Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón

Resumen

El uso de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía de alta resolución, una observación ex vivo de la paliza de los cilios ependymal móviles ubicada dentro de los ventrículos cerebrales de ratones se demostró por imágenes en vivo. La técnica permite una grabación de la frecuencia de latido ciliar único y ángulo superando así como sus propiedades de estimulación de oscilación de calcio intracelular.

Resumen

Células ependimarias Multiciliated alinean los ventrículos en el cerebro adulto. Función o estructura de los cilios ependymal anormal se asocia con diversos déficits neurológicos. La corriente de imágenes ex vivo en directo de la técnica de los cilios ependymal móviles permite un estudio detallado de la dinámica ciliares siguiendo varios pasos. Estos pasos incluyen: ratones eutanasia con dióxido de carbono de acuerdo con los protocolos de la Universidad de Animal Care Institucional de Toledo y el empleo Comisión (IACUC); craniectomía seguido de la eliminación del cerebro y la disección del cerebro sagital con un vibratome o cuchilla afilada para obtener secciones muy finas a través de los ventrículos laterales del cerebro, donde los cilios ependymal puede ser visualizado. La incubación de las rebanadas del cerebro en un plato con fondo de cristal personalizado que contiene medio de Eagle modificado (DMEM) / alta glucosa de Dulbecco a 37 ° C en presencia de 95% / 5% O ₂ / CO mezcla ₂ es esencial para mantener vivo el tejido duranteel experimento. Un video de la paliza cilios se registra a continuación, utilizando una alta resolución de microscopio de contraste de interferencia diferencial. El vídeo se analiza a continuación, cuadro por cuadro para calcular la frecuencia de latido ciliar. Esto permite distinta clasificación de las células ependimarias en tres categorías o tipos en función de su frecuencia de latido ciliar y el ángulo. Además, esta técnica permite el uso de análisis de imágenes de fluorescencia de alta velocidad para caracterizar las propiedades únicas intracelulares de oscilación de calcio de células ependimarias, así como el efecto de agentes farmacológicos en las oscilaciones de calcio y la frecuencia de latido ciliar. Además, esta técnica es adecuada para formación de imágenes de inmunofluorescencia para la estructura ciliar y ciliar proteína de localización de estudios. Esto es particularmente importante en los estudios de diagnóstico de enfermedades y fenotipo. La principal limitación de la técnica se atribuye a la disminución en el movimiento cilios móviles en vivo como el tejido cerebral comienza a morir.

Introducción

Los cilios son orgánulos basado-microtúbulos sensoriales que se extienden desde la superficie de la célula con el medio ambiente extracelular. Dependiendo de su nivel de organización de los microtúbulos, los cilios se pueden clasificar en dos tipos - "9 + 0" o "9 + 2". Funcionalmente, en base a su motilidad, éstos pueden ser clasificados como móviles o no móviles cilios ^1. Cilios primaria es un término comúnmente utilizado para referirse a "9 + 0" cilios no móviles. Estos tienen nueve microtúbulos doblete paralelas (denotados por '9') y un par central de microtúbulos está ausente dentro de la vaina central (denotado por '0'). Sin embargo, algunos "9 + 0" cilios, como cilios nodales, que regulan la lateralidad embrionaria son móviles ^2. Por otro lado, cilios móviles se caracterizan, además de los nueve dobletes de microtúbulos paralelos, por un par central adicional de dobletes de microtúbulos y se asocia con proteínas motoras dineína para facilitar la motilidad. Además, algunos "92 "cilios como cilios olfativos son no móviles ^3. Las células ependimarias que recubren los ventrículos cerebrales y el canal central de la médula espinal se caracterizan por cilios móviles que propulsar el líquido cefalorraquídeo (LCR) a lo largo de los ventrículos cerebrales ^4.

El objetivo general de este método es el de facilitar el estudio de la dinámica de los cilios móviles y anormalidades estructurales. La salud y el desarrollo del cerebro en gran medida dependen de la circulación eficiente de LCR dentro de los ventrículos cerebrales. Por ejemplo, el flujo de LCR normal y el equilibrio de líquidos requieren latido normal y cilios ependymal funcional ^5,6, que a su vez juega un papel crítico en la regulación del movimiento direccional de las células neuronales y la migración de células madre ^7. Como tal, la función de los cilios ependymal anormal o estructura puede conducir a flujo del LCR anormal, que se asocia con la hidrocefalia, una condición médica en la que hay una acumulación anormal de LCR en los ventrículos del blluvia. En consecuencia, esto puede causar un aumento de la presión intracraneal y la ampliación progresiva de la cabeza, convulsiones, visión de túnel, y la discapacidad mental ^8.

Las ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes es que se permitió por primera vez a reportar tres distintos tipos de células ependimarias: I, II, y III, en función de su única frecuencia de golpeo ciliar y golpeando ángulo. Estas células ependimarias se localizan dentro de ciertas regiones de los ventrículos cerebrales. Además, los efectos de la edad y agentes farmacológicos tales como alcohol y cilostazol en la modificación de los tipos de células ependimarias o sus localizaciones se pueden demostrar, que no era posible antes de esta clasificación de células ependimarias. Cilostazol es un inhibidor de la fosfodiesterasa-3, una enzima que metaboliza cAMP a AMP y también regula el calcio intracelular ^9. Utilizando el análisis de imágenes de fluorescencia de alta velocidad permite obtener imágenes y cuantificación de la intracelular únicopropiedades de oscilación de calcio de las células ependimarias. Por ejemplo, tanto el alcohol y el cilostazol alteraron significativamente la frecuencia de golpeo ciliar ependimarias, así como las oscilaciones de calcio intracelulares propiedades, que a su vez, podría conducir a un cambio en la reposición de volumen de líquido cefalorraquídeo por cilios ependymal ^10. En resumen, esta técnica fue clave para proporcionar la primera evidencia de tres tipos distintos de células ependimarias con diferentes propiedades de oscilación de calcio.

En la siguiente sección, se proporciona una visión detallada paso a paso del procedimiento, prestando especial atención a la preparación y manipulación de tejidos.

Protocolo

Los procedimientos para el uso de los animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Toledo, de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de los Institutos Nacionales de Salud y la Guía para el Cuidado y Uso de animales de laboratorio.

1. Extracción del cerebro, Seccionamiento y Tejidos Preparación

1. Sacrificio de tipo salvaje cepa de ratón C57BL / 6 por profundamente eutanasia con _CO2 asfixia durante 5 min. Asegurar la muerte por dislocación cervical.
2. Limpie el cabezal de ratón con etanol al 70%.
3. Realizar craniectomía usando tijeras y pinzas estériles por primera tira de la piel de, a partir de la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo.
4. Entonces, cuando se expone el cráneo, retire el cráneo por el pelado de la pieza por pieza de hueso, comenzando desde el lado posterior y en movimiento hacia el lado anterior. Tenga cuidado de no destruir los ventrículos cerebrales.
5. Recoge todo el cerebro.
6. Coloque el cerebro en un plato de 100 mm de Petri que contiene DMEM / de alta glucosa suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y solución de penicilina / estreptomicina 1% que contiene 10.000 unidades / ml de penicilina y 10.000 g / ml de estreptomicina y pre-calentado a 37 ° C.
7. Cortar el cerebro en el plano sagital mediano a mano con una cuchilla afilada, y obtener la primera sección de 100-200 mm de cada medio usando un vibratome.
8. Enjuague el tejido cerebral con C salina tamponada con fosfato (PBS 1x) solución de 37 ° pre-calentado.
9. Coloque inmediatamente la sección del cerebro en DMEM / media-alta de la glucosa pre-calentado a 37 ° C.

2. Vivo Configuración de imagen y configuración

1. Coloque las secciones de tejidos cerebrales en 30 mm placas de cultivo con fondo de cristal que contienen 1 ml de DMEM / medios-altos de glucosa. Ajustar entorno de cámara cerrada del microscopio a 37 ° C, 95% / 5% O ₂ / CO contenido de ₂ (Figura 1 ).
2. El uso de un lente objetivo de inmersión en aceite 60X, recoger las células ependimarias / imágenes cilios colocando primero una gota de aceite en la lente objetivo de 60X y se centra en las células con DIC regularmente transmiten luz.
3. A continuación, siga la dirección del movimiento de la burbuja DMEM como una guía para la ubicación de los cilios ependymal móviles como golpes ciliares crear una especie de movimiento de la burbuja en la zona. Elija un área que contiene las células sanas con cilios móviles en el ventrículo lateral del cerebro utilizando el filtro DIC. Una vez que los cilios ependymal se encuentran, ajustar la luz y el enfoque para obtener una imagen satisfactoria.
4. Establezca los parámetros de imagen en vivo de acuerdo con un propósito específico utilizando el software de imágenes Metamorph. En la presente manifestación, adquirir veinte imágenes de cuatro bits con el conjunto de intervalos cámara a 1 x 1 en combinación con 60X objetiva y tiempo de exposición 5/10 ms.
5. Recoge las imágenes DIC abriendo la abertura microscopio para un nivel óptimo con el fin de tener un mínimo de exptiempo osure. Observar las imágenes en directo corriente a la cámara para proporcionar la adquisición de imágenes rápido e inmediato sin demora. Calcular la velocidad de latido cilios basado en el requisito de los tiempos de exposición mínimos para obtener suficiente contraste de la imagen.

3. Visualización y análisis de datos

1. Calcular el número de golpes cilios contando el número de golpes en 1 min. Para ello, la disminución de la velocidad del vídeo y contando el número de pulsaciones utilizando un contador de células o una herramienta similar.
2. Para calcular la frecuencia de las palizas, multiplique el tiempo de exposición a la que el vídeo se graba por el número de los marcos o imágenes en tiempo lapso adquiridos para obtener el número de segundos. (Ejemplo: tiempo de exposición 5 ms 200 marcos = 1000 ms o 1 segundo).
3. Calcular el número de golpes en un segundo para obtener la frecuencia que se expresa como el número de golpes por uno sec. Para ello, dividiendo el número de golpes cilios más de un segundo entre el tiempoval (Ejemplo: cilios late 50 veces en un video de 200 marcos grabado en tiempo de exposición de 5 ms es decir 5 ms x 200 fotogramas = 1 seg; ahora dividir 50 latidos por 1 seg = 50 Hz).
4. Calcular el ángulo de golpeo ciliar mediante la evaluación del camino recorrido por los cilios ependymal durante tanto las carreras de trabajo y recuperación. Realice esto de acuerdo con un método descrito previamente, con modificaciones menores ^11. Se observa el movimiento preciso de los cilios individuo durante el ciclo de latido completo.
5. En una hoja de acetato colocado sobre el monitor, dibujar una línea horizontal a lo largo del borde ependimarias y una línea vertical a través de la posición de la línea media de los cilios en el inicio de la carrera de potencia.
6. Trazar la posición precisa de la trama cilio por trama a medida que se mueve hacia adelante durante la carrera de potencia. De una manera similar, trazar el movimiento de los cilios durante la carrera de recuperación.
7. Calcular el ángulo de golpeo ciliar de la desviación máxima del cilio de la línea media durante tél carrera de potencia, así como la carrera de recuperación.

4. El calcio de grabación de la señal

1. Después de cortar el cerebro, enjuagar brevemente el corte de cerebro con 1x PBS o PBS de Dulbecco (pH 7,0). Preparar fresco Fluo-2 para evitar la extinción de la fluorescencia y para obtener una buena relación señal-ruido.
2. Preparar 1 mM solución madre de Fluo-2 solución en dimetilsulfóxido (DMSO), mezclar y agitar la solución durante al menos 5 min para asegurar que Fluo-2 se disuelve homogéneamente en DMSO.
3. Diluir la solución madre de Fluo-2 en 500 ml de DMEM / de alta glucosa suplementado con 2% B27 pre-calentado a 37 ° C a una concentración final de 20 mg / ml.
   NOTA: B-27 es un suplemento libre de suero optimizado que contiene vitamina A, cóctel antioxidante y la insulina utilizada para apoyar la viabilidad a corto o largo plazo del hipocampo y otras neuronas del SNC.
4. Incubar inmediatamente el corte de cerebro con 20 mg / ml Fluo-2 durante 30 minutos a 37 ° C en un plato con fondo de cristal.
5. Para determinar la concentración de carga óptima de fluoróforo calcio Fluo-2 y para evitar la toxicidad celular tinte de calcio, las células de desafío con el ATP, y comprobar la viabilidad celular mediante la determinación de la evolución en el tiempo y la magnitud máxima de señales de calcio en respuesta a ATP.
6. Grabar el vídeo para la oscilación de calcio a una velocidad de captura de 5 mseg durante un mínimo de 1 seg (200 fotogramas por segundo), con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 515 nm, respectivamente (Película 2).
7. Para distinguir la señal de calcio Fluo-2 de autofluorescencia o artefactos de movimiento, asegúrese de que las intensidades emitidas a 515 nm se controla por separado.
   NOTA: Fluo-2 no es el fluoremetric calcio adecuado para cuantificar el calcio intracelular. Sin embargo, es un excelente tinte de calcio dinámica para detectar cambios rápidos de calcio, tales como oscilaciones de calcio. Para la cuantificación de calcio más precisa, se recomienda Fura-2. Sin embargo, los cambios dinámicos de Fura-2 están limitados por su radiométricala naturaleza del colorante.
8. Siga las fórmulas proporcionadas por el fabricante para calcular los valores exactos de calcio intracelular libres. Ejemplo [Ca ^{2 +]} = _Kd × (R - R _min) / (R _max - R). Donde K _d es la constante de disociación del colorante desde el calcio liberado, R es la fluorescencia medida a 488, y R y R _{min max} son las relaciones de fluorescencia a concentración máxima de iones mínimo y ^12.

5. Inmunofluorescencia Microscopía

1. Fijar las secciones de cerebro con solución salina tamponada con fosfato que contiene 4% de paraformaldehído (PFA) y 2% de sacarosa durante 10 min. Alternativamente, arreglar todo el cerebro con 4% PFA sección y luego en 50 secciones mm utilizando un criostato.
2. Lavar el tejido tres veces con 1x PBS durante 5 min cada vez.
3. Incubar la rebanada cerebro con un solutien 0,1% de Triton-X en 1X PBS durante 5 min, luego enjuagar tres veces con 1x PBS durante 5 min cada vez.
4. Incubar los cortes de cerebro con el anticuerpo primario de ratón, antiacetylated a-tubulina, utilizado a una dilución de 1: 5000 en 10% de FBS en 1x PBS durante una hora a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 4 ° C.
5. Lavar el tejido tres veces con 1x PBS durante 5 min cada vez.
6. Incubar la rebanada del cerebro en anticuerpo secundario, IgG anti-ratón fluoresceína a una dilución de 1: 500 en 10% de FBS en PBS 1x solución durante 1 hora a RT.
7. Antes de la observación bajo un microscopio fluorescente, contratinción la sección con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min para teñir el núcleo (o ADN) ^13. Para minimizar fotoblanqueo, la imagen de las secciones de inmediato con el tiempo de exposición mínimo posible.

Resultados

Medición de la función cilios ependymal en cerebro de ratón vivo

El método descrito en este protocolo se utiliza para controlar la función cilios ependymal y estructura en el tejido fresco diseccionado desde el cerebro del ratón, así como para vigilar y estudiar los cilios frecuencia paliza. Los pasos seguidos para llevar a cabo un experimento completo se representan en un diagrama de flujo esquemático (Figura 1). Es muy recomendable que el experimento se lleva a cab...

Discusión

Describe aquí es un protocolo para la preparación de tejido cerebral de ratón tanto para formación de imágenes en vivo y microscopía de fluorescencia que proporciona una rápida y sensible estrecha observación de los cilios ependymal dentro de los ventrículos cerebrales. Esta técnica no se limita a sólo el ventrículo lateral; que podría ser utilizado para observar los cilios en otros ventrículos cerebrales. Esta técnica de imagen proporciona una transmisión en vivo que se asemeja el movimiento del LCR por...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/HIGH GLUCOSE	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-SP
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-2395
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
Fluo-2	TEF Labs	#0200
DMSO
B27	Gibco	17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T7451	clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody	Vector Labs	FI-2000
Cell Culture plate	VWR Vista Vision	30-2041
Cover Slip (18 x 18)	VWR Vista Vision	16004.326
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200S
Cryostat	Leica Biosystems	Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	Nikon TE2000	60X oil
Microscope cover glass 24 x 60 mm2	VWR Vista Vision	16004-312
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
DAPI filter cube	Chroma Technology