Imagerie en direct de la épendymaire Cilia dans les ventricules latéraux du cerveau de souris

Résumé

Utilisation de haute résolution contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie, un ex vivo observation du battement des cils épendymaire mobiles situés dans les ventricules du cerveau de souris est démontrée par live-imagerie. La technique permet un enregistrement de l'unique fréquence ciliaire battant et l'angle battant ainsi que leurs propriétés calcium intracellulaire oscillation de stimulation.

Résumé

Cellules épendymaires multiciliées bordent les ventricules dans le cerveau adulte. La fonction anormale ou de la structure des cils épendymaire est associé à divers déficits neurologiques. Le courant ex vivo l'imagerie en direct de la technique de cils épendymaire mobiles permet une étude détaillée de la dynamique ciliaires suit plusieurs étapes. Ces mesures comprennent: l'euthanasie des souris avec du dioxyde de carbone selon les protocoles de l'Université du institutionnels de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) de Tolède; craniectomy suivie de l'élimination du cerveau et sagittale dissection du cerveau avec un vibratome ou lame tranchante pour obtenir sections très minces à travers les ventricules latéraux du cerveau, où les cils épendymaire peuvent être visualisées. L'incubation des tranches du cerveau dans une plaque à fond de verre personnalisé contenant milieu de Eagle modifié (DMEM) / Haut-glucose de Dulbecco à 37 ° C en présence de 95% / 5% O / CO ₂ mélange ₂ est essentiel de garder le tissu vivant pendantl'expérience. Une vidéo du battement de cils est alors enregistrée en utilisant une haute résolution contraste d'interférence différentiel microscope. La vidéo est ensuite analysé image par image pour calculer la fréquence ciliaire battant. Cela permet la classification distincte des cellules épendymaires en trois catégories ou types en fonction de leur fréquence ciliaire battant et l'angle. En outre, cette technique permet l'utilisation de l'analyse d'imagerie de fluorescence à grande vitesse pour caractériser les propriétés uniques intracellulaires d'oscillation de calcium de cellules épendymaires, ainsi que l'effet des agents pharmacologiques sur les oscillations de calcium et la fréquence ciliaire battant. De plus, cette technique est adaptée pour l'imagerie par immunofluorescence pour des études de structure de protéine ciliaire ciliaire et localisation. Ceci est particulièrement important dans les études de diagnostic et de phénotype maladie. La principale limitation de la technique est attribuée à la diminution de la circulation en direct de cils mobiles comme les tissus du cerveau commence à mourir.

Introduction

Les cils sont des organites à base de microtubules sensoriels qui se prolongent à partir de la surface cellulaire dans l'environnement extracellulaire. Selon leur organisation des microtubules, les cils peuvent être classés en deux types - "9 + 0» ou «9 + 2". Sur le plan fonctionnel, en fonction de leur mobilité, elles peuvent être classées comme mobiles ou non mobiles cils ^1. Cils primaires est un terme couramment utilisé pour désigner «9 + 0" cils non mobiles. Celles-ci ont neuf microtubules doublets parallèles (désignés par '9') et une paire centrale de microtubules est absent à l'intérieur de la gaine centrale (notée "0"). Toutefois, certains «9 + 0" cils, comme cils nodale, qui règlent l'embryon latéralité sont mobiles ^2. D'autre part, les cils mobiles sont caractérisés, en plus des neuf doublets de microtubules parallèles, par une paire de doublets central supplémentaire des microtubules et associé à des protéines motrices de la dynéine pour faciliter la motilité. En outre, certains "9+2 "Cils tels que les cils olfactifs sont non mobiles ^3. Cellules épendymaires bordant les ventricules cérébraux et le canal central de la moelle épinière sont caractérisés par ce que les franges sont mobiles à propulser le liquide céphalo-rachidien (LCR) le long des ^quatre ventricules du cerveau.

L'objectif global de cette méthode est de faciliter l'étude de la dynamique des cils mobiles et des anomalies structurelles. La santé et le développement du cerveau dépendent fortement sur la circulation efficace des CSF dans les ventricules cérébraux. Par exemple, les flux de CSF normale et l'équilibre des fluides exigent battement normal et cils épendymaire fonctionnelle ^5,6, qui à son tour jouer un rôle critique dans la régulation du mouvement directionnel des cellules neuronales et la migration des cellules souches ^7. En tant que tel, la fonction des cils épendymaire anormale ou une structure peut conduire à l'écoulement de CSF anormale, qui est associé à une hydrocéphalie, une condition médicale dans laquelle il ya une accumulation anormale de CSF dans les ventricules du bpluie. Cela peut par conséquent entraîner une augmentation de la pression intracrânienne et l'élargissement progressif de la tête, convulsions, vision en tunnel, et la déficience mentale ^8.

Les avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'il a permis pour la première fois de signaler trois types de cellules épendymaires distinctes: I, II, et III, en fonction de leur fréquence ciliaire battant unique et angle de battre. Ces cellules épendymaires sont localisées à l'intérieur de certaines régions dans les ventricules du cerveau. En outre, les effets de l'âge et des agents pharmacologiques tels que l'alcool et cilostazol sur la modification des types de cellules épendymaires ou leurs localisations peuvent être démontrés, ce qui était impossible avant cette classification des cellules épendymaires. Le cilostazol est un inhibiteur de la phosphodiestérase-3, une enzyme qui métabolise l'AMPc en AMP et il régule également calcium intracellulaire ^9. En utilisant l'analyse de l'imagerie de fluorescence à haute vitesse permet l'imagerie et à la quantification de l'intracellulaire uniquespropriétés d'oscillation de calcium des cellules épendymaires. Par exemple, l'alcool et cilostazol modifiées de manière significative la fréquence ciliaire épendymaire battant ainsi que les oscillations de calcium intracellulaire propriétés qui, à son tour, pourrait conduire à un changement dans le volume de remplacement liquide céphalo-rachidien par cils épendymaire ^10. En résumé, cette technique a été la clé pour fournir la première preuve de trois types distincts de cellules épendymaires avec différentes propriétés d'oscillation de calcium.

Dans la section suivante, un aperçu détaillé étape par étape de la procédure est prévue, en accordant une attention particulière à la préparation des tissus et de la manutention.

Protocole

Les procédures pour l'utilisation des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Toledo, conformément aux directives du Comité soin et l'utilisation institutionnelle animal aux National Institutes of Health et le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Extraction du cerveau, le sectionnement et de tissus Préparation

1. Sacrifiez-souche de type sauvage de la souris C57BL / 6 par euthanasie profondément avec le CO ₂ asphyxie pendant 5 min. Assurer la mort par dislocation cervicale.
2. Nettoyez la tête de souris avec 70% d'éthanol.
3. Effectuer craniectomy l'aide de ciseaux et des pinces stériles d'abord en tirant la peau de, en commençant par le haut de la tête pour exposer le crâne.
4. Puis, quand le crâne est exposé, éliminer le crâne par pelage la pièce par pièce osseuse, à partir du côté postérieur et se déplaçant vers le côté antérieur. Soyez prudent de ne pas détruire les ventricules du cerveau.
5. Recueillir l'ensemble du cerveau.
6. Placer le cerveau dans une boîte de 100 mm de Pétri contenant du milieu DMEM / haut-glucose supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et une solution de pénicilline / streptomycine 1% contenant 10 000 unités / ml de pénicilline et 10 000 ug / ml de streptomycine et préchauffé à 37 ° C.
7. Trancher le cerveau sur le plan sagittal médian à la main avec une lame tranchante, et d'obtenir la première section de 100-200 mm de chaque moitié en utilisant un vibratome.
8. Rincer le tissu cérébral avec une solution saline tamponnée au phosphate C (1x PBS) préchauffé à 37 °.
9. Placer immédiatement la section du cerveau dans du DMEM / media Haute-Glucose préchauffé à 37 ° C.

2. Configuration d'imagerie en direct et configuration

1. Placez les coupes de tissus du cerveau dans des boîtes de culture à fond de verre de 30 mm contenant 1 ml de DMEM / médias haute-glucose. Réglez l'environnement de la chambre fermée de microscope à 37 ° C, 95% / 5% de O ₂ / CO ₂ contenu (Figure 1 ).
2. En utilisant un objectif 60X lentille à immersion d'huile, de recueillir les cellules épendymaires / images de cils en plaçant d'abord une goutte d'huile sur la 60X objectif et se concentrant sur les cellules avec régulière DIC lumière transmise.
3. Ensuite, suivez la direction du mouvement de la bulle DMEM comme un guide pour l'emplacement des cils épendymaire mobiles comme les coups ciliaires créent une sorte de mouvement de bulle dans la zone. Choisissez une zone contenant des cellules saines de cils mobiles dans le ventricule latéral du cerveau en utilisant le filtre DIC. Une fois les cils épendymaire sont trouvés, ajuster la lumière et de se concentrer pour obtenir une image satisfaisante.
4. Définissez les paramètres d'imagerie en direct selon un but précis en utilisant un logiciel d'imagerie Metamorph. Dans la présente démonstration, d'acquérir vingt-quatre bits images avec la caméra binning mis à 1 x 1 combiné avec 60X objective et 5-10 ms temps d'exposition.
5. Recueillir les images DIC en ouvrant l'ouverture de microscope à un niveau optimal afin d'avoir une exp minimumOsure temps. Respecter les flux des images en direct à la caméra pour permettre l'acquisition d'image rapide et immédiate sans délai. Calculer la vitesse de battement des cils sur la base de l'exigence des temps d'exposition minimum pour obtenir un contraste d'image suffisante.

3. Visualisation et analyse de données

1. Calculer le nombre de coups de cils en comptant le nombre de coups en 1 min. Pour ce faire, en diminuant la vitesse de la vidéo et de compter le nombre de battements en utilisant un compteur de cellules ou un outil similaire.
2. Pour calculer la fréquence des passages à tabac, multiplier le temps d'exposition au cours de laquelle la vidéo est enregistrée par le nombre de cadres ou d'images time-lapse acquis pour obtenir le nombre de sec. (Exemple: temps d'exposition 5 ms 200 images = 1,000 ms ou 1 sec).
3. Calculer le nombre de coups par seconde pour obtenir la fréquence qui est exprimée par le nombre de coups par un sec. Pour ce faire, en divisant le nombre de coups de cils plus d'une seconde entre tempsval (Exemple: cils bat 50 fois dans une vidéo de 200 images enregistrées au temps d'exposition de 5 ms soit 5 ms x 200 images = 1 sec; désormais diviser 50 battements par 1 sec = 50 Hz).
4. Calculer l'angle ciliaire battant en évaluant le chemin emprunté par les cils épendymaire pendant les deux coups de puissance et de récupération. Effectuez cette selon une méthode décrite précédemment, avec des modifications mineures ^11. La précision du mouvement des cils individu est observée au cours du cycle complet de battement.
5. Sur une feuille d'acétate placé sur le moniteur, tracez une ligne horizontale le long du bord épendymaire et une ligne verticale à travers la position médiane des cils au début de la course de puissance.
6. Tracer la position précise du cadre de cil par image comme il se déplace vers l'avant pendant la course de puissance. D'une manière similaire, tracer le mouvement des cils lors de la course de récupération.
7. Calculer l'angle ciliaire raclée de la déviation maximale du cil de la ligne médiane lors de til course de puissance ainsi que la course de récupération.

4. Calcium enregistrement d'un signal

1. Après trancher le cerveau, rincer rapidement la tranche de cerveau avec 1x PBS ou du PBS de Dulbecco (pH 7,0). Préparer une solution fraîche Fluo-2 pour éviter l'extinction de fluorescence et d'obtenir un bon rapport signal-sur-bruit.
2. Préparer mM solution 1 de Fluo-2 solution dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), mélanger et vortex la solution pendant au moins 5 minutes afin de garantir Fluo-2 est homogène dissous dans du DMSO.
3. Diluer la solution mère de Fluo-2 dans 500 ml de DMEM / haut-glucose supplémenté avec 2% de B27 préchauffée à 37 ° C jusqu'à une concentration finale de 20 mg / ml.
   NOTE: B-27 est un supplément gratuit de sérum optimisé contenant de la vitamine A, cocktail antioxydant et de l'insuline utilisé pour soutenir la viabilité à court ou à long terme de l'hippocampe et d'autres neurones du SNC.
4. Incuber immédiatement la tranche de cerveau avec 20 mg / ml Fluo-2 pendant 30 min à 37 ° C dans une plaque à fond de verre.
5. Pour déterminer la concentration de charge optimal de fluorophore de calcium Fluo-2 et pour éviter la toxicité de cellules de colorant de calcium, les cellules de provocation avec de l'ATP, et de vérifier la viabilité des cellules en déterminant le déroulement dans le temps et l'amplitude de crête de signaux de calcium en réponse à l'ATP.
6. Noter la vidéo pour l'oscillation de calcium à un taux de capture de 5 ms pour un minimum de 1 seconde (200 images par seconde), avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 488 nm et 515 nm, respectivement (film 2).
7. Pour distinguer le signal Fluo-2 de calcium autofluorescence ou mouvement artefacts, veiller à ce que les intensités émises à 515 nm sont surveillés séparément.
   REMARQUE: Fluo-2 ne soit pas la fluoremetric de calcium apte à quantifier calcium intracellulaire. Cependant, il est d'une excellente dynamique colorant de calcium pour détecter des changements rapides de calcium, tels que les oscillations de calcium. Pour la quantification de calcium plus précis, Fura-2 est recommandé. Cependant, les changements dynamiques de Fura-2 sont limitées par son ratiométriquenature du colorant.
8. Suivez les formules fournies par le fabricant pour calculer les valeurs de calcium intracellulaires libres exactes. Exemple [Ca ^2+] = K _d × (R - R _min) / (R _max - R). Où _Kd est la constante de dissociation du colorant libéré à partir du calcium, R est la fluorescence mesurée à 488, et R et R _{min max} sont les rapports de fluorescence à minimum et maximum de concentration ¹² ionique.

5. immunofluorescence Microscopie

1. Fixer les coupes de cerveau avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 4% de paraformaldehyde (PFA) et 2% de saccharose pendant 10 min. Alternativement, fixer l'ensemble du cerveau à l'article PFA, puis 4% en sections de 50 mm en utilisant un cryostat.
2. Laver le tissu trois fois avec PBS 1x pendant 5 minutes à chaque fois.
3. Incuber la tranche de cerveau avec une solutià 0,1% de Triton-X dans 1 x PBS pendant 5 minutes, puis rincer trois fois avec du 1 x PBS pendant 5 min à chaque fois.
4. Incuber la tranche de cerveau avec un anticorps primaire de souris, antiacetylated a-tubuline, utilisé à une dilution de 1: 5000 dans 10% de FBS dans du PBS 1x pendant une heure à température ambiante (TA) ou une nuit à 4 ° C.
5. Laver le tissu trois fois avec PBS 1x pendant 5 minutes à chaque fois.
6. Incuber la tranche de cerveau dans un anticorps secondaire anti-IgG de souris fluorescéine à une dilution de 1: 500 dans 10% de FBS dans du PBS 1x solution pendant 1 heure à température ambiante.
7. Avant d'observation sous un microscope à fluorescence, contre-coloration avec la section 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 minutes pour colorer le noyau (ou ADN) ^13. Pour minimiser photoblanchiment, l'image des sections immédiatement avec un minimum de temps possible de l'exposition.

Résultats

Mesure de la fonction des cils épendymaire dans le cerveau de souris en direct

La méthode décrite dans ce protocole est utilisé pour surveiller la fonction des cils épendymaire et de la structure dans le tissu frais disséqué à partir du cerveau de la souris ainsi que pour surveiller et étudier cils fréquence de battement. Les étapes suivies pour réaliser une expérience complète sont représentés sur un diagramme schématique (figure 1). Il est fortement recomm...

Discussion

On décrit ici est un protocole de préparation de tissu de cerveau de souris à la fois pour l'imagerie en temps réel, et la microscopie de fluorescence qui fournit une observation attentive rapide et sensible des cils épendymaire dans les ventricules du cerveau. Cette technique ne se limite pas au seul ventricule latéral; il pourrait être utilisé pour observer les franges dans une autre ventricules du cerveau. Cette technique d'imagerie fournit un flux en direct qui ressemble le mouvement de la CSF par ba...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/HIGH GLUCOSE	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-SP
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-2395
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
Fluo-2	TEF Labs	#0200
DMSO
B27	Gibco	17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T7451	clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody	Vector Labs	FI-2000
Cell Culture plate	VWR Vista Vision	30-2041
Cover Slip (18 x 18)	VWR Vista Vision	16004.326
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200S
Cryostat	Leica Biosystems	Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	Nikon TE2000	60X oil
Microscope cover glass 24 x 60 mm2	VWR Vista Vision	16004-312
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
DAPI filter cube	Chroma Technology