Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Özet

Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak, fare beyin ventriküller içinde yer alan hareketli ependim kirpikler dayak bir ex vivo gözlem canlı görüntüleme ile gösterilmiştir. teknik, özel bir siliyer atan frekansının kayıt ve dayak açısı aynı zamanda bunların hücre içi kalsiyum salınım ilerleme hızı özellikleri sağlar.

Özet

Multiciliated ependimal hücreler erişkin beyninde ventrikül sıralanıyor. Anormal işlevi veya ependim kirpikler yapısı çeşitli nörolojik defisitler ile ilişkilidir. hareketli ependim kirpikler tekniğinin ex vivo canlı görüntüleme mevcut birkaç adım takip siliyer dinamikleri ayrıntılı çalışma için izin verir. Bu adımlar şunlardır: farelere karbon dioksid ile ötenazi Toledo Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Üniversitesi protokollerine göre; bir vibratome veya keskin bıçak ile beyin kaldırma ve sagital beyin diseksiyonu ardından kraniektominin ependim kirpikler görüntülenmiştir beyin lateral ventriküller, üzerinden çok ince kesitler elde etmek. % 95 /% 5 O mevcudiyetinde ₂ / _CO2 karışımı, 37 ° C'de Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) / Yüksek glikoz içeren özel bir cam alt plaka beynin dilimlerin Kuluçka canlı doku tutmak esastır sırasındadeney. Kirpikler dayak bir video daha sonra yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak kaydedilir. video sonra siliyer dayak frekansı hesaplamak için kare kare analiz edilir. Bu onların siliyer dayak sıklığı ve açısına göre üç kategoriye veya tipe ependimal hücrelerin farklı sınıflandırma verir. Ayrıca, bu tekniğin ependimal hücrelerin özel hücre içi kalsiyum salınım özelliklerinin yanısıra, kalsiyum salınımlarına farmakolojik ajanların etkisi ve siliyer atan frekans karakterize etmek için yüksek hızlı flüoresan görüntüleme analizi kullanımına izin verir. Buna ek olarak, bu teknik, siliyer yapı ve siliyer protein lokalizasyonu çalışmaları için immünofloresan görüntüleme için uygundur. Bu hastalık teşhis ve fenotip çalışmalarında özellikle önemlidir. Beyin dokusu ölmek başladığında tekniğin ana sınırlama canlı hareketli kirpikler hareketinde azalma atfedilir.

Giriş

Silyum hücre dışı ortama hücre yüzeyinden uzanan duyu mikrotübül tabanlı organellerdir. "9 + 0" ya da "9 + 2" - kendi mikrotübül Kuruluşunuza bağlı olarak, kirpikler iki tip olarak kategorize edilebilir. Fonksiyonel, onların hareketliliği dayanarak, bu hareketli veya non-motil kirpikler ¹ olarak kabul edilebilir. Birincil kirpikler genellikle "9 + 0" non-motil kirpikler belirtmek için kullanılan bir terimdir. Bunlar ('9' ile gösterilir), dokuz paralel çifti mikrotübülleri ve mikrotübüller merkezi çifti ('0' ile gösterilir), merkezi kılıf içinde yoktur. Ancak, embriyo lateraliteyi düzenleyen gibi düğüm kirpikler gibi bazı "9 + 0" kirpikler, ² hareketli vardır. Diğer yandan, hareketli silia mikrotübül çifti, bir ilave merkezi çift dokuz paralel mikrotübül çifti ek olarak karakterize edilmiştir ve motilite kolaylaştırmak için dinein motor protein ile bağlantılı. Buna ek olarak, bazı "9Böyle koku cilia olarak +2 "kirpikler ³ olmayan hareketli vardır. Beyin ventriküller ve omuriliğin merkezi kanal döşeyen hücreler ependimal beyin ventriküller ⁴ boyunca beyin omurilik sıvısı (BOS) itmek hareketli kirpikler ile karakterizedir.

Bu yöntemin genel amacı kirpikler dinamikleri ve yapısal anomaliler hareketli okuyan kolaylaştırmaktır. Beynin sağlığı ve gelişimi ağır beyin ventriküllerin içinde BOS etkin dolaşımı bağlıdır. Örneğin, normal bir BOS akım ve sıvı dengesi normale dayak ve sırayla nöronal hücrelerin yönlü hareketini düzenleyen kritik rol oynayan ve hücre göçü ⁷ kök fonksiyonel ependim kirpikler ^5,6 gerektirir. Böyle anormal ependim kirpikler işlevi veya hidrosefali ile ilişkili anormal BOS akışına yol açabilir yapısı, tıbbi bir durum olduğu b ventrikül BOS anormal birikimi varYağmur. Bu sonuç kafa içi basınç ve baş, konvülziyon, tünel görme ilerici genişleme ve zihinsel engelli ⁸ arttı neden olabilir.

Mevcut yöntemlere göre bu tekniğin avantajları üç farklı ependim hücre tiplerini bildirmek için ilk kez izin olduğunu: Ben, onların eşsiz siliyer dayak sıklığı ve açı yenerek dayanan II ve III. Bu ependimal hücreler beyin ventriküllerinde belli bölgeler içinde lokalize. Ayrıca, yaş ve alkol ve ependim hücre tiplerini veya lokalizasyonu değiştirerek üzerinde silostazolün olarak farmakolojik ajanların etkileri ependimal hücrelerin bu sınıflandırmaya önce mümkün değildi, ispat edilebilir. Silostazol, fosfodiesteraz-3 inhibitörü, AMP cAMP'yi metabolize eden bir enzimdir ve bu, aynı zamanda, hücre içi kalsiyum ⁹ düzenler. Yüksek hızlı floresan görüntüleme analizi kullanılarak eşsiz hücre içi görüntüleme ve niceleme veriyorependim hücrelerin kalsiyum salınımı özellikleri. Örneğin, alkol ve silostazol hem anlamlı sırayla, ependim kirpikler ¹⁰ ile beyin omurilik sıvısı volüm replasmanı bir değişikliğe yol açabilecek ependim siliyer dayak frekansı yanı sıra hücre içi kalsiyum salınımlar özellikleri, değiştirilemez. Özet olarak bu teknik, farklı kalsiyum salınım özellikleri olan ependimal hücrelerinin üç farklı tip ilk kanıt sağlamak için önemli idi.

Aşağıdaki bölümde, prosedürün ayrıntılı bir adım-adım genel doku hazırlanması ve kullanımdan yakından ilgilenerek, sağlanır.

Protokol

Hayvan kullanımı için prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Bakım ve Kullanımı Kılavuzu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu yönergelerine uygun olarak Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır Laboratuvar Hayvanları.

1. Beyin Ekstraksiyon, Kesit ve Doku Hazırlama

1. Derin 5 dakika için _CO2 ile boğularak ile ötenazi yabani-tip fare soyu C57BL / 6 Kurban. Servikal dislokasyon ile ölüm emin olunuz.
2. % 70 etanol ile fare kafasını temizleyin.
3. İlk kafatası açığa çıkarmak için başın üstünden başlayarak, kapalı cilt çekerek steril makas ve forseps kullanarak kraniyektomi.
4. Sonra, kafatası maruz kaldığında, kemik parçası-by-parça soyma arka tarafında başlayan ve ön tarafına doğru hareket ettirerek kafatası çıkarın. Beyin ventriküllerin yok etmek değil dikkatli olun.
5. Tüm beyin toplayın.
6. Penisilin 10,000 ünite / ml ve streptomisin ve önceden ısıtılmış 10,000 ug / ml ihtiva eden% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek glikoz ve% 1 penisilin / streptomisin solüsyonu içeren bir 100 mm Petri kabındaki beyin yerleştirin 37 ° C arasındadır.
7. Keskin bir bıçak ile elle medyan sagital düzlemde beyin dilimleyin ve bir vibratome kullanarak her yarısından itibaren ilk 100-200 mm bölümünü edinin.
8. Önceden ısıtılmış 37 ° C, fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS) çözeltisi ile beyin dokusu durulayın.
9. Hemen, DMEM / Yüksek Glikoz ortamı 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış beyin bölümü yerleştirin.

2. Canlı Görüntüleme Yapılandırma ve Kurulum

1. DMEM / Yüksek Glikoz ortamı 1 ml içeren 30 mm cam alt kültür tabaklarında beyin dokusu kesitleri yerleştirin. % 95 /% 5 _O2 / _CO2 içeriği 37 ° C, (Şekil 1 'e mikroskop Kapalı bir odanın ortam ayarlama ).
2. 60X objektif immersiyon yağı lens kullanarak, ilk 60X objektif lens üzerinde bir yağ damla yerleştirme ve düzenli DIC ile hücrelerin odaklanarak ependimal hücre / kirpikler görüntüleri toplamak ışık iletti.
3. Silier dayak alanında kabarcık hareketinin bir tür oluşturmak Sonra, hareketli ependim kirpikler konumu için bir rehber olarak DMEM kabarcık hareket yönünü takip edin. DIC filtresi kullanılarak beynin lateral ventrikül içinde hareketli kirpikler ile sağlıklı hücreleri içeren bir alan seçin. Ependim kirpikler bulunduktan sonra, ışık ayarı ve tatmin edici bir görüntü elde etmek odaklanır.
4. Metamorph görüntüleme yazılımı kullanarak belirli bir amaç doğrultusunda canlı görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Mevcut gösteri, objektif 60X ve 5-10 msn maruz kalma süresi ile birlikte, 1 x 1 kamera binning seti ile yirmidört-bit görüntüleri kazanır.
5. Asgari exp olması için optimal düzeye mikroskop diyafram açarak DIC görüntüleri toplayınosure zaman. Gecikmeden hızlı ve anında görüntü alımını sağlamak için kameraya canlı görüntüleri akışı gözlemleyin. Yeterli görüntü kontrastını elde etmek için en az pozlama süreleri gereksinimi dayalı kirpikler dayak hızını hesaplayınız.

3. Veri Görselleştirme ve Analiz

1. 1 dakika içinde dayak sayısını sayarak kirpikler dayak sayısını hesaplayın. Video hızını azaltarak ve hücre sayacı veya benzeri bir alet kullanarak vuruş sayısını sayarak bunu yapın.
2. Dayak sıklığını hesaplamak için, video sn numarasını almak için edinilen kare ya da time-lapse görüntü sayısına göre kaydedilen hangi pozlama süresini çarpın. (Örnek: pozlama süresi 5 msn 200 kare = 1,000 milisaniye veya 1 sn).
3. Tek saniyede yenerek sayısı olarak ifade edilir frekansı elde etmek için bir saniye içinde dayak sayısını hesaplayın. Tek ikinci kez Inter, üzerinde kirpikler dayak sayısına bölünmesiyle yapınval (Örnek: kirpikler = 1 sn 5 msn yani 5 msn x 200 kare pozlama süresi kaydedilen 200 kare video 50 kez yendi, şimdi 1 sn = 50 Hz ile 50 atım bölmek).
4. Her iki güç ve kurtarma vuruş sırasında ependim kirpikler tarafından alınan yolu değerlendirerek siliyer dayak açısını hesaplayın. Küçük değişikliklerle ^11, daha önce tarif edilen yönteme uygun olarak, bu gerçekleştirme. Bireysel kirpikler kesin hareketi tam yendi döngüsü sırasında görülmektedir.
5. Monitörün üzerine yerleştirilen bir asetat sayfasında, ependimal kenarı ve güç inme başlangıcında kirpikler orta hat pozisyonuna yoluyla dikey bir çizgi boyunca yatay bir çizgi çizin.
6. Güç inme sırasında ileri hareket ederken kare cilium çerçevenin kesin konumunu çiziniz. Benzer bir tarzda, geri stroku esnasında Sil hareketi çizilir.
7. T sırasında orta hattan cilium maksimum sapma gelen siliyer dayak açısını hesaplamakgüç inme yanı sıra kurtarma inme o.

4. Kalsiyum sinyal kayıt

1. Beyin dilimleme sonra, kısa bir süre için 1 x PBS veya Dulbecco PBS (pH 7.0), beyin dilim yıkayın. Floresanlık sönmesini önlemek için ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, taze Fluo-2 hazırlayın.
2. , Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde Fluo-2 çözeltisi, 1 mM stok çözelti hazırlayın karıştırmak ve Fluo-2 homojen DMSO içinde eritildi sağlamak için, en az 5 dakika boyunca çözeltiden vorteks.
3. % 2 B27 ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek Glikoz 500 ml Fluo-2 stok solüsyonu ile seyreltilir, 20 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar 37 ° C'ye kadar ön-ısıtılır.
   NOT: B-27 vitamini, antioksidan kokteyli ve hipokampus ve diğer merkezi sinir sistemi nöronlarının kısa veya uzun vadeli canlılığı desteklemek için kullanılan insülin içeren optimize edilmiş serum serbest ekidir.
4. Hemen bir cam alt plaka 37 ° C'de 30 dakika süre ile 20 mg / ml Fluo-2 beyin dilim inkübe edin.
5. Kalsiyum fluorofor Flu-2 optimal yükleme konsantrasyonunu belirlemek için ve ATP ile kalsiyum boya hücre toksisite, meydan hücreleri önlemek için, ve ATP cevaben zaman ders ve kalsiyum sinyallerinin tepe büyüklüğünü belirleyerek hücre canlılığı kontrol ediniz.
6. 488 nm ve 515 nm, sırasıyla, (Film 2) eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile, 1 saniye (sn 200 kare) bir en az 5 msn bir yakalama oranında kalsiyum salınım için video kaydedin.
7. Otofloresans veya hareket eserler arasından Flu-2 kalsiyum sinyalini ayırt etmek, 515 nm yayılan şiddetleri ayrı izlenir emin olun.
   Not: Flu-2 hücre içi kalsiyum ölçmek için uygun bir kalsiyum fluoremetric değildir. Bununla birlikte, örneğin kalsiyum salınımları hızlı kalsiyum değişiklikleri tespit etmek için mükemmel bir dinamik kalsiyum boyadır. Daha doğru bir kalsiyum ölçümü için, Fura-2 tavsiye edilir. Bununla birlikte, Fura-2'nin dinamik değişimler de rasyometrik ile sınırlıdırboya doğası.
8. Tam serbest hücre içi kalsiyum değerlerini hesaplamak için üretici tarafından sağlanan formüller izleyin. Örnek [Ca ^{2 +]} = _Kd × (R - R _dk) / (R _max - R). _Kd serbest kalsiyum boyanın ayrışma sabiti olduğu durumlarda, R, 488 ölçülen floresans olduğu, ve R 've R _{max dakika} minimum ve maksimum iyon konsantrasyonu ¹² floresan oranlarıdır.

5. İmmünofloresan Mikroskopi

1. % 4 paraformaldehit (PFA) ile 10 dakika süre ile,% 2 sukroz ihtiva eden fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile beyin bölümleri sabitleyin. Seçenek olarak ise, bir kriyostat kullanarak 50 mm bölüme% 4 daha sonra PFA ve bölüm ile bütün beyin sabitleyin.
2. 5 dakika her zaman için 1x PBS ile dokuya üç kez yıkayın.
3. Bir soluti beyin dilim inkübe5 dakika boyunca 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X ile, daha sonra 5 dakika, her seferinde 1 x PBS ile üç kez yıkayın.
4. Gece boyunca 4 ° C'de oda sıcaklığında (RT) ya da bir saat boyunca 1 x PBS içinde% 10 FBS içinde 5000: fare primer antikor ile beyin dilim inkübe 1 bir seyreltmede kullanılan a-tubulin, antiacetylated.
5. 5 dakika her zaman için 1x PBS ile dokuya üç kez yıkayın.
6. Sekonder antikor beyin dilim inkübe 1 bir seyreltme floresein anti-fare IgG: oda sıcaklığında 1 saat süre ile 1 x PBS çözeltisi içinde 500,% 10 FBS.
7. 5 dakika çekirdeği (veya DNA) ¹³ leke 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bölüm counterstain bir floresan mikroskobu altında gözlem, önce. Mümkün olan minimum pozlama süresi ile bölümler hemen photobleaching, görüntüyü en aza indirmek için.

Sonuçlar

Canlı fare beyninde ependim kirpikler fonksiyonu Ölçme

Bu protokol açıklanan yöntem fare beyninin yanı sıra izleme ve kirpikler dayak frekansı incelemek için disseke taze dokuda ependim kirpikler işlev ve yapısını izlemek için kullanılır. Tam bir deney gerçekleştirmek için, ardından adım şematik bir akış şeması (Şekil 1) 'de tasvir edilmektedir. Oldukça deneme mümkün olduğunca aktif hareketli kirpikler tutmak için kısa bir zaman dilimi i...

Tartışmalar

Canlı görüntüleme ve beyin ventriküller içinde ependim kirpikler hızlı ve duyarlı bir yakın gözlem sağlayan floresan mikroskopi hem fare beyin dokusu hazırlanması için bir protokol burada açıklanmıştır. Bu teknik sadece lateral ventrikül ile sınırlı değildir; diğer beyin ventriküllerde kirpikler gözlemlemek için yararlanılabilir. Bu görüntüleme tekniği bir ex vivo ortamda siliyer dayak ile BOS hareketine benzer bir canlı akışı sağlar. Ayrıca, kirpikler yönlü hareketin a...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/HIGH GLUCOSE	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-SP
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-2395
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
Fluo-2	TEF Labs	#0200
DMSO
B27	Gibco	17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T7451	clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody	Vector Labs	FI-2000
Cell Culture plate	VWR Vista Vision	30-2041
Cover Slip (18 x 18)	VWR Vista Vision	16004.326
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200S
Cryostat	Leica Biosystems	Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	Nikon TE2000	60X oil
Microscope cover glass 24 x 60 mm2	VWR Vista Vision	16004-312
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
DAPI filter cube	Chroma Technology