindestens 5 min, damit Fluo-2 homogen in DMSO gelöst.
3. Verdünne das Fluo-2-Stammlösung in 500 ml DMEM / Hoch Glucose mit 2% B27 ergänzt auf 37 ° C vorgewärmt, um eine Endkonzentration von 20 mg / ml.
   HINWEIS: B-27 ist ein optimierter Serum-freien Ergänzungsmittel mit Vitamin A, Antioxidantien Cocktail und Insulin verwendet werden, um kurz- oder langfristige Lebensfähigkeit des Hippocampus und anderen ZNS-Neuronen zu unterstützen.
4. Unmittelbar inkubieren Sie die Hirnschnitt mit 20 mg / ml Fluo-2 für 30 min bei 37 ° C in einem Glasbodenplatte.
5. Zur Bestimmung der optimalen Beladungskonzentration von Calcium Fluorophor Fluo-2 und Calcium Farbstoff Zelltoxizität, challenge Zellen mit ATP zu vermeiden, und überprüfen die Lebensfähigkeit der Zellen durch Bestimmung der Zeitverlauf und die Spitzengröße des Calciumsignale in Antwort auf ATP.
6. Aufzeichnung der Video für Calcium Oszillation bei einer Erfassungsrate von 5 ms für ein Minimum von 1 sec (200 Einzelbilder pro Sekunde) mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 nm und 515 nm (Film 2).
7. Um die Fluo-2 Calcium-Signal von Autofluoreszenz oder Bewegungsartefakten zu unterscheiden, sicherzustellen, dass die bei 515 nm emittiert Intensitäten wird separat überwacht.
   HINWEIS: Fluo-2 nicht die Calcium fluoremetric geeignet intrazellulärem Calcium zu quantifizieren. Jedoch ist es eine ausgezeichnete dynamische Calcium-Farbstoff zum schnellen Calcium-Veränderungen, wie Calcium Schwingungen erfassen. Für eine genauere Quantifizierung Calcium, Fura-2 ist zu empfehlen. Jedoch sind die dynamischen Änderungen der Fura-2 durch seine ratiometrisch begrenztBeschaffenheit des Farbstoffs.
8. Folgen Sie den Formeln des Herstellers um die genauen freien intrazellulären Calcium-Werte zu berechnen. Beispiel [Ca ^{2+] i} = _Kd x (R - R _min) / (R _max - R). Wobei K _d die Dissoziationskonstante des Farbstoffs aus dem freigesetzten Calciums, R ist die gemessene Fluoreszenz bei 488 und R _min und R _max sind die Fluoreszenzverhältnisse bei minimaler und maximaler Ionenkonzentration ^12.

5. Immunfluoreszenzmikroskopie

1. Fixieren die Gehirnschnitte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und 2% Saccharose für 10 min. Alternativ zu beheben das gesamte Gehirn mit 4% PFA und dann in Abschnitt 50 mm Abschnitte mit einem Kryostaten.
2. Dreimal Waschen des Gewebes mit 1x PBS für jeweils 5 min.
3. Inkubieren Sie die Hirnschnitt mit einem solutiauf 0,1% Triton-X in 1 × PBS für 5 min, dann dreimal mit 1x PBS spülen für jeweils 5 min.
4. Inkubieren Hirnschnitt mit primären Maus-Antikörper, antiacetylated a-Tubulin bei einer Verdünnung von 1: 5000 in 10% FBS in 1 × PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 4 ° C.
5. Dreimal Waschen des Gewebes mit 1x PBS für jeweils 5 min.
6. Inkubieren Hirnschnitt in sekundären Antikörper, Fluorescein-Antimaus-IgG in einer Verdünnung von 1: 500 in 10% FBS in 1x PBS-Lösung für 1 h bei RT.
7. Vor Betrachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop, Gegenfärbung mit dem Abschnitt 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 min, um den Kern (oder DNA) ¹³ zu färben. Um Photobleaching, Bild die Abschnitte unmittelbar mit minimale Belichtungszeit möglich zu minimieren.

Ergebnisse

Mess ependymaler Zilien Funktion in Live-Maushirn

Die in diesem Protokoll beschriebene Verfahren wird verwendet, um ependymal Zilien Funktion und Struktur in der frischen Gewebe aus dem Gehirn der Maus als auch für die Überwachung und studieren Zilien Schlagfrequenz seziert überwachen. Die Schritte befolgt, um eine vollständige Experiment erreichen werden in einer schematischen Ablaufplan (Figur 1) dargestellt. Es wird dringend empfohlen, dass das Experiment innerhalb ei...

Diskussion

Beschrieben wird ein Protokoll für die Herstellung von Maus-Gehirngewebe sowohl Live-Bildgebung und die Fluoreszenzmikroskopie, die eine schnelle und empfindliche genauer Betrachtung der ependymalen Zilien in den Hirnkammern liefert. Diese Technik ist nicht nur auf den lateralen Ventrikel beschränkt; es könnte verwendet, um die Zilien in anderen Hirnkammern beobachten. Diese Bildgebungstechnik bietet einen Live-Stream, die die Bewegung des CSF von Zilienschlag in einem ex vivo-Einstellung ähnelt. Darüber h...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/HIGH GLUCOSE	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-SP
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-2395
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
Fluo-2	TEF Labs	#0200
DMSO
B27	Gibco	17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T7451	clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody	Vector Labs	FI-2000
Cell Culture plate	VWR Vista Vision	30-2041
Cover Slip (18 x 18)	VWR Vista Vision	16004.326
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200S
Cryostat	Leica Biosystems	Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	Nikon TE2000	60X oil
Microscope cover glass 24 x 60 mm2	VWR Vista Vision	16004-312
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
DAPI filter cube	Chroma Technology